羅氏沼蝦病毒病檢測(cè)和免疫防治進(jìn)展

翁宏飚，沈衛(wèi)鋒，牛寶龍

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 a. 蠶桑研究所，b. 水產(chǎn)研究中心，浙江 杭州 310021)

羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)屬長(zhǎng)臂蝦科沼蝦屬，又稱(chēng)馬來(lái)西亞大蝦、白腳蝦、金線蝦、淡水長(zhǎng)臂蝦等，主要生活于淡水或咸淡水水域中，具有生長(zhǎng)快、食性廣、肉質(zhì)營(yíng)養(yǎng)成分好、養(yǎng)殖周期短等優(yōu)點(diǎn)，有“淡水蝦王”之稱(chēng)，經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，是世界性大型淡水蝦養(yǎng)殖品種。羅氏沼蝦于1976年從日本引進(jìn)我國(guó)，是目前我國(guó)重要的水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)蝦類(lèi)。相比其他養(yǎng)殖蝦類(lèi)，羅氏沼蝦體質(zhì)較為強(qiáng)壯，有較強(qiáng)的抵抗力，但是隨著養(yǎng)殖方式改變和養(yǎng)殖環(huán)境惡化，羅氏沼蝦養(yǎng)殖發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)大大增加。從20世紀(jì)90年代中期開(kāi)始，羅氏沼蝦養(yǎng)殖過(guò)程中疾病呈現(xiàn)暴發(fā)趨勢(shì)。根據(jù)病原不同，可將羅氏沼蝦病害分為寄生蟲(chóng)病、真菌病、細(xì)菌病和病毒病。生產(chǎn)上主要通過(guò)養(yǎng)殖環(huán)境調(diào)控、藥物防治及免疫增強(qiáng)劑應(yīng)用等方法，對(duì)羅氏沼蝦的寄生蟲(chóng)病、真菌病和細(xì)菌病進(jìn)行防控[1]，而關(guān)于羅氏沼蝦病毒病，生產(chǎn)上尚無(wú)有效的防治措施。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者嘗試應(yīng)用免疫技術(shù)對(duì)羅氏沼蝦白尾病進(jìn)行防治，本文重點(diǎn)就引起該病的諾達(dá)病毒(MrNV)免疫防治研究進(jìn)展做綜述，以期為今后有效防控MrNV提供參考。

1 羅氏沼蝦病毒病

目前已明確的羅氏沼蝦病毒病主要有2種。一種是通過(guò)消化道感染的細(xì)小病毒樣病毒病(HPV)[2]，鏡檢可觀察到被感染的肝胰腺上皮細(xì)胞細(xì)胞核變大，其中有嗜堿性包涵體，電鏡觀察可見(jiàn)直徑約29 nm的20面體病毒顆粒，病癥與昆蟲(chóng)濃核病病癥相似。中國(guó)對(duì)蝦(Penaeuschinensis)的HPV探針不能與羅氏沼蝦HPV雜交，說(shuō)明兩者基因組差異較大，兩種HPV沒(méi)有親緣關(guān)系，或親緣關(guān)系較遠(yuǎn)[3]。另一種是表現(xiàn)為白尾癥狀的肌肉壞死病，被稱(chēng)為羅氏沼蝦白尾病。該病主要在苗種期爆發(fā)，發(fā)病蝦苗在短時(shí)間內(nèi)大量死亡，發(fā)病幼苗的肌肉呈白濁現(xiàn)象，也被通稱(chēng)為羅氏沼蝦肌肉白濁病，對(duì)羅氏沼蝦生產(chǎn)的危害較大[4]。該病最早報(bào)道于法國(guó)瓜德羅普島，取病蝦肌肉組織的超薄切片進(jìn)行電鏡觀察，可見(jiàn)被侵染細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中有0.5～3 μm的嗜堿性病毒包涵體顆粒[5]。之后，該病陸續(xù)在中國(guó)[6-7]、印度[8]、泰國(guó)[9]、印度尼西亞[10]、澳大利亞[11]等地被報(bào)道，從病蝦組織中均可同時(shí)分離到諾達(dá)病毒(MrNV)及其衛(wèi)星樣病毒(XSV)[12]。感染實(shí)驗(yàn)表明，MrNV是引起該病的主要病原[13]。該病主要感染對(duì)象是羅氏沼蝦幼苗，發(fā)生在蚤狀幼體發(fā)育結(jié)束后的幼蝦時(shí)期。對(duì)羅氏沼蝦成蝦攻毒后，雖然在多個(gè)組織中可以檢測(cè)到病毒，但很少會(huì)導(dǎo)致成蝦死亡，帶毒而不表現(xiàn)出癥狀的成蝦很可能是病毒水平傳播的宿主[8]。多種水生昆蟲(chóng)可攜帶MrNV病毒，可能在病毒傳播中起作用[14]。病毒還可以感染不同發(fā)育階段的鹵蟲(chóng)，因此鹵蟲(chóng)也是病毒傳播過(guò)程的中間宿主[15]。病毒除水平傳播外，在帶毒親蝦的卵巢組織中也可檢測(cè)到病毒，推測(cè)該病還可通過(guò)垂直傳播途徑傳播[8]。MrNV可以通過(guò)電壓門(mén)控鈣離子(CAV)介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞途徑侵染昆蟲(chóng)sf9培養(yǎng)細(xì)胞[16]。紫外線照射5 min以上、高pH值(pH>8.5)，以及200 mg·kg-1的次氯酸鈉、福爾馬林、氯化苯甲烴銨等均可滅活病毒[17]。另外，自2009年起，在我國(guó)浙江、江蘇、廣西、廣東等地羅氏沼蝦苗種場(chǎng)，出現(xiàn)了一種幼體死亡綜合征，給生產(chǎn)造成一定危害。從瀕死的幼體中分離到病毒顆粒大小25～29 nm的新病毒，命名為MrTV。感染實(shí)驗(yàn)證實(shí)，該病毒是幼體死亡綜合征的病原，基因組分析發(fā)現(xiàn)，該病毒是10 303 nt的單鏈RNA病毒，屬于二順?lè)醋硬《究艫paravius屬[18]。

2 羅氏沼蝦諾達(dá)病毒基因組及結(jié)構(gòu)蛋白

MrNV是一種分節(jié)段RNA病毒，基因組為2條單鏈線性RNA，其中：RNA1長(zhǎng)度約為3.1 kb，編碼一個(gè)約110 ku的RNA聚合酶；RNA2約1.4 kb，編碼42 ku的外殼蛋白。RNA1和RNA2均無(wú)poly(A)尾巴，且均已完成核酸序列測(cè)定，并在GenBank登錄(登錄號(hào)分別為AY222839、AY222840)。在病毒侵染細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，還可以分離到一條約400 nt的亞基因組單鏈RNA3，其序列與RNA1的3’端一致，可編碼非結(jié)構(gòu)蛋白B2，B2蛋白具有抑制RNA干涉的作用[19]。在病毒粒子成熟裝配時(shí)，RNA3不被裝入病毒粒子中。從序列同源性分析，MrNV的病毒分類(lèi)地位既不屬于α-諾達(dá)病毒屬，也不同于β-諾達(dá)病毒屬，是一類(lèi)新的諾達(dá)病毒成員[4]。XSV基因組為一條約900 nt的線性RNA鏈，XSV基因組不含編碼RNA聚合酶的序列[20]。

MrNV及其衛(wèi)星病毒XSV病毒粒子的蛋白組成較為簡(jiǎn)單。MrNV結(jié)構(gòu)蛋白為43 ku(CP43)的單一蛋白，在肽鏈的20～29位殘基中，80%的氨基酸殘基帶正電荷，是RNA結(jié)合域，如果以Ala殘基替代這些帶正電荷的氨基酸殘基，則肽鏈?zhǔn)NA結(jié)合能力。同時(shí)，該區(qū)域與病毒組裝無(wú)關(guān)，缺失RNA結(jié)合域的突變體仍能組裝成病毒樣顆粒[21]。XSV病毒顆粒含2條分別為16 ku(CP16)和17 ku(CP17)的多肽鏈，由同一個(gè)閱讀框編碼，CP16從第2個(gè)AUG起始密碼子開(kāi)始翻譯，因此CP16為CP17的N端截短肽，而非CP17的酶解產(chǎn)物，兩者按1∶1比例組成病毒外殼。缺失實(shí)驗(yàn)證明，肽鏈的C端序列是病毒外殼組裝所必需的[22-23]。

3 羅氏沼蝦白尾病病原的檢測(cè)技術(shù)

羅氏沼蝦病毒病在生產(chǎn)上目前尚無(wú)有效的防治方法，主要把加強(qiáng)病原監(jiān)控、切斷病原傳播途徑作為羅氏沼蝦病毒病預(yù)防的首要手段[24]。對(duì)于羅氏沼蝦諾達(dá)病毒，現(xiàn)已建立不同檢測(cè)方法，如電鏡檢查、病毒核酸電泳、夾心Elisa法等，此外，還建立了點(diǎn)雜交[7]、原位雜交、膠體金試紙條法、環(huán)介導(dǎo)反轉(zhuǎn)錄等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(RT-LAMP)[25]及雙重反轉(zhuǎn)錄(RT)-PCR技術(shù)[24]等病毒檢測(cè)技術(shù)。各種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)：膠體金試紙條檢測(cè)法速度快捷，操作方便，但靈敏度較低；RT-PCR靈敏度高，但耗時(shí)較長(zhǎng)，操作煩瑣；RT-LAMP兼具快捷和靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，生產(chǎn)上應(yīng)用較廣。

4 羅氏沼蝦白尾病的免疫學(xué)防治

蝦類(lèi)是無(wú)脊椎動(dòng)物，關(guān)于其抵抗外界病原體的免疫機(jī)制存在爭(zhēng)議。長(zhǎng)期以來(lái)，學(xué)者們認(rèn)為無(wú)脊椎動(dòng)物不存在后天適應(yīng)形成的專(zhuān)一性免疫能力，一般認(rèn)為，包括蝦類(lèi)在內(nèi)的甲殼類(lèi)動(dòng)物應(yīng)對(duì)病原體入侵的先天免疫系統(tǒng)包括體液免疫和細(xì)胞免疫[26]。在對(duì)蝦抗白斑病的研究中，有多篇文獻(xiàn)報(bào)道以外源表達(dá)的對(duì)蝦白斑病病毒(WSSV)囊膜蛋白或核衣殼蛋白攻毒處理，可提高對(duì)蝦抗WSSV的能力[27-31]，說(shuō)明對(duì)蝦在自然或?qū)嶒?yàn)條件下感染病毒后，可誘導(dǎo)類(lèi)免疫反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，以MrNV、XSV病毒分離混合液浸漬攻毒羅氏沼蝦蝦苗，可引起蝦苗全部死亡，而浸漬攻毒或肌肉注射攻毒健康成蝦，不會(huì)引起成蝦死亡，且25 d后體內(nèi)病毒即可被清除。成蝦的許多免疫指標(biāo)，如酚氧化酶原(proPO)、超氧化物歧化酶(SOD)、總血細(xì)胞數(shù)(THC)、超氧化物陰離子、凝血時(shí)間、氧合血藍(lán)蛋白等，攻毒處理后，在前期與對(duì)照相比發(fā)生顯著差異，而后期則差異不顯著[32]。另外，研究還發(fā)現(xiàn)，羅氏沼蝦成蝦對(duì)WSSV也有良好的抗性[33-34]，而幼蝦則對(duì)WSSV敏感[35]，說(shuō)明羅氏沼蝦成蝦具有更有效的防御反應(yīng)。印度學(xué)者將外源表達(dá)的MrNV外殼蛋白浸漬處理蝦苗24 h，或肌肉注射成蝦，再用MrNV和XSV攻毒后，檢測(cè)成蝦免疫相關(guān)指標(biāo)或蝦苗免疫相關(guān)基因的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)外殼蛋白處理可以誘導(dǎo)成蝦多個(gè)免疫指標(biāo)，如proPO、SOD及超氧陰離子(SOA)活性顯著上升，蝦苗免疫相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)，處理組蝦苗成活率大大提高[35]，說(shuō)明羅氏沼蝦的防御系統(tǒng)也可以被病毒粒子或病毒外殼蛋白誘導(dǎo)，發(fā)生類(lèi)免疫反應(yīng)。

MrNV病毒基因組RNA1編碼RNA依賴(lài)的RNA聚合酶(RdRp)。除參與病毒復(fù)制、調(diào)節(jié)病毒在宿主細(xì)胞中發(fā)育外，RdRp還是保持病毒穩(wěn)定的靶蛋白，在外殼蛋白和其他亞單位RNA分子的合成中起作用，是病毒復(fù)制的關(guān)鍵蛋白。重組RdRp蛋白可以作為免疫誘導(dǎo)因子，刺激機(jī)體產(chǎn)生中和RdRp蛋白的免疫因子，抑制后代病毒RNA的合成[36]。肌肉注射重組RdRp可顯著提高血細(xì)胞數(shù)，誘導(dǎo)免疫相關(guān)基因表達(dá)顯著上調(diào)。注射重組RdRp并攻毒處理14 d后，病毒檢測(cè)呈陰性，而對(duì)照組病毒檢測(cè)呈陽(yáng)性，說(shuō)明外源RdRp處理后可以減少并逐步清除體內(nèi)的病毒[37]。

RNA干擾是一種在進(jìn)化過(guò)程中高度保守、由雙鏈RNA誘發(fā)、造成同源mRNA特異性降解的現(xiàn)象，被證明是一種有效的防治對(duì)蝦病毒病的方法[38]。利用細(xì)菌轉(zhuǎn)錄合成靶向MrNV外殼蛋白基因、B2基因，以及XSV外殼蛋白基因的雙鏈RNA(dsRNA)，滅活細(xì)菌后，將滅活細(xì)菌包被到羅氏沼蝦飼料上，通過(guò)口服的方式，添食單基因靶向或組合多基因靶向的dsRNA，添食24和72 h后，調(diào)查攻毒蝦苗死亡率。結(jié)果顯示，靶向病毒外殼蛋白基因的處理組存活率最高，而對(duì)照組蝦苗全部死亡。說(shuō)明RNA干擾機(jī)制在羅氏沼蝦中可以工作，口服方式可以經(jīng)濟(jì)、有效地將dsRNA導(dǎo)入羅氏沼蝦細(xì)胞并發(fā)揮作用[39]。

DNA疫苗又稱(chēng)核酸疫苗或基因疫苗，是編碼免疫原或與免疫原相關(guān)的真核表達(dá)質(zhì)粒DNA(有時(shí)也可是RNA)，它可經(jīng)一定途徑進(jìn)入宿主體內(nèi)，被宿主細(xì)胞攝取后轉(zhuǎn)錄和翻譯表達(dá)出抗原蛋白，此抗原蛋白能刺激機(jī)體產(chǎn)生非特異性和特異性2種免疫應(yīng)答反應(yīng)，從而起到免疫保護(hù)作用。DNA疫苗是防治對(duì)蝦WSSV過(guò)程中很有效的一種疫苗，疫苗導(dǎo)入對(duì)蝦后可引發(fā)有效的免疫保護(hù)反應(yīng)[40]。用殼聚糖微粒包被含XSV反義基因的質(zhì)粒，以口服或浸漬方法將質(zhì)粒DNA導(dǎo)入羅氏沼蝦體內(nèi)，可有效提高染毒個(gè)體的存活率，顯示DNA疫苗對(duì)羅氏沼蝦病毒病有防效。通過(guò)分析包被微粒大小、微粒運(yùn)載能力及體內(nèi)質(zhì)粒DNA的持續(xù)時(shí)間等指標(biāo)，認(rèn)為口服比浸漬處理能更有效地將質(zhì)粒DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞[41]。

5 羅氏沼蝦諾達(dá)病毒外殼蛋白用于制備病毒樣微粒的應(yīng)用

病毒樣顆粒(virus-like particles, VLP)是含有某種病毒一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白的空心顆粒。因VLP不含有病毒核酸物質(zhì)，不能自主復(fù)制，因此也不具有感染性，又因其具有真病毒的衣殼空間構(gòu)象，所以VLP又被稱(chēng)為“假病毒”或“偽病毒”，具有良好的生物安全性[42]。通過(guò)基因工程的方法，可對(duì)VLP的表面或內(nèi)腔進(jìn)行改造優(yōu)化，使之具備更好的生物兼容性、更優(yōu)的穩(wěn)定性、更高的細(xì)胞攝入性，可用于藥物的包被和高效運(yùn)輸[43]。研究發(fā)現(xiàn)，大腸埃希菌融合表達(dá)的MrNV外殼蛋白肽鏈，可在細(xì)菌細(xì)胞中自組裝成與病毒顆粒結(jié)構(gòu)相似的20面體[44]，同時(shí)，肽鏈N端富含堿性氨基酸殘基區(qū)域易與帶負(fù)電荷核酸結(jié)合，從而在組裝過(guò)程中可將細(xì)菌核酸包裹進(jìn)VLP微粒。在乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)和二硫蘇糖醇(DTT)存在的條件下，MrNV VLP微粒結(jié)構(gòu)發(fā)生解開(kāi)；而在CaCl2存在時(shí)，肽鏈又可重新組裝成微粒[45]。另外，雖然在肽鏈一級(jí)序列中有多個(gè)蛋白酶水解位點(diǎn)，但VLP微粒能在強(qiáng)水解條件下保持穩(wěn)定，推測(cè)是肽鏈組裝成微粒后的四元結(jié)構(gòu)可保護(hù)潛在的水解位點(diǎn)免于水解蛋白酶的作用[45]。MrNV VLP的這些特性，使之十分適合作為生物膠囊，用于外源藥物分子的包被與體內(nèi)運(yùn)輸。

6 羅氏沼蝦健康養(yǎng)殖策略

白尾病嚴(yán)重危害了羅氏沼蝦養(yǎng)殖業(yè)的健康快速發(fā)展，在積極研制各種抗病藥物的同時(shí)，設(shè)計(jì)羅氏沼蝦健康養(yǎng)殖策略，開(kāi)展養(yǎng)殖綜合管理也極為重要[46]。

6.1 優(yōu)質(zhì)種苗培育

優(yōu)質(zhì)種苗是羅氏沼蝦健康生產(chǎn)的基礎(chǔ)，無(wú)病毒親蝦選育是優(yōu)質(zhì)種苗生產(chǎn)的關(guān)鍵。羅氏沼蝦白尾病病原的流行病學(xué)調(diào)查表明，其主要的傳播途徑是親蝦攜帶和傳播。通過(guò)對(duì)培育親蝦苗種定期進(jìn)行病原檢測(cè)，養(yǎng)殖全過(guò)程采取嚴(yán)格的消毒、隔離措施，制定嚴(yán)格的育苗區(qū)管理制度等措施，可以確保所選親蝦健康無(wú)病毒。另外，應(yīng)在苗種繁育全過(guò)程中加強(qiáng)親蝦營(yíng)養(yǎng)，在投喂飼料中添加復(fù)合維生素、免疫多糖等物質(zhì)，提高親蝦的體質(zhì)和免疫力。此外，在羅氏沼蝦幼體階段確保適宜的環(huán)境條件也是種苗培育中須加關(guān)注的[47]。

6.2 改善養(yǎng)殖環(huán)境

羅氏沼蝦的生長(zhǎng)與養(yǎng)殖環(huán)境密切相關(guān)。建議在放苗前對(duì)養(yǎng)殖塘和養(yǎng)殖用水做消毒處理，應(yīng)用生物肥料、專(zhuān)用肥料和生物制劑培育良好水質(zhì)[48]，根據(jù)當(dāng)?shù)貧夂驐l件合理安排放養(yǎng)時(shí)間，協(xié)調(diào)養(yǎng)殖面積，維持合理養(yǎng)殖密度，以保障良好的養(yǎng)殖結(jié)果[49-50]。確保羅氏沼蝦養(yǎng)殖水質(zhì)優(yōu)良，是實(shí)現(xiàn)羅氏沼蝦健康安全養(yǎng)殖的前提。