豬流行性腹瀉病毒的研究進展—流行病學(xué)病原學(xué)及防控

孫萌萌,王曉佳

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,北京 海淀100193)

冠狀病毒是感染多種家畜、家禽、寵物以及人類的重要病原微生物,第九次國際病毒分類委員會將冠狀病毒科分為α、β 和γ 三個屬。其中豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)與傳染性胃腸炎病毒(TGEV)屬于α-冠狀病毒,其在全世界流行并導(dǎo)致仔豬腹瀉[1]。豬呼吸道冠狀病毒(PRCV)是TGEV 的3 個基因缺失的突變株,相當(dāng)于TGEV 的天然弱毒疫苗,因此其流行使TGEV的發(fā)生趨于下降[2]。嚴(yán)重急性呼吸綜合征病毒(SARS-CoV)屬于β-冠狀病毒,是導(dǎo)致2003 年“非典”罪魁禍?zhǔn)?。傳染性支氣管炎病?IBV)是γ-冠狀病毒的代表,對養(yǎng)禽業(yè)危害重大。2011 年病毒分類委員會新增了一個δ 屬,豬德爾塔冠狀病毒(PDCoV)成為δ-冠狀病毒的研究模型,這也是引起仔豬腹瀉的一種重要病原體。2017 年9 月份,中山大學(xué)發(fā)現(xiàn)了一種對新生仔豬具有高致死性的新型冠狀病毒,命名為豬腸道-冠狀病毒(PEAV),與源于蝙蝠的腸道冠狀病毒(HKU2)核苷酸同源性為95%[3]。同年9 月份,浙江大學(xué)聯(lián)合溫氏食品集團確證了一種新的豬腸道冠狀病毒(SeACoV),與HKU2 核苷酸同源性為95%,SeACoV 不與PEDV、TGEV,以及PDCoV 產(chǎn)生抗體交叉反應(yīng)[4],這對我國新生仔豬腹瀉的防控提出新的挑戰(zhàn)。豬腸道冠狀病毒的高變異特性目前已經(jīng)成為仔豬腹瀉防控的難點,且日趨復(fù)雜,對養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展構(gòu)成嚴(yán)重威脅。

流行病學(xué)調(diào)查表明,PEDV 目前仍是引起仔豬腹瀉的最主要病原體,感染仔豬死亡率可達(dá)80%以上。本文綜述了該傳染病近幾年來的流行狀況、病毒功能蛋白的致病機理,以及新型防控技術(shù)。

1 PEDV 流行病學(xué)

20 世紀(jì)70 年代歐洲(英國和比利時)最早發(fā)生了豬流行性腹瀉病(PED),隨之在世界范圍內(nèi)廣泛流行,1978 年P(guān)EDV 首次被鑒定出來[5]。隨著各種防控技術(shù)的發(fā)展,之后的幾十年P(guān)ED 逐漸減少,呈零星暴發(fā)。然而2010 年以來,該病卷土重來,不僅冬季多發(fā),夏季發(fā)病也成為“新常態(tài)”,加之該病毒一直在變異,經(jīng)典疫苗保護率低,同時返飼的做法帶來很大的疾病風(fēng)險,給養(yǎng)殖業(yè)造成了重大損失并帶來更多潛在威脅與挑戰(zhàn)。

1.1 國外流行病學(xué)調(diào)查 2013 年4 月美國發(fā)現(xiàn)PEDV 變異毒株,隨后蔓延全國,截至2014 年6 月,已有30 個州的實驗室在7 250 個豬群中檢測到陽性病例;調(diào)查顯示,PEDV 出現(xiàn)后的一年已經(jīng)造成了美國400~500 萬頭仔豬的死亡[6]。2014 年6 月美國農(nóng)業(yè)部發(fā)布了聯(lián)邦政府令,要求報告所有PEDV感染病例,以隨時查閱美國該傳染病的流行情況。在德國北部,2014 年出現(xiàn)了PED 的急性暴發(fā),同年夏天在烏克蘭也暴發(fā)了PED,仔豬死亡率接近100%[7]。在亞洲的日本,2013 年10 月九州第一次發(fā)現(xiàn)PEDV 感染,2 個月后農(nóng)場發(fā)病率達(dá)19.5%;2013 年末開始,韓國的PED 疫情顯著增加,并迅速席卷全國[8]。通過病毒基因相似性的推斷,PEDV在全球可能存在循環(huán)傳播[9]。

1.2 國內(nèi)流行病學(xué)調(diào)查 2010 年以后,PEDV 毒株發(fā)生了強毒變異,我國暴發(fā)了嚴(yán)重的PEDV 與TGEV的混合感染,7 日齡內(nèi)仔豬致死率高達(dá)60% ~100%[10]。GenBank 中收錄的數(shù)據(jù)顯示,目前9 個省直轄市均有PEDV 流行,陽性率為61.10% ~78.49%,西南、西北、華北最為嚴(yán)重。其中,2011-2013 年間,廣西34 個縣144 個豬場216 份病料的陽性率為27.78%[11],福建128 份病料的陽性率為67.97%[12],安徽37 個規(guī)?；i場186 份病料的陽性率為59.1%[13],廣東102 個養(yǎng)殖場236 份病料的陽性率為33.05%[14],北京地區(qū)1 201 份病料的陽性率為4.66%[15]。2014-2016 年間,東北地區(qū)88 個豬場264 份病料的陽性率為74.62%[16],山東3 035 份病料的陽性率為67.49%,第四季度高達(dá)88.57%[17]。

2 PEDV 病毒蛋白及其功能

PEDV 基因組的編碼順序為5′-NSP1-15-SORF3-E-M-N-3′,病毒基因組編碼結(jié)構(gòu)蛋白—纖突糖蛋白(S)、核衣殼蛋白(N)、膜蛋白(M)、包膜蛋白(E),15 個非結(jié)構(gòu)蛋白(Nonstructural protein,NSP),以及輔助蛋白ORF3。

2.1 結(jié)構(gòu)蛋白 S 蛋白是PEDV 纖突的主要成分,可以識別宿主細(xì)胞上的受體,促進病毒與細(xì)胞膜發(fā)生融合,氨基酶APN 曾被認(rèn)為是PEDV 的作用受體,但未被進一步確定。我國科學(xué)家近期發(fā)現(xiàn),Occludin 蛋白有利于病毒入侵細(xì)胞,可能是協(xié)助受體[18]。目前該病毒受體尚不清楚。S 蛋白擁有良好的免疫原性和反應(yīng)原性,因此是設(shè)計基因工程疫苗的主要靶位,在免疫學(xué)診斷技術(shù)中的應(yīng)用也比較廣泛。PEDV 的變異主要發(fā)生在S 蛋白上,因此可用來探究PEDV 各毒株之間的遺傳關(guān)系、流行病學(xué)以及基因突變[19]。N 蛋白是一種磷酸化的核衣殼蛋白,病毒感染早期豬體內(nèi)就能檢測出N 蛋白抗體,因此被作為診斷靶標(biāo)之一;N 蛋白的抗原表位還可以誘導(dǎo)機體產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答。2013 年科學(xué)家發(fā)現(xiàn),缺失核仁定位信號的N 蛋白不再定位于宿主細(xì)胞核,喪失了使宿主細(xì)胞在G2/M 期停滯的能力,并影響病毒RNA 的合成,這為闡明病毒蛋白與細(xì)胞互作關(guān)系提供了新思路[20];PEDV 的N 蛋白還可誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并激活NF-κB,并上調(diào)表達(dá)IL-8等炎癥因子[21]。最近發(fā)現(xiàn)N 蛋白還可以與核仁磷酸蛋白npm1 相互作用,保護病毒免受蛋白酶的水解,因而利于病毒自身復(fù)制[22]。M 蛋白對于病毒粒子裝配成熟過程很重要,被作為基因工程疫苗的候選蛋白,M 蛋白還可介導(dǎo)α-干擾素的產(chǎn)生,但前提是必須有補體的存在[23]。E 蛋白在病毒的組裝和出芽過程中發(fā)揮著重要的作用,近年來發(fā)現(xiàn),PEDV 的E 蛋白主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng),TM 結(jié)構(gòu)域的V4 區(qū)域?qū)φ{(diào)節(jié)病毒誘導(dǎo)的應(yīng)激與免疫反應(yīng)至關(guān)重要,但是不影響細(xì)胞周期,E 蛋白可能在炎癥反應(yīng)與持續(xù)感染中發(fā)揮著重要的作用[24-25]。

2.2 非結(jié)構(gòu)蛋白 冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白參與調(diào)節(jié)病毒基因組的復(fù)制以及感染過程,是重要的功能蛋白。2013 年茅翔與邊葶藶將冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NSPs 的相關(guān)研究進行了較全面的闡述[26-27],本文綜述了近幾年來,PEDV 幾種NSPs 結(jié)構(gòu)與功能的研究進展。NSP1 是復(fù)制酶多聚蛋白N 端的裂解產(chǎn)物,以一種奇特的雙向調(diào)節(jié)機制來抑制宿主基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá),可通過結(jié)合在宿主核糖體上來阻止宿主蛋白的翻譯。PEDV 的NSP1 的兩個α-螺旋中間有6 個β-折疊結(jié)構(gòu)[28],這與SARS-CoV 相似;NSP1可通過蛋白酶依賴的途徑降解CBP,阻礙干擾素調(diào)節(jié)因子IRF-3 的活性[29],還可抑制IFN-β 啟動子活性[30],因此利于PEDV 逃避宿主天然免疫反應(yīng)。NSP3 是一種多功能蛋白,含有鋅結(jié)合域,可水解NSP1/NSP2 和NSP2/NSP3,且與病毒感染早期基因組RNA 定位到復(fù)合體有關(guān)。PEDV 的NSP3 也包括兩個木瓜酶樣蛋白結(jié)構(gòu)域(Papain-like protease,PLP),其中PLP2 可降解干擾素通路蛋白RIG-I 與STING,因此阻礙天然免疫信號的傳遞[31]。NSP5編碼3C 樣蛋白酶(3C-like proteinase,3CLpro),是病毒成熟所必須的蛋白,也是抗病毒抑制劑研究的主要熱點。NSP5 在結(jié)晶體狀態(tài)下以緊密的二聚體形式存在,被認(rèn)為是蛋白酶的活化形式,N 末端對其構(gòu)象影響不明顯,但其缺失卻可導(dǎo)致活性完全喪失。近期研究者們發(fā)現(xiàn),PEDV 3CLpro 在231 位谷氨酸殘基處可切割NEMO,影響干擾素的產(chǎn)生[32]。NSP7 與病毒復(fù)制的調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)運和病毒粒子的組裝有關(guān),在感染早期定位于病毒復(fù)制復(fù)合體,而在后期則定位于膜蛋白聚集位點。PEDV 的NSP7 亦可顯著抑制IFN-β 啟動子活性以拮抗Ⅰ型干擾素應(yīng)答[33]。目前對PEDV 編碼蛋白功能相關(guān)研究較少,進一步探索病毒蛋白與細(xì)胞蛋白的互作,病毒蛋白對免疫系統(tǒng)的影響,病毒蛋白與復(fù)制的關(guān)系等,可為疫病防控提供新思路,并為新型疫苗設(shè)計奠定基礎(chǔ)。

2.3 ORF3 PEDV 不同毒株的ORF3 存在著各種突變,某些病毒弱毒株甚至缺失ORF3,提示該基因與病毒的毒力有關(guān),可用作區(qū)分毒株的標(biāo)志。近期研究表明,強毒株ORF3 蛋白具有離子通道活性,ORF3 基因突變或缺失可顯著降低病毒滴度[34]。有一些報道表明,輔助蛋白缺失的SARS-CoV 重組病毒,其增殖能力與野生型近似,但是在動物體內(nèi)感染力明顯減弱,低劑量病毒即可激發(fā)T 細(xì)胞反應(yīng)。作為PEDV 唯一的輔助蛋白,將流行株的ORF3 進行突變重組,可為培育高效的候選疫苗毒株提供思路。

3 防控技術(shù)

3.1 疫苗 2010 年以前,我國研究人員自行研制了滅活苗,免疫后仔豬的主動保護率達(dá)85%以上,被動免疫的仔豬保護率為90%以上[35],弱毒苗保護率為94.6%[36],TGEV-PEDV 二聯(lián)弱毒苗的免疫保護率達(dá)97.7%[37]。然而,隨著突變毒株的大面積流行,已有的疫苗都不能提供全面保護。當(dāng)前我國研究者將PEDV 突變毒株進行了生物學(xué)鑒定,疫苗臨床前試驗也在緊密開展。2017 年Vaccine 期刊報道了2 篇我國研究人員關(guān)于PEDV 疫苗的研究進展。其中一個團隊將Zhejiang08 毒株進行致弱,免疫后誘導(dǎo)仔豬產(chǎn)生了高滴度中和抗體,免疫14 天后的仔豬對流行毒株感染產(chǎn)生了完全保護[38]。另一個研究團隊將滅活苗用生物可降解的納米顆粒進行包被,鼻內(nèi)接種給晚期妊娠母豬,發(fā)現(xiàn)新生仔豬獲得良好的被動免疫,死亡率降低[39]。2013 年美國PED 暴發(fā)后,碩騰公司基于新分離的毒株研制出弱毒苗,HARRIS 公司研發(fā)了甲病毒RNA 復(fù)制子疫苗[40]。韓國與日本也相繼研制出滅活苗83P-5、96P-4、KPEDV-9、SM98P 等,可誘導(dǎo)新生仔豬產(chǎn)生體液免疫來對抗PEDV 的感染[41]。近年來PEDV 基因工程疫苗的研發(fā)也獲得了很多關(guān)注,如轉(zhuǎn)基因植物、乳酸菌,以及酵母疫苗。研究者們在煙草中轉(zhuǎn)入了PEDV 的S 基因或其主要抗原位點,給小鼠飼喂這種轉(zhuǎn)基因植物可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生全身免疫和黏膜免疫,對仔豬也有良好的保護作用[42-43]。研究者們還構(gòu)建了PEDV 的S 基因不同片段及N 基因重組益生菌表達(dá)系統(tǒng),這種靶向黏膜樹突狀細(xì)胞的口服疫苗能有效誘發(fā)益生菌分泌型免疫球蛋白A 以及體液免疫反應(yīng),有效提高疫苗抗原傳遞效率,為誘導(dǎo)有效的免疫應(yīng)答提供有效策略[44]。此外,利用酵母表達(dá)系統(tǒng)作為載體,構(gòu)建含有S 基因的疫苗,可誘導(dǎo)高水平IgA 且可有效地激發(fā)細(xì)胞免疫[45]。

3.2 抗病毒制劑 目前尚無商品化抗病毒制劑。較早時采用高免血清與卵黃抗體等方法,即將PEDV 感染產(chǎn)蛋母雞,然后收集卵黃制備高效價的卵黃抗體作為治療劑,治療后仔豬死亡率降為16.7%[46]。有研究者制備了高免血清,治愈率達(dá)87.5%[47]。在藥物開發(fā)過程中,天然產(chǎn)物是重要的寶庫,近年來研究逐漸增多。據(jù)報道,槲皮素-7-鼠李糖苷可高效抑制PEDV 復(fù)制,IC50為14 ng/mL[48]。近期發(fā)現(xiàn)銀杏果皮提取的多糖可抑制病毒入侵,IC50為1.7 μg/mL[49]。此外,海藻的幾種多酚類提取物,可在μmol/L 濃度抑制病毒入侵與復(fù)制[50];從山茶花中提取的幾種齊墩果烷三萜,可在μmol/L 濃度抑制PEDV 蛋白合成[51]。本課題組篩選出一種植物提取生物堿,在500 nmol/L 使用濃度下可完全抑制PEDV 感染細(xì)胞,0.05 mg/kg·bw 使用量可使感染仔豬的組織病變與癥狀完全消失[52]。此外,還有一些復(fù)方藥物的報道,如對212 頭發(fā)病仔豬后海穴注射穿心蓮加黃連素,注射1~2 次即痊愈[53];將參苓白術(shù)散灌服患病仔豬,后海穴注射頭孢曲松鈉+鏈霉素+黃芪免疫肽,也取得了顯著的治療效果[54];將金銀花、黃連等中藥提取物治療仔豬腹瀉,治愈率可達(dá)94.44%[55]。這些天然產(chǎn)物具有抑制病毒復(fù)制、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、抗炎鎮(zhèn)痛等功效,靶向宿主細(xì)胞的抑制物亦可最大限度地減少耐藥性可能,而多靶位制劑的聯(lián)用有望進一步安全、有效地發(fā)揮抗病毒效果。

4 展望

毋容置疑,當(dāng)前PEDV 感染仍然呈現(xiàn)嚴(yán)重態(tài)勢,關(guān)于PEDV 的研究存在著一些挑戰(zhàn):(1)該病毒的分子致病機理尚不清楚;(2)遭受PEDV 的豬場可能在地區(qū)或全國范圍內(nèi)成為潛在傳播的病原儲藏庫;(3)病毒變異株的出現(xiàn)速度快,基于經(jīng)典毒株CV777 研制的疫苗已經(jīng)不能對豬群提供完全的保護;(4)當(dāng)前的疫苗抗原遞呈途徑(口腔或者鼻內(nèi)接種)并不理想。PDEV 的防治仍以疫苗為主,篩選以臨床分離培養(yǎng)的變異毒株作為疫苗候選毒株,馴化出免疫原性好且毒價高的弱毒株,將是PEDV 常規(guī)疫苗研發(fā)和產(chǎn)業(yè)化的重點。此外,目前臨床上將具備抗病毒活性的生物提取物作為添加劑或者聯(lián)合制劑使用,成為該疫病緊急防控策略的重要組成部分,這也為疾病的防治提供了新的思路。相信隨著分子生物學(xué)、免疫學(xué)、基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展,以及PEDV 致病機理和免疫機制研究的深入研究,將逐步推進PEDV 疫苗以及生物治療制劑的研發(fā)進程,為該病毒性傳染病的防控乃至凈化作出重要而積極的貢獻(xiàn)。