牙周炎患者病原菌感染狀況及RANKL/OPG變化

劉勇剛， 施立煌， 張子楊， 賈 忠

（1.浙江理工大學(xué)校醫(yī)院口腔科，浙江 杭州 310018；2.杭州市大江東醫(yī)院檢驗(yàn)科，浙江 杭州 311225；3.杭州植得口腔門診部口腔科，浙江 杭州 310003；4.杭州市第一人民醫(yī)院普外科，浙江 杭州 310006）

牙周炎是一種常見(jiàn)的慢性口腔炎癥，其特征是牙周組織受損，牙周附著被破壞，易造成根面牙骨質(zhì)的病理性改變，表現(xiàn)為牙周袋和牙齒松動(dòng)或缺失，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[1]。牙周炎通常因口腔病原菌感染而被引發(fā)，核因子κB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand，RANKL）/骨保護(hù)素（osteoprotegerin，OPG）系統(tǒng)是骨代謝的信號(hào)通路，病原菌及炎癥因子通過(guò)調(diào)節(jié)RANKL/OPG，使其比例失調(diào)，導(dǎo)致牙槽骨吸收[2-3]。為了探討牙周炎患者病原菌感染狀況及RANKL/OPG變化，為牙周炎的臨床預(yù)防與治療提供理論依據(jù)和針對(duì)性指導(dǎo)，我們對(duì)接受治療的牙周炎患者進(jìn)行了研究。

1 材料和方法

1.1 一般資料

選取2015年6月—2017年6月在浙江理工大學(xué)校醫(yī)院接受口腔科治療的130例牙周炎患者作為觀察組，其中男71例、女59例，年齡（41.80±7.66）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）牙齦溝液培養(yǎng)陽(yáng)性，臨床表現(xiàn)為牙齦疼痛、紅腫，探診牙齦出血、牙周溢膿或松動(dòng)，牙槽骨吸收等癥狀；（2）經(jīng)X線檢查確診牙周炎。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）有牙周疾病治療史者；（2）合并高血壓、心臟病者；（3）哺乳和妊娠期婦女。另選取同期同院體檢健康者50名作為對(duì)照組，其中男26例，女24例，年齡（42.71±9.05）歲。2組性別、年齡等一般資料差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本研究在杭州市第一人民醫(yī)院倫理委員會(huì)的許可下開(kāi)展，所有研究對(duì)象知情同意。

1.2 方法

選取每位患者2顆牙，采用探針測(cè)量2組受檢者的牙周探診深度（probing depth，PD）、附著喪失（attachment loss，AL）、菌斑指數(shù)（plaque index，PLI）和齦溝出血指數(shù)（sulcus bleeding index，SBI）等指標(biāo)。PD 為牙周袋底部到牙齦緣的距離，AL為探針深度減去釉牙骨質(zhì)界與齦緣之間的距離。PLI采用Loe和Silness菌斑指數(shù)分度法計(jì)分，按照菌斑程度計(jì)為0、1、2、4分（無(wú)出血計(jì)1分，齦溝輕度出血計(jì)2分，牙齦發(fā)紅但未見(jiàn)紅腫計(jì)3分，牙齦潰爛計(jì)4分）。

采用濾紙條法收集齦溝液。在牙周探診最深位點(diǎn)處收集齦溝液樣本。收集部位隔濕，去除齦上牙石，溫空氣輕吹10 s，用濾紙條輕輕插入齦袋，30 s后取出濾紙條，10 s后在同一部位再次取樣。重復(fù)取樣3次后稱重，將重量差按1 mg/μL的比例換算成體積。樣本于-70 ℃冷凍保存。

取出樣本，置室溫?fù)u床中解凍，4 ℃??5 000×g離心5 min，去除濾紙條。采用聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測(cè)齦溝液中病原菌分布的情況，首先應(yīng)用微量樣品基因組提取試劑盒（南京森貝伽生物科技有限公司）提取齦溝液中的DNA，-20 ℃保存，所檢測(cè)菌種的 16sRNA引物由南京森貝伽生物科技有限公司提供，建立實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系，對(duì)PCR擴(kuò)增的熔解曲線進(jìn)行測(cè)序，以同源性 ≥99%為標(biāo)準(zhǔn)判定目標(biāo)菌。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司）測(cè)定上清液 RANKL和OPG水平，嚴(yán)格按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.3 觀察指標(biāo)

（1）比較2個(gè)組受檢牙的PD、AL、PLI和SBI。（2）統(tǒng)計(jì)觀察組患者的病原菌分布。（3）比較2個(gè)組的齦溝液RANKL、OPG及RANKL/OPG。（4）統(tǒng)計(jì)觀察組的臨床檢查結(jié)果（PD、AL、PLI和SBI）與RANKL、OPG的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以x ±s表示，2個(gè)組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以[例（%）]表示，采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床檢查結(jié)果

觀察組受檢牙的 PD、AL、PLI和SBI顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 觀察組和對(duì)照組的PD、AL、PLI和SBI比較 （x±s）

2.2 觀察組與對(duì)照組病原菌分布

觀察組共檢出病原菌171株，對(duì)照組共檢出病原菌19株。觀察組的齦卟啉單胞菌、伴放線放線菌和生痰二氧化碳嗜纖維菌的檢出率較高，均超過(guò)20%，牙齦卟啉單胞菌、伴放線放線菌、生痰二氧化碳嗜纖維菌和齒蝕擬桿菌的檢出率明顯高于對(duì)照組（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 觀察組與對(duì)照組病原菌分布

2.3 觀察組與對(duì)照組RANKL和OPG水平的比較

觀察組齦溝液中的RANKL水平高于對(duì)照組，OPG水平低于對(duì)照組，RANKL/OPG也高于對(duì)照組（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 觀察組和對(duì)照組RANKL、OPG水平及RANKL/OPG的比較 （x±s）

2.4 臨床檢查結(jié)果與RANKL、OPG水平的相關(guān)性

牙周炎患者的OPG水平與PD和AL存在負(fù)相關(guān)關(guān)系（P＜0.05），RANKL水平、RANKL/OPG/與PD和AL無(wú)相關(guān)性（P＞0.05），RANKL水平、OPG水平及RANKL/OPG與PLI和SBI均無(wú)相關(guān)性（P＞0.05）。見(jiàn)表4。

表4 RANKL、OPG和RANKL/OPG與PD、AL、PLI、SBI的相關(guān)系數(shù)

3 討論

牙周炎主要表現(xiàn)為牙齦炎癥、牙周組織受損、牙槽骨吸收，牙齒根基動(dòng)搖，與身體其他部位的健康密切相關(guān)[4]。牙周炎通常因口腔內(nèi)病原菌感染所致，牙周病患者因牙周組織受到破壞、上皮根遷移，使其暴露于口腔，而牙根表面的菌斑及細(xì)菌等滲入牙本質(zhì)中，引發(fā)牙周炎[5-6]。研究牙周炎病原菌感染狀況及RANKL/OPG變化，有利于指導(dǎo)牙周炎的預(yù)防和治療[7]。

本研究結(jié)果顯示，牙周炎患者受檢牙的PD、AL、PLI和SBI均顯著高于體檢健康者，結(jié)果符合患者的臨床癥狀。牙齦卟啉單胞菌、伴放線放線菌、生痰二氧化碳嗜纖維菌等是牙周炎的主要致病菌。有研究結(jié)果表明，伴放線放線菌是局限型侵襲性牙周炎的主要病原菌，牙齦卟啉單胞菌是慢性牙周炎病變區(qū)或活動(dòng)部位最主要的優(yōu)勢(shì)菌，其存在與牙周炎治療后復(fù)發(fā)或病情加重密切相關(guān)，重度牙周炎患者齦下菌斑的福賽坦氏菌檢出率較高[8-10]，與本研究結(jié)果基本一致。患者感染病原菌的原因可能是口腔衛(wèi)生條件較差、刷牙習(xí)慣不健康、吸煙、合并其他基礎(chǔ)性疾病等[11]。

RANKL和OPG是牙周炎牙槽骨吸收的重要調(diào)節(jié)因子，其比值可以作為評(píng)價(jià)牙槽骨吸收程度的指標(biāo)[12-13]。正常狀態(tài)下，RANKL的表達(dá)弱于OPG，破骨細(xì)胞生成較少，牙周內(nèi)環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定，而牙周炎患者的成骨細(xì)胞內(nèi)RANKL的表達(dá)明顯增高，牙周局部微環(huán)境RANKL和OPG的平衡失調(diào)，破骨活動(dòng)活躍，促進(jìn)破骨細(xì)胞形成引起的骨質(zhì)吸收，牙槽骨發(fā)生過(guò)量吸收，影響其骨密度和骨強(qiáng)度[14-15]。本研究結(jié)果也顯示，牙周炎患者齦溝液中RANKL水平顯著高于體檢健康者，OPG水平明顯低于體檢健康者，RANKL/OPG高于體檢健康者。

此外，本研究結(jié)果還顯示，OPG水平與PD和AL存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，RANKL、OPG及RANKL/OPG與患者的PLI和SBI之間無(wú)相關(guān)關(guān)系，說(shuō)明患病程度與牙槽骨的吸收沒(méi)有必然的因果關(guān)系，糾正RANKL和OPG之間的失衡，可能為慢性牙周炎的治療提供新的思路。

綜上所述，牙齦卟啉單胞菌、伴放線放線菌、生痰二氧化碳嗜纖維菌等病原菌是牙周炎的主要致病菌，RANKL和OPG在牙周炎患者牙槽骨組織被破壞的過(guò)程中發(fā)揮作用。