抑制山藥中多酚氧化酶活性的研究

段 勇

（江西省食品發(fā)酵研究所，江西宜春 336000）

山藥，別名薯芋、薯藥為薯科多年生草本植物薯芋的塊根，冬季采挖，原產(chǎn)于亞熱帶，在我國已有幾百年的栽培歷史。山藥營養(yǎng)豐富，供應(yīng)時間長，適口性強，是深受人們喜食的蔬菜。山藥除具有較廣泛的食用價值外，還有較豐富的藥用價值。其最大的特點是能夠供給人體大量的黏液蛋白質(zhì)，對人體有特殊的保健作用，能預(yù)防心血管系統(tǒng)的脂肪沉積，保持血管脈粥樣硬化過早發(fā)生，減少皮下脂肪沉積，避免出現(xiàn)肥胖。作為高營養(yǎng)食品，山藥中含有大量淀粉、蛋白質(zhì)、B族維生素、維生素C、維生素E、葡萄糖、粗蛋白氨基酸、膽汁堿（choline）、尿囊素（allantoin）等。其中重要的營養(yǎng)成分薯蕷皂是合成女性荷爾蒙的先驅(qū)物質(zhì)，有滋陰補陽、增強新陳代謝的功效；而新鮮塊莖中含有的多糖蛋白成分的黏液質(zhì)、消化酵素等，可預(yù)防心血管脂肪沉積，有助于胃腸的消化吸收。

但是山藥在貯藏及加工過程中，尤其是山藥去皮、切塊后很容易產(chǎn)生褐變，主要原因是山藥組織中的多酚氧化酶（PPO）及多酚類物質(zhì)含量比較高，在有氧氣存在的情況下，由多酚氧化酶（PPO）催化，內(nèi)源的酚類物質(zhì)生成鄰醌，鄰醌再相互聚合成醌或與蛋白質(zhì)、氨基酸等作用生成高分子絡(luò)合物而導致褐色素的生成，色素分子量愈高，顏色愈暗，從而導致褐變。

褐變不僅影響山藥的外觀，更重要的是降低了山藥的營養(yǎng)價值。本試驗通過對引起酶促反應(yīng)的多酚氧化酶（PPO）活性的研究，探討了pH值、溫度、護色液（主要是添加抑制多酚氧化酶活性的抗氧化劑）等對山藥褐變的影響，并據(jù)此提出抑制山藥中多酚氧化酶活性的條件和方法，旨在為生產(chǎn)過程中防止山藥褐變提供一定的理論依據(jù)。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗原料

山藥，購于農(nóng)貿(mào)市場，新鮮、未破損。

1.1.2 主要試劑

檸檬酸，上海試劑一廠；磷酸氫二鈉，廣州市重華化工有限公司；抗壞血酸，成都科龍化工試劑廠；EDTA，廣東汕頭市西隴化工廠；鄰苯二酚，國藥集團化學試劑有限公司。所用試劑均為分析純。

1.2 主要試驗儀器

723型可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司；GL-20B型冷凍離心機，上海安亭科學儀器廠；HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司；TG328A分析天平，上海精密科學儀器有限公司；電熱恒溫干燥箱，上海躍進醫(yī)療器械廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 山藥中PPO活性的測定

1.3.1.1 粗酶液的提取

稱取10 g已去皮的新鮮山藥，迅速用不銹鋼刀片切片，然后轉(zhuǎn)入研缽中，加入0.05 mol/L、pH值為5.6的磷酸緩沖溶液10 mL，研磨成勻漿。將勻漿轉(zhuǎn)入離心管，在2℃～6℃、10 000 r/min離心15 min，上清液過濾后轉(zhuǎn)入50 mL容量瓶中，用0.05 mol/L、pH值為5.6的磷酸緩沖溶液定容至刻度。再從50 mL容量瓶中移取5 mL酶液轉(zhuǎn)入25 mL容量瓶中，用0.05 moL/L、pH值為5.6的磷酸緩沖溶液定容至刻度，4℃保存，等待PPO測定。

1.3.1.2 PPO活性的測定

空白對照：3 mL 0.05 moL/L、pH值為5.6的磷酸緩沖溶液+2 mL0.2 moL/L的鄰苯二酚溶液，再加入1.0 mL在沸水中加熱6 min的粗酶液，混勻。

反應(yīng)體系：3 mL 0.05 moL/L、pH值為5.6的磷酸緩沖溶液+2 mL0.2 moL/L的鄰苯二酚溶液，再加入1.0 mL粗酶液，混勻。溶液混勻后開始計時，在420 nm處測其吸光度（OD），每30 s記錄1次，共記錄5 min。以初始直線段的斜率（OD/t）計算酶活力。在測定條件下，每分鐘引起吸光度改變0.001所需的酶量定義為1個相對酶活力單位。

1.3.2 pH值對PPO活性的影響

配制 pH 值為 2.4、2.8、3.2、3.6、4.0、4.4、4.8、5.2、5.6、6.0、6.4、6.8、7.2的系列磷酸緩沖液，按上述方法測定不同pH值的緩沖液與酶液及底物混勻后的吸光度，計算出PPO的相對活性。

1.3.3 溫度對PPO活性的影響

以2.0 mL 0.2 moL/L的鄰苯二酚為底物，加入pH值5.6的磷酸緩沖溶液3.0 mL，分別在0℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃保溫6 min，對應(yīng)加入相同溫度下保溫6 min的PPO粗酶液1.0 mL，混勻迅速后測定吸光度，計算出PPO的相對活性。

1.3.4 護色液配比對PPO活性的影響

參照《GB2760食品添加劑使用標準》中蔬菜抗氧化劑最大使用量，配制不同質(zhì)量分數(shù)EDTA、抗壞血酸與檸檬酸混合護色液，將山藥去皮，切成不同厚度薄片浸在護色液中護色3.5 h，瀝干后依據(jù)前述方法制成粗酶液，在pH值5.6的緩沖液中測定其PPO活性。以未經(jīng)過護色的山藥制得的酶液為對照，比較不同配比護色液對山藥多酚氧化酶的抑制作用。試驗以不同山藥切片厚度、EDTA質(zhì)量分數(shù)、抗壞血酸質(zhì)量分數(shù)與檸檬酸質(zhì)量分數(shù)為研究因素，以PPO相對活性為考察指標，設(shè)計四因素三水平正交試驗對護色條件進行優(yōu)化，因素水平見表1。

表1 山藥護色正交試驗因素水平

2 結(jié)果與分析

2.1 pH值對PPO活性的影響

試驗結(jié)果見下頁圖1。

圖1 pH與PPO相對活性的關(guān)系

由圖1可知，pH在2.4～5.6之間，山藥中多酚氧化酶（PPO）的活性隨pH值的升高而增強，到達pH5.6時活力最強；在pH5.6～7.2之間，隨pH值的升高明顯減弱，升高到pH7.2時，多酚氧化酶（PPO）的活性趨近為零；酶活性最高時的pH值為5.6。pH值對PPO活性的影響顯著，通過調(diào)節(jié)pH值能有效抑制PPO的活力。因此，在抑制山藥中多酚氧化酶（PPO）的活性時應(yīng)當考慮到pH值的影響，以pH值2.4或pH值7.2時較為適宜。

2.2 溫度對PPO活性的影響

試驗結(jié)果見圖2。

圖2 溫度與PPO相對活性的關(guān)系

由圖2可知，在0℃～35℃之間，山藥中多酚氧化酶（PPO）的活性隨溫度的升高而增強，35℃時最高；當溫度繼續(xù)上升，即在35℃～65℃之間時，山藥中多酚氧化酶（PPO）的活性隨溫度的升高而下降。溫度的變化對酶的活性影響很大，酶的活性在溫度下降到20℃以下或升高到50℃以上后顯著降低。雖然高溫度能抑制多酚氧化酶（PPO）的活性，但考慮對其他營養(yǎng)成的影響，山藥貯藏溫度選擇5℃比較合適。

2.3 混合護色液抑制PPO活性正交試驗結(jié)果

不同配比EDTA、抗壞血酸與檸檬酸混合護色液對不同切片厚度山藥PPO活性抑制正交試驗結(jié)果見表2。

表2 正交試驗結(jié)果

由表2可以看出，影響山藥PPO活性各因素的主次為：C＞D＞B＞A，即抗壞血酸質(zhì)量分數(shù)＞檸檬酸質(zhì)量分數(shù)＞EDTA質(zhì)量分數(shù)＞樣品厚度；優(yōu)化的護色條件為A1B1C2D1，即山藥切片厚度3 mm、EDTA質(zhì)量分數(shù)0.03%、抗壞血酸質(zhì)量分數(shù)0.4%、檸檬酸質(zhì)量分數(shù)0.5%。由于正交試驗中無此試驗條件組合，因此還需進行驗證性試驗。驗證試驗結(jié)果表明，此條件下山藥PPO相對活性為18.1%，能較好地抑制山藥的酶促褐變。

3 小結(jié)與討論

pH值與溫度對山藥中多酚氧化酶（PPO）活性的影響研究結(jié)果表明，能夠有效抑制山藥中多酚氧化酶（PPO）活性的pH值應(yīng)控制在2.4或7.2左右；能夠有效抑制山藥中多酚氧化酶（PPO）活性的溫度應(yīng)該控制在5℃左右。

采用L9（34）四因素三水平正交試驗研究山藥的護色條件，優(yōu)化的護色條件為A1B1C2D1，即將3 mm厚鮮切山藥置于EDTA質(zhì)量分數(shù)0.03%、抗壞血酸質(zhì)量分數(shù)0.4%、檸檬酸質(zhì)量分數(shù)0.5%的混合護色液中浸泡3.5 h后，山藥片色澤乳白、質(zhì)地均勻尚好、無褐變現(xiàn)象，能較好地抑制山藥的酶促褐變，具有很好的護色效果。