長鏈非編碼RNA及其與人類疾病之間關(guān)系的研究概述

汪顯坤 林欣婭 胡雪峰

(福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 福州 350108)

1 長鏈非編碼RNA簡介

2002年，日本科學(xué)家Okazaki在對小鼠cDNA文庫大規(guī)模測序時(shí)第一次發(fā)現(xiàn)了一類較長的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，并將其命名為長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA， lncRNA)[1]。lncRNA是一類長度為200～10 000 nt之間的非編碼RNA。研究表明，人類許多疾病的發(fā)生都涉及到lncRNA的過度表達(dá)、缺失或突變；另一方面，lncRNA能在X染色體失活、染色質(zhì)修飾、干細(xì)胞定向分化以及轉(zhuǎn)錄沉默、激活等重要生物學(xué)過程中施加影響。

1.1 lncRNA的種類 根據(jù)與編碼蛋白基因的位置關(guān)系，lncRNA分為以下幾種： ①反義lncRNA(antisense lncRNA),由編碼蛋白基因的反義鏈(模板鏈)轉(zhuǎn)錄而成；②正義lncRNA(sense lncRNA),由編碼蛋白基因的正義鏈(非編碼鏈)轉(zhuǎn)錄而成；③內(nèi)含子lncRNA(intronic lncRNA),完全由基因的內(nèi)含子區(qū)域編碼而成；④基因區(qū)間lncRNA(large intergenic noncoding RNA, lincRNA),由兩個(gè)基因之間的區(qū)域編碼而成，因此不與編碼基因的內(nèi)含子和外顯子相重疊；⑤反義上游lncRNA(antisense ustream lncRNA),其序列位于反義鏈上游,編碼基因的啟動(dòng)子為雙向啟動(dòng)子，采用與編碼基因轉(zhuǎn)錄的反方向進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，因而與編碼基因頭對頭相鄰；⑥增強(qiáng)lncRNA(enhancer lncRNA)，由基因的增強(qiáng)子轉(zhuǎn)錄而成的，可以促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄[2]。

1.2 lncRNA的產(chǎn)生方式 lncRNA有以下產(chǎn)生方式： ①編碼基因的發(fā)生框插入一段序列，進(jìn)而破壞原有的編碼功能，轉(zhuǎn)錄成一個(gè)與先前編碼序列合并的lncRNA；②染色質(zhì)在發(fā)生重排后，兩個(gè)不轉(zhuǎn)錄并且間隔距離很遠(yuǎn)的序列區(qū)合并到了一起，產(chǎn)生了一個(gè)含多個(gè)外顯子的lncRNA；③在兩次連續(xù)的重復(fù)時(shí)間內(nèi)，ncRNA內(nèi)部產(chǎn)生相鄰的重復(fù)序列以增加ncRNA的核酸數(shù)，從而產(chǎn)生lncRNA；④通過轉(zhuǎn)座因子的自由插入產(chǎn)生一個(gè)有功能的lncRNA；⑤非編碼基因通過反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座作用復(fù)制，產(chǎn)生一個(gè)有功能的非編碼逆轉(zhuǎn)錄基因，或產(chǎn)生一個(gè)無功能的逆轉(zhuǎn)錄基因。

1.3 lncRNA的結(jié)構(gòu)和功能特點(diǎn) 在人類基因組中約有70%的基因被轉(zhuǎn)錄成RNA，但只有2%左右的RNA編碼蛋白質(zhì)的合成。與mRNA相同，lncRNA也是由對應(yīng)的基因轉(zhuǎn)錄而成，具有5′帽子、poly(A)尾巴和啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)，通過前體的適當(dāng)剪接，便可形成成熟體的lncRNA；同一基因可以形成不同的轉(zhuǎn)錄本的lncRNA。然而，與miRNA相比lncRNA具有相對較長的核苷酸鏈，在發(fā)揮作用時(shí)既可以與DNA雜交來調(diào)控基因的表達(dá)，也可與mRNA結(jié)合來調(diào)控轉(zhuǎn)錄；更重要的是，它能夠通過空間的盤曲，折疊成許多特定而復(fù)雜的二級結(jié)構(gòu)，這些獨(dú)特的空間結(jié)構(gòu)能夠提供分子結(jié)合位點(diǎn)，從而使其可以行使特定的生物學(xué)功能。

2 lncRNA與人類疾病

2.1 lncRNA與癌癥 主要介紹lncRNA與肝癌、肺癌、胃癌和乳腺癌之間的關(guān)系。

2.1.1 肝癌 肝癌是常見的癌癥，具有轉(zhuǎn)移發(fā)生率高以及術(shù)后復(fù)發(fā)率高的特點(diǎn)。lncRNA具有與微小RNA(micro RNA, miRNA)競爭性結(jié)合、從而使mRNA正常表達(dá)的功能。miRNA是一類序列小于200 nt的非編碼RNA，可以與靶mRNA通過堿基互補(bǔ)配對結(jié)合，從而抑制mRNA的表達(dá)[3]。在肝癌的研究中發(fā)現(xiàn)，名為miR-372的mRNA與cAMP依賴蛋白激酶(PRKACB)的mRNA 3’非編碼區(qū)有相同靶點(diǎn)，從而抑制PRKACB基因的表達(dá)。肝癌高表達(dá)轉(zhuǎn)錄本(HULC)在肺癌組織中高水平表達(dá)，而lncRNA-HULC作為一種內(nèi)源性的“海綿”可以競爭性地抑制miR-372的活性，進(jìn)而上調(diào)靶基因PRKACB的表達(dá)，誘導(dǎo)磷腺苷效應(yīng)原件結(jié)合蛋白(CREB)的磷酸化。磷酸化的CREB會(huì)結(jié)合到HULC基因的近端啟動(dòng)子區(qū)域，促進(jìn)RNA聚合酶Ⅱ與染色質(zhì)的結(jié)合，進(jìn)而激活致癌基因HCLU的轉(zhuǎn)錄[4]。這是一種正反饋的調(diào)節(jié)機(jī)制。根據(jù)以上的調(diào)節(jié)機(jī)制，lncRNA-HULC可以作為早期肝癌預(yù)測與診斷的標(biāo)志物。

在研究間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSC)對肝癌發(fā)生的作用時(shí)，發(fā)現(xiàn)一些lncRNA異常表達(dá)，并鑒定出一種在肝癌組織中高表達(dá)、名為lncRNA-MUF的、新的lncRNA。研究表明lncRNA-MUF可以結(jié)合膜聯(lián)蛋白A2(annexin A2, ANXA2)，進(jìn)而激活Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路(Wnt/β-catenin)和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)，而EMT可以減少腫瘤細(xì)胞的凋亡與衰老，增強(qiáng)耐藥性[5]。同樣lncRNA-MUF也可以作為miR-34a的競爭性內(nèi)源RNA，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子Snail1上調(diào)和EMT活化。

2.1.2 肺癌 肺癌主要分為非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)和小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)，其中，NSCLC的發(fā)病率占總數(shù)的85%。在NSCLC中，lncRNA-MEG3(maternally expressed gene 3)通過多條信號通路發(fā)揮作用： 在p53通路中，p53抑癌基因是MEG3的下游靶點(diǎn)，MEG3與癌基因(murine double minute2, MDM2)作用，阻礙MDM2對p53蛋白的泛素化降解，從而活化p53，抑制癌細(xì)胞生長；在Rb通路中，Rb的活化可以下調(diào)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNA methyltransferase 1, Dnmt1)的表達(dá)，降低MEG3基因及其附近DNA的甲基化水平使MEG3高表達(dá)，從而抑制癌細(xì)胞的增殖[6]、調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)和跨膜受體蛋白(Notch)的信號通路。

lncRNA會(huì)影響前體mRNA(pre-mRNA)的可變剪接。研究表明，肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1(metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1, MALAT1)是一條長度為8 708 nt的lncRNA，它與癌癥的發(fā)生和發(fā)展有著密切的關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，MALAT1能夠招募絲氨酸/精氨酸結(jié)合SR(serine/argine)蛋白剪接因子，通過控制SR蛋白的富集方式，調(diào)節(jié)其在細(xì)胞核內(nèi)的分布和活性，從而影響一些pre-mRNA的可變剪接。近年來，不斷有新的lncRNA被發(fā)現(xiàn)并被證實(shí)與肺癌的發(fā)生與遷移有著重要的關(guān)系。例如，李雪萍等[7]發(fā)現(xiàn)lncRNA-LOC90024與肺癌的發(fā)生密切相關(guān)，當(dāng)過表達(dá)LOC90024時(shí)，可顯著促進(jìn)肺癌細(xì)胞生長和遷移。因此，lncRNA-LOC90024可能作為癌基因發(fā)揮作用，有望提供新的治療靶點(diǎn)。

2.1.3 胃癌 我國胃癌的發(fā)病率和死亡率高居世界第二。lncRNA-H19可促進(jìn)細(xì)胞增殖。例如，在人胃腺癌AGS細(xì)胞系中上調(diào)H19基因后，癌細(xì)胞增殖明顯增加，而沉默H19基因后，癌細(xì)胞呈現(xiàn)持續(xù)凋亡的狀態(tài)。其調(diào)節(jié)機(jī)制涉及H19/ISM1和miR-675/CALNI兩條通路，當(dāng)過表達(dá)H19基因時(shí)，一方面使ISM1上調(diào)，呈正相關(guān)，另一方面通過miR-675抑制CALN1的表達(dá)，促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移[8]。除了通過多條信號通路來調(diào)節(jié)之外，也可通過lncRNA與靶mRNA結(jié)合來調(diào)節(jié)。胃癌高表達(dá)轉(zhuǎn)錄本1(gastric carcinoma proliferation enhancing transcript 1, GHET1)是與胃癌發(fā)生、發(fā)展、遷移密切相關(guān)的lncRNA。GHET1與胰島素樣生長因子mRNA結(jié)合蛋白1(insulin-like growth factor 2 mRNA binding protein 1, IGF2BP1)結(jié)合，IGF2BP1再作用于癌基因c-Myc mRNA，使c-Myc mRNA維持穩(wěn)定并提高表達(dá)水平[9]。而c-Myc的表達(dá)產(chǎn)物使細(xì)胞無限增殖，并且可調(diào)節(jié)細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，是早期發(fā)現(xiàn)的一種重要的癌基因。

2.1.4 乳腺癌 乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率都高居女性癌癥的首位，嚴(yán)重影響女性的健康生活。lncRNA調(diào)控著乳腺癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。人們對生長阻滯特異轉(zhuǎn)錄本5(GAS5)研究最為深入，在乳腺癌中，GAS5基因是Notch-1信號傳導(dǎo)通路中的下游靶點(diǎn)。研究表明，當(dāng)干擾Notch-1時(shí)，乳腺癌細(xì)胞中的GAS5基因的轉(zhuǎn)錄水平可顯著提高，從而誘導(dǎo)癌細(xì)胞的凋亡和生長阻滯[10]，GAS5和miR-21還存在著相互抑制、雙向調(diào)控的機(jī)制，以促進(jìn)癌細(xì)胞的生長[11]。GAS5可靶向糖皮質(zhì)激素受體(GR)的DNA結(jié)合區(qū)，阻礙受體和下游蛋白的表達(dá)，影響細(xì)胞的增殖和代謝。基于以上機(jī)制，GAS5可作為手術(shù)預(yù)后評估的重要標(biāo)志物。除此之外，lncRNA ANRIL的基因在肺癌、肝癌、乳腺癌等惡性腫瘤的組織中也高水平表達(dá)，充當(dāng)原癌基因的作用。在乳腺癌細(xì)胞系MCF7細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，ANRIL可能通過與PRC2的核心亞基——多梳蛋白SUZ12相互作用，介導(dǎo)組蛋白的甲基化，沉默p15基因的轉(zhuǎn)錄，當(dāng)ANRIL基因沉默時(shí)，干擾SUZ12與p15的結(jié)合，從而促進(jìn)p15的表達(dá)，并進(jìn)一步促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲[12]。ANRIL還可通過相同的機(jī)制來沉默p53基因。

2.2 lncRNA與心血管疾病 心血管疾病常常伴有心肌增厚、心力衰竭、心肌梗死等癥狀，而lncRNA與心肌細(xì)胞的分化密切關(guān)系，因此也在疾病的發(fā)生中發(fā)揮著重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，在血管緊張素(AngII)誘導(dǎo)的人心肌增厚的模型中，心肌增厚相關(guān)因子(cardiac hypertrophy related factor, CHRF)高水平表達(dá)，lncRNA-CHRF干擾miR-487，抑制其與髓樣分化因子88(Myd88)的結(jié)合，而Myd88介導(dǎo)下游轉(zhuǎn)錄因子NF-kB[13]，參與心肌增厚的信號傳導(dǎo)，結(jié)果導(dǎo)致心肌細(xì)胞的肥大。

Greco等[14]在對照非終末期心力衰竭病人與健康組成人的左心室心肌細(xì)胞時(shí)，發(fā)現(xiàn)有9種lncRNA(CDKN2B-AS1/ANRIL、 EGOT、 H19、 HOTAIR、 LOC285194/TUSC7、 RMRP、 RNY5、 SOX2-OT和SRA1)在非終末期的調(diào)節(jié)水平與終末期一致，且都表達(dá)下調(diào)。另外，在心血管疾病中，心肌梗死因?yàn)椴糠中募〖?xì)胞的急性缺血而對患者造成嚴(yán)重的威脅。Zangrando等[15]曾發(fā)現(xiàn)并命名了心肌梗死相關(guān)轉(zhuǎn)錄物lncRNA-MIRT。他利用原位雜交技術(shù)，基因間lncRNA-MIRT被定位在心肌梗死模型鼠的左心室，并且MIRT1和MIRT2的表達(dá)水平的分別提高了5倍和13倍。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，MIRT的劑量與射血分?jǐn)?shù)正相關(guān)，而與梗死面積負(fù)相關(guān)。

2.3 lncRNA與神經(jīng)退行性疾病 lncRNA可調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cell, NSCs)的定向分化。NSCs具有可分化成神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的潛能，而一些lncRNA在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的表達(dá)具有細(xì)胞和組織的特異性。研究發(fā)現(xiàn)，Dlx5/6基因間的增強(qiáng)子轉(zhuǎn)錄形成3.8 kb的lncRNA Evf-2，通過與Dlx-2結(jié)合并使后者活化，招募CpG甲基結(jié)合蛋白2(methyl CpG binding protein 2， MECP2)、DLX等轉(zhuǎn)錄因子與Dlx5/6基因結(jié)合，提高Dlx5/6的表達(dá)，是促進(jìn)NSCs向γ-氨基丁酸神經(jīng)元分化的關(guān)鍵因子[16]。研究還發(fā)現(xiàn)，lncRNA-RMST、 lncRNA-N1、 lncRNA-N2和lncRNA-N3能通過結(jié)合表觀沉默蛋白SUZ12和神經(jīng)元限制性沉默因子(neuron-restrictive silencer factor, NRSF)，激活下游通路而促進(jìn)NSCs向神經(jīng)元分化，為研究NSCs定向誘導(dǎo)成多巴胺能神經(jīng)元、并用以治療帕金森病提供了理論依據(jù)。

阿爾茲海默病(Alzheimer’s disease, AD)是嚴(yán)重影響生活質(zhì)量、且發(fā)病率較高的神經(jīng)退行性疾病。其發(fā)病的機(jī)制之一是β分泌酶1(β-site of APP cleaving enzyme 1, BACE1)能夠使淀粉樣蛋白前體(amyloid precursor protein, APP)斷裂而產(chǎn)生突觸毒性物質(zhì)Aβ，Aβ42大量累積形成大腦皮質(zhì)老年斑。而BACE1的反義轉(zhuǎn)錄物BACE1-AS可以緩解這一過程,這是明顯的反饋—應(yīng)激的機(jī)制。Liu等人[17]利用siRNA技術(shù)沉默了AD老年斑lncRNA BACE1-AS的表達(dá)，結(jié)果表明BACE1的異常剪切APP的能力明顯下降，Aβ42的生成量也隨之減少。由此推測，lncRNA BACE1-AS可能是形成Aβ的關(guān)鍵因子。

2.4 lncRNA與自身免疫疾病 自身免疫疾病常包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus, SLE)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis， RA)、I-型糖尿病(type 1 diabetes mellitus， T1DM)、銀屑病(psoriasis)等，這些疾病的致病機(jī)理大致相同，而SLE、 RA等常伴隨著慢性的關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)。SLE是一類先天性免疫和獲得性免疫共同調(diào)控的復(fù)雜免疫疾病。lncRNA-Gas5可能通過競爭性結(jié)合GR而阻斷GR下游信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)[10]，當(dāng)GAS5表達(dá)量提高時(shí)，則會(huì)削弱糖皮質(zhì)激素對SLE患者的治療。lncRNA-NFAT1在SLE患者外周血的單核細(xì)胞中濃度較高，這主要與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。Zhang等[18]的研究發(fā)現(xiàn)，NFAT1的表達(dá)可激活p38/MAPK通路，從而導(dǎo)致白介素-6(IL-6)、趨化因子-10(CXCL-10)等炎癥因子的大量聚集。

RA的臨床表現(xiàn)主要為手足等關(guān)節(jié)的僵硬、畸形，異常表達(dá)的lncRNA主要存在于RA患者的外周血和關(guān)節(jié)滑液中。Song等[19]利用微矩陣技術(shù)，發(fā)現(xiàn)至少有Hotair、 LUST和MEG9等七種lncRNA在RA患者體的內(nèi)表達(dá)上調(diào)。同時(shí)高劑量的Hotair活化巨噬細(xì)胞，低劑量的Hotair卻激活MMP-2、 MMP-3等基質(zhì)蛋白酶，lncRNA可能作為有效診斷RA的標(biāo)志物。在小鼠胰腺癌細(xì)胞(MIN6)中表達(dá)大量的lncRNAs，這些lncRNA被定位在胰島，并且在非肥胖型糖尿病小鼠(NOD)的患病前期高水平表達(dá)。其中的lncRNA-3和lncRNA-4能夠跟腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白介素-61β(IL-1β)等炎癥因子共同調(diào)節(jié)胰島細(xì)胞的凋亡[20]。

3 結(jié)語

lncRNA在發(fā)揮其功能的過程中，與各種疾病的發(fā)生與遷移有著密切的聯(lián)系，這已經(jīng)成為近年來疾病機(jī)制研究的重點(diǎn)領(lǐng)域，而對lncRNA的結(jié)構(gòu)與功能的深入了解，則有望為疾病的治療提供新的思路。