單倍體胚胎干細(xì)胞研究概述

黃宇航 陳伶莉 胡雪峰

(福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 福州 350108)

單倍體胚胎干細(xì)胞(haploid embryonic stem cells， haESCs)是指只含有一套染色體，但具有類似于正常干細(xì)胞分裂與分化能力的細(xì)胞群。根據(jù)誘發(fā)方式不同，單倍體胚胎干細(xì)胞主要分為兩類： 孤雌單倍體胚胎干細(xì)胞(parthenogenetic haploid embryonic stem cells， PG-haESCs)和孤雄單倍體胚胎干細(xì)胞(androgenetic haploid embryonic stem cells， AG-haESCs)。近年來，單倍體胚胎干細(xì)胞研究領(lǐng)域取得了一系列突破性成果。本文對單倍體胚胎干細(xì)胞的研究進(jìn)展進(jìn)行概述。

1 單倍體胚胎干細(xì)胞及其研究意義

哺乳動物的所有體細(xì)胞正常情況下均為二倍體，分別來自父方和母方，當(dāng)外界因素影響導(dǎo)致基因突變時(shí)，二倍體的基因組可減小突變帶來的不利影響；雙親兩套染色體的選擇性表達(dá)，使后代表現(xiàn)型呈現(xiàn)出多樣性，有利于個(gè)體進(jìn)化。然而，不同于二倍體細(xì)胞，單倍體細(xì)胞只有一套染色體，這大大降低了基因組的復(fù)雜程度，使其成為遺傳學(xué)和基因組學(xué)研究的重要工具。在哺乳動物體內(nèi)，有兩類細(xì)胞處于單倍體狀態(tài)，它們分別是減數(shù)分裂后的生殖細(xì)胞和某些癌細(xì)胞。生殖細(xì)胞功能高度特化，且難以在體外進(jìn)行長期培養(yǎng)、擴(kuò)增，也很難對其進(jìn)行基因操作與篩選。從癌細(xì)胞中分離出的接近單倍體的異倍體細(xì)胞系雖然能夠穩(wěn)定培養(yǎng)，但此類細(xì)胞系的非整倍體性限制了其在基因研究及疾病治療方面的應(yīng)用。

近年來，隨著小鼠單倍體胚胎干細(xì)胞系的成功建立，單倍體胚胎干細(xì)胞的基因功能研究已經(jīng)從細(xì)胞水平提升到了機(jī)體水平。盡管如此，單倍體細(xì)胞自發(fā)二倍化[1]、哺乳動物基因印記狀態(tài)的維持[1～4]、實(shí)驗(yàn)動物遺傳背景的選擇[3]以及物種差異的影響，都給單倍體胚胎干細(xì)胞系的建立與進(jìn)一步的研究帶來了巨大的挑戰(zhàn)。

2 單倍體胚胎干細(xì)胞系的建立

植物單倍體的研究始于1972年，Gupta和Carlson首次建立了煙草單倍體細(xì)胞系。之后，單倍體細(xì)胞系在不同種類的高等植物中陸續(xù)建立。然而，動物單倍體細(xì)胞系的建立則顯得困難重重。2009年，Yi等[5]成功建立青鱔魚穩(wěn)定的單倍體胚胎干細(xì)胞系，并將該單倍體胚胎干細(xì)胞的細(xì)胞核移植到正常未受精的卵細(xì)胞中，通過生殖系嵌合得到半克隆后代。這里所提到的半克隆后代指的是由一方單倍體源性基因和另一方單倍體源性基因相互結(jié)合形成的、擁有正常染色體數(shù)的、胚胎發(fā)育成的后代。哺乳動物單倍體胚胎干細(xì)胞在培養(yǎng)過程中會出現(xiàn)自發(fā)的二倍體化現(xiàn)象，再加上受單倍體細(xì)胞分離技術(shù)的制約，哺乳動物單倍體胚胎干細(xì)胞系的建立直到2011年才有所突破[6，7]，這一成果將單倍體胚胎干細(xì)胞的研究推向新的高度。

2.1 孤雌單倍體胚胎干細(xì)胞系的建立 建立孤雌單倍體胚胎干細(xì)胞系的關(guān)鍵在于未受精的卵母細(xì)胞如何在體外被“激活”產(chǎn)生“干細(xì)胞特性”。研究發(fā)現(xiàn)，可以通過物理(電脈沖)和化學(xué)方法(乙醇、細(xì)胞松弛素、離子霉素等)或兩種方法的交互應(yīng)用模擬受精時(shí)卵母細(xì)胞內(nèi)的鈣震蕩，從而實(shí)現(xiàn)未受精卵母細(xì)胞的激活并完成減數(shù)分裂，獲得孤雌囊胚。隨后，用化學(xué)免疫法去除孤雌囊胚的滋養(yǎng)層得到內(nèi)細(xì)胞，將其接種在以γ射線或絲裂霉素C處理的飼養(yǎng)層上，用干細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)[6，7]。傳代過程中，將干細(xì)胞團(tuán)塊用消化酶打散成單個(gè)細(xì)胞后染色，并定期分選富集，從而最終建立起孤雌單倍體胚胎干細(xì)胞系。

2011年，英國科學(xué)家Leeb與Wutz[6]和奧地利科學(xué)家Elling等[7]采用流式細(xì)胞分選技術(shù)，成功地從小鼠孤雌發(fā)育的單倍體胚胎中建立了小鼠孤雌單倍體胚胎干細(xì)胞系。如今，單倍體胚胎干細(xì)胞的研究已經(jīng)推廣到人類。2016年，Sagi等[8]成功建立了擁有干細(xì)胞典型特征的人單倍體胚胎干細(xì)胞系。Zhong等[9]也通過顯微操作去除人受精卵中的雄原核的方法，建立了孤雌胚胎，高效得到了兩個(gè)人單倍體胚胎干細(xì)胞系。

2.2 孤雄單倍體胚胎干細(xì)胞系的建立 孤雄單倍體胚胎干細(xì)胞的獲得較復(fù)雜，其與孤雌單倍體胚胎干細(xì)胞的主要區(qū)別在于： 進(jìn)行激活之前還需先建立帶有雄性基因組的“卵細(xì)胞”，主要通過向去核的卵母細(xì)胞中注入成熟精子頭部和除去受精卵中雌原核這兩種方法[3]。

2012年，Li[2]和Yang[3]的研究團(tuán)隊(duì)利用這兩種方法分別建立了小鼠孤雄單倍體胚胎干細(xì)胞系。研究證明，這類孤雄單倍體胚胎干細(xì)胞保留了精子攜帶的父源印記，能夠替代精子與卵細(xì)胞，形成與受精卵相似的二倍體胚胎。2014年，Li[10]的研究團(tuán)隊(duì)再次宣布成功建立了大鼠孤雄單倍體胚胎干細(xì)胞系。

3 單倍體胚胎干細(xì)胞的分化潛能

3.1 孤雌單倍體胚胎干細(xì)胞的分化潛能 在培養(yǎng)過程中，科學(xué)家已經(jīng)發(fā)現(xiàn)小鼠孤雌單倍體胚胎干細(xì)胞可以產(chǎn)生正常形態(tài)的胚狀體并具有多向分化能力，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)了其關(guān)鍵的多能標(biāo)記基因的表達(dá)[6，7，11]。令人驚訝的是，后續(xù)隨著人類單倍體胚胎干細(xì)胞系的建立，已有研究表明，與小鼠單倍體胚胎干細(xì)胞相比，人類單倍體胚胎干細(xì)胞更容易分化成所有三胚層，且仍能保持單倍性[8，9，12]。

3.2 孤雄單倍體胚胎干細(xì)胞的分化潛能 Yang[3]等通過類似的方式證明了孤雄單倍體胚胎干細(xì)胞具有生殖分化能力，且在E12.5d的嵌合胚生殖嵴中檢測到了孤雄單倍體胚胎干細(xì)胞的存在。然而，在實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，相較于孤雌單倍體胚胎干細(xì)胞，孤雄單倍體胚胎干細(xì)胞分裂過程中更容易發(fā)生二倍化。

4 單倍體胚胎干細(xì)胞的遺傳與表觀遺傳學(xué)特性

4.1 遺傳學(xué)特性 通過流式細(xì)胞分析單倍體胚胎干細(xì)胞系中DNA的含量，發(fā)現(xiàn)無論是孤雌還是孤雄單倍體胚胎干細(xì)胞系，它們在有絲分裂G1期都含有1n倍的染色體，而在有絲分裂G2期則變?yōu)?n倍。值得注意的是，在孤雄單倍體胚胎干細(xì)胞系中的性染色體均只含一條X染色體，推測可能是由于Y染色體缺乏部分基因序列，導(dǎo)致僅攜帶Y染色體的孤雄單倍體胚胎干細(xì)胞發(fā)育異常，難以存活。2012年，Li[3]的研究團(tuán)隊(duì)利用孤雄單倍體胚胎干細(xì)胞代替精子與卵細(xì)胞完成“受精”作用，進(jìn)而獲得存活且可育的半克隆小鼠后代，同時(shí)發(fā)現(xiàn)這些能夠成功存活的半克隆小鼠都是雌性。

4.2 表觀遺傳學(xué)特性 哺乳動物發(fā)展形成了基因組印記調(diào)控，所以哺乳動物單倍體胚胎干細(xì)胞的印記模式是其最重要的表觀遺傳學(xué)特性。基因組印記是指某個(gè)基因的等位基因根據(jù)親本來源不同而有不同的表達(dá)，分為母源印記和父源印記，所以對應(yīng)的單倍體胚胎干細(xì)胞分為孤雄單倍體胚胎干細(xì)胞和孤雌單倍體胚胎干細(xì)胞，其中主要的父源和母源印記基因分別是母系表達(dá)的印記基因(imprinted maternally expressed transcript，H19)和胰島素樣生長因子2(insulin like growth factor 2)。正常的基因組印記是哺乳動物發(fā)育的基本條件，但在體外培養(yǎng)單倍體胚胎干細(xì)胞的過程中基因組的印記狀態(tài)可能會發(fā)生改變，從而影響胚胎外膜和滋養(yǎng)層的正常發(fā)育，導(dǎo)致成活率降低，研究人員推測這可能與基因印記非甲基化有關(guān)[13]?；蛴∮浀姆肿訖C(jī)制尚未完全明確，目前大多認(rèn)為是DNA甲基化，甲基化通常抑制基因的表達(dá)，且富含CpG的差異性甲基化區(qū)域(differential methylation region， DMR)就是印記的修飾位點(diǎn)[14]。已經(jīng)有許多研究表明，通過基因敲除的方式能夠解決基因印記非甲基化的問題，并提高半克隆小鼠的成活率。

2004年，Kono等[11]利用H19和H19DMR完全敲除的non-growth卵，成功得到了孤雌來源的成年動物。隨后又證實(shí)，如果進(jìn)一步敲除小鼠12號染色體上的基因間區(qū)的差異甲基化區(qū)域(intergenic differentially methylated region， IGDMR)，能夠?qū)⒐麓菩∈蟮陌l(fā)育效率提高30%。Zhong等[15]也嘗試?yán)靡?guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)序列/核酸內(nèi)切酶9(CRISPR-Cas9)技術(shù)制備H19DMR和IGDMR的雙敲孤雌胚胎干細(xì)胞，并注入第二次減數(shù)分裂中期的卵母細(xì)胞，同樣也較高效地獲得了健康的半克隆小鼠。2012年，Zhong等[4]利用H19DMR和IGDMR的雙敲除孤雄單倍體胚胎干細(xì)胞系，使產(chǎn)生健康半克隆小鼠的效率達(dá)到了22.3%，較之前Yang等[1]的研究結(jié)果提高了10倍。

5 單倍體胚胎干細(xì)胞的應(yīng)用

單倍體胚胎干細(xì)胞在分子水平有著比較大的應(yīng)用價(jià)值，能夠廣泛用于正向和反向遺傳學(xué)研究，將CRISPR-Cas9技術(shù)與單倍體胚胎干細(xì)胞系的建立結(jié)合，就可以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的基因編輯，從而建立單倍體細(xì)胞突變文庫。在細(xì)胞水平，單倍體胚胎干細(xì)胞的基因篩選可用于研究疾病表型與治療、藥物作用機(jī)制以及疾病發(fā)病機(jī)制等。研究發(fā)現(xiàn)，這些單倍體胚胎干細(xì)胞即使經(jīng)過復(fù)雜的基因編輯操作，仍然能夠維持其單倍性和多能性的特點(diǎn)。相比于精子與卵子來說，單倍體胚胎干細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能未發(fā)生特化，所以在體外能長期穩(wěn)定培養(yǎng)與擴(kuò)增，同時(shí)也可以對其進(jìn)行基因操作和篩選。所以在個(gè)體水平，經(jīng)基因改造的孤雄、孤雌單倍體胚胎干細(xì)胞可代替精子和卵子[13]，從而得到轉(zhuǎn)基因半克隆小鼠，此方法極大地縮短了制備轉(zhuǎn)基因小鼠的實(shí)驗(yàn)周期。Li等[2]利用CRISPR-Cas9技術(shù)已經(jīng)成功獲得了世界上首個(gè)由基因修飾的單倍體胚胎干細(xì)胞“受精”發(fā)育而成的健康轉(zhuǎn)基因小鼠。CRISPR-Cas9技術(shù)的發(fā)展及其與單倍體胚胎干細(xì)胞的結(jié)合應(yīng)用，提供了一種能夠在短時(shí)間內(nèi)建立攜帶可遺傳基因修飾的轉(zhuǎn)基因動物的新途徑[2]。當(dāng)然，利用單倍體胚胎干細(xì)胞不僅能獲得基因修飾動物，還能利用單倍體胚胎干細(xì)胞實(shí)現(xiàn)同性生殖、研究物種間雜交。

人類單倍體胚胎干細(xì)胞系的建立為研究人類基因組功能以及發(fā)育機(jī)制提供了新穎的方式，也為生物醫(yī)學(xué)的各種應(yīng)用帶來了新的曙光[12]；然而，由于涉及倫理問題，人單倍體胚胎干細(xì)胞在基因缺失研究方面的應(yīng)用僅限于細(xì)胞水平。

6 結(jié)論與展望

單倍體胚胎干細(xì)胞具有多能性，能夠在體外誘導(dǎo)分化成為不同類型的細(xì)胞，在癌癥研究、再生醫(yī)學(xué)和疾病建模等領(lǐng)域都具有重要的應(yīng)用價(jià)值。但是，目前在單倍體胚胎干細(xì)胞的研究過程中還存在著許多問題，如單倍體胚胎干細(xì)胞容易發(fā)生二倍化以及半克隆小鼠的出生率低下等。此外物種差異對建系的影響，使得在哺乳動物中目前只成功建立起小鼠、大鼠、食蟹猴和人的單倍體胚胎干細(xì)胞系，其他物種尚未有成功的報(bào)道。總之，在人類發(fā)展和疾病研究的背景下，單倍體胚胎干細(xì)胞的研究還將是未來幾年干細(xì)胞研究中的重要熱點(diǎn)。