急性髓性白血病患者淋巴細(xì)胞中CD39+CD4+CD25+T細(xì)胞比例與預(yù)后的相關(guān)性

章梁君， 鐘輝秀， 楊新春

（自貢市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川 自貢 643000）

急性髓性白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）是一種原始細(xì)胞在骨髓中快速增殖的高度異質(zhì)性疾病[1]。在我國，AML的總體發(fā)病率為2.76例/10萬人[2]，且有逐漸增高的趨勢。AML的發(fā)病機(jī)制目前尚不完全明確，骨髓微環(huán)境可能在AML的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。白血病細(xì)胞會產(chǎn)生許多免疫抑制因子，導(dǎo)致腫瘤的生長難以控制[3]。有研究結(jié)果顯示，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在保持自身耐受和調(diào)節(jié)生理、病理狀態(tài)的免疫應(yīng)答方面起重要作用[4]。還有研究結(jié)果顯示，非小細(xì)胞肺癌、卵巢癌、胃癌和急性白血病患者外周血CD39+CD4+CD25+T細(xì)胞比例顯著升高[5-6]。CD4+CD25+T細(xì)胞的不同亞群通過不同的機(jī)制在免疫抑制中起不同的作用。CD39作為免疫抑制因子中非常重要的分子，可將細(xì)胞外的三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）水解成腺苷二磷酸（adenosine diphosphate，ADP）和腺苷一磷酸（adenosine monophosphate，AMP），并通過這些水解產(chǎn)物發(fā)揮免疫抑制作用。免疫性疾病和腫瘤患者，尤其是慢性淋巴細(xì)胞性白血病患者CD4+CD25+T細(xì)胞CD39表達(dá)增加[7]。目前，尚未見CD39+CD4+CD25+T細(xì)胞比例在AML中的潛在功能及其與AML臨床特征和進(jìn)展關(guān)系的報道。為此，本研究擬探討AML患者CD39+CD4+CD25+T細(xì)胞比例與AML臨床特征的相關(guān)性及其在疾病過程中的變化。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2014年1月—2015年12月自貢市第一人民醫(yī)院確診的、未經(jīng)治療的AML患者157例，其中男84例、女73例，年齡（45±16）歲，根據(jù)法美英（French-American-British，F(xiàn)AB）形態(tài)學(xué)分型標(biāo)準(zhǔn)及2008年世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）造血和淋巴組織腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)中的免疫表型標(biāo)準(zhǔn)，將患者分為AML-M1組（23例）、AML-M2組（40例）、AML-M3組（25例）、AML-M4組（37例）和AML-M5組（32例）5個亞組。排除已治療患者、伴有其他腫瘤患者、自身免疫性疾病患者、病毒感染患者、混合型白血病患者及慢性白血病急性轉(zhuǎn)化患者。另選取同期自貢市第一人民醫(yī)院體檢健康者41名作為正常對照組，其中男23名、女18名，年齡（48±11）歲。AML患者和正常對照者性別、年齡差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。本研究經(jīng)自貢市第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 方法

采集所有研究對象靜脈血2 mL，乙二胺四乙酸二鉀抗凝。收集AML患者的臨床特征（年齡、性別）和各項(xiàng)檢查[血常規(guī)、骨髓報告中原始細(xì)胞比例、骨髓免疫表型、胸腹部B超、電子計算機(jī)斷層掃描（computed tomography，CT）或磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）、腦脊液檢查]結(jié)果。白血病的髓外浸潤定義為骨髓以外的其他組織或臟器發(fā)現(xiàn)有白血病細(xì)胞浸潤的證據(jù)。髓外浸潤的判定標(biāo)準(zhǔn)基于CT或MRI及腦脊液檢查結(jié)果。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)分析

取CD45-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）（美國Beckman-Coulter公司）、CD39-藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）（美國eBioscinece公司）、CD4-藻紅蛋白花青苷5（phycoerythrin cyanin 5，PC5）（美國Beckman-Coulter公司）和CD25-藻紅蛋白德州紅（energy coupled dye，ECD）（美國Beckman-Coulter公司）抗體各10 μL，連同種型對照抗體一并加入到100 μL全血中，在室溫、黑暗環(huán)境中孵育15 min。加入2 mL 1×紅細(xì)胞（red blood cell，RBC）裂解緩沖液（美國Beckman-Coulter公司）裂解RBC。用磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）洗滌細(xì)胞2次。通過EPICS XL流式細(xì)胞儀（美國Beckman-Coulter公司）獲得至少10 000個細(xì)胞并進(jìn)行分析。使用相應(yīng)的同種型對照抗體門控陰性細(xì)胞。采用EXPO32 ADC XL4和EXPO32 ADC分析軟件分析結(jié)果。根據(jù)形態(tài)學(xué)參數(shù)[CD45/側(cè)向角散射（side scatter，SSC）]篩選淋巴細(xì)胞群。計算淋巴細(xì)胞中CD3+CD4+CD25+CD39+T細(xì)胞的百分比。根據(jù)CD39+CD4+CD25+T細(xì)胞占淋巴細(xì)胞的比例將AML患者分為3組：低水平組（CD39+CD4+CD25+T細(xì)胞＜5%，35例）、中水平組（CD39+CD4+CD25+T細(xì)胞為5%～10%，60例）和高水平組（CD39+CD4+CD25+T細(xì)胞 ＞10%，62例）。為排除CD4+CD25+T細(xì)胞比例對CD39+CD4+CD25+T細(xì)胞比例的影響，根據(jù)CD4+CD25+T細(xì)胞比例將AML患者分為低水平組（CD4+CD25+T細(xì)胞＜8.8%，35例）、中水平組（CD4+CD25+T細(xì)胞為8.8%～14.9%，60例）和高水平組（CD4+CD25+T細(xì)胞＞14.9%，62例），分析3組髓外浸潤及CD34、CD7的表達(dá)情況。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。呈正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以x ±s表示，2個組之間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析。呈非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以中位數(shù)（M）[四分位數(shù)（P25～P75）]表示，采用Cruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)。計數(shù)資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。繪制Kaplan-Meier曲線表示化療緩解持續(xù)時間。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AML組與正常對照組CD39+CD4+CD25+T細(xì)胞比例的比較

AML組及各亞組CD39+CD4+CD25+T細(xì)胞比例均明顯高于正常對照組（P＜0.05），其中AML-M2組CD39+CD4+CD25+T細(xì)胞比例最高（12.85%），AML-M1組最低（5.51%）。AML組與正常對照組之間CD4+CD25+T細(xì)胞比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），但AML-M1患者明顯低于正常對照者（P＜0.05）、AML-M2患者明顯高于正常對照者（P＜0.05）。見表1、圖1。

表1 AML組與正常對照組CD4+CD25+T細(xì)胞比例和CD39+CD4+CD25+T細(xì)胞比例的比較 （%，x±s）

圖1 正常對照組及AML各亞組CD39+CD4+CD25+T細(xì)胞比例的分布

2.2 不同CD39+CD4+CD25+T細(xì)胞和CD4+ CD25+T細(xì)胞水平組AML患者各項(xiàng)檢查結(jié)果的比較

CD39+CD4+CD25+T細(xì)胞低水平組、中水平組和高水平組髓外浸潤比例及骨髓原始細(xì)胞CD34、CD7陽性率依次升高，各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。RBC計數(shù)、白細(xì)胞（white blood cell，WBC）計數(shù)、血紅蛋白（hemoglobin，Hb）、血小板（platelet，PLT）計數(shù)、肝脾腫大患者比例、骨髓原始細(xì)胞比例和原始細(xì)胞表達(dá)人類白細(xì)胞抗原-DR（human leukocyte antigen-DR，HLA-DR）、CD56、CD19的比例3組之間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

CD4+CD25+T細(xì)胞低水平組、中水平組和高水平組之間髓外浸潤比例及CD34、CD7陽性率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表2 CD39+CD4+CD25+T細(xì)胞低水平組、中水平組、高水平組各項(xiàng)檢查結(jié)果的比較

表3 CD4+CD25+T細(xì)胞低水平組、中水平組和高水平組各項(xiàng)指標(biāo)的比較

2.3 CD39+CD4+CD25+T細(xì)胞比例和CD4+CD25+T細(xì)胞比例與化療間隔時間的關(guān)系

157例AML患者中有33例接受DA（柔紅霉素和阿糖胞苷）標(biāo)準(zhǔn)化療，包括5例AML-M1患者、7例AML-M2患者、12例AML-M4患者和9例AML-M5患者。本研究記錄患者1年中的下次治療時間（time to next treatment，TTT），即從首次活動性發(fā)病治療開始到下一次治療之間的間隔時間。與CD39+CD4+CD25+T細(xì)胞低水平組比較，中水平組和高水平組TTT較短（P＜0.05）。CD4+CD25+T細(xì)胞低水平組、中水平組和高水平組之間TTT差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2、圖3。

圖2 不同CD39+CD4+CD25+T細(xì)胞比例AML患者的Kaplan-Meier曲線

圖3 不同CD4+CD25+T細(xì)胞比例AML患者的Kaplan-Meier曲線

3 討論

CD39作為多個細(xì)胞表面的關(guān)鍵酶，可將細(xì)胞外的核苷三磷酸（nucleoside triphosphate，NTP）分解成核苷二磷酸（nucleoside diphosphate，NDP）和核苷一磷酸（nucleoside monophosphate，NMP）。核苷酸的分解代謝產(chǎn)物可能對多種生理、病理過程產(chǎn)生影響，如血液凝固、血管生成、炎癥、免疫、增殖和凋亡。有研究結(jié)果顯示，CD4+CD25+T細(xì)胞上表達(dá)的CD39可將ATP分解為腺苷，CD39是能抑制免疫反應(yīng)活性的物質(zhì)[8]。AML是一種惡性血液病，其白血病細(xì)胞產(chǎn)生的免疫抑制因子可導(dǎo)致腫瘤生長失控[3]。CD39+CD4+CD25+T細(xì)胞可誘導(dǎo)抗腫瘤免疫反應(yīng)減弱，使疾病進(jìn)一步惡化[9]，其免疫抑制作用部分歸因于胞外水解酶CD39水解ATP的重要作用[10]。

本研究結(jié)果顯示，AML組CD4+CD25+T細(xì)胞比例與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而CD39+CD4+CD25+T細(xì)胞比例明顯高于正常對照組（P＜0.05）。AML-M1患者CD4+CD25+T細(xì)胞比例明顯低于正常對照者（P＜0.05），而CD39+CD4+CD25+T細(xì)胞比例則明顯高于正常對照者（P＜0.05），說明AML-M1患者CD39+比例升高最為明顯。AML-M2患者CD4+CD25+T細(xì)胞比例和CD39+CD4+CD25+T細(xì)胞比例均明顯高于正常對照者，因此不排除CD39+的升高是由CD4+CD25+T細(xì)胞比例升高所致。DULPHY等[11]的研究結(jié)果顯示，與正常對照者相比，AML患者CD4+T細(xì)胞中CD39+T細(xì)胞比例更高，與本研究結(jié)果一致。還有研究結(jié)果顯示，各種實(shí)體腫瘤如頭頸腫瘤、結(jié)腸癌直腸癌、肝癌和胃癌，特別是慢性淋巴細(xì)胞白血病，其臨床分期與CD39水平相關(guān)，患者的CD39表達(dá)水平明顯升高[12-13]。

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是CD4+T細(xì)胞的重要亞群，其在維持免疫系統(tǒng)的體內(nèi)平衡和對抗外來抗原的過度免疫應(yīng)答中起至關(guān)重要的作用。在腫瘤微環(huán)境中，CD39+CD4+CD25+T細(xì)胞主要通過多個表面分子、細(xì)胞接觸依賴和細(xì)胞因子分泌來介導(dǎo)免疫抑制反應(yīng)。近年來，學(xué)者們已發(fā)現(xiàn)了CD39-CD73腺苷途徑的新作用。CD39是胞外核苷酸酶的級聯(lián)限速酶，其產(chǎn)生的腺苷可抑制CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的功能以及自然殺傷細(xì)胞的抗腫瘤活性[14]。本研究結(jié)果顯示，CD39+CD4+CD25+T細(xì)胞高水平組發(fā)生髓外浸潤比例較高，TTT更短；但CD4+CD25+T細(xì)胞低、中、高水平組之間髓外浸潤和TTT差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。說明CD39+CD4+CD25+T細(xì)胞比例較高的AML患者病情更為嚴(yán)重，預(yù)后更差[7]。CD4+CD25+T細(xì)胞上的CD39表達(dá)或可作為AML患者的預(yù)后標(biāo)志，但還需要進(jìn)一步研究來證實(shí)。

此外，本研究結(jié)果還顯示骨髓中原始細(xì)胞表達(dá)CD34和CD7的AML患者CD39+CD4+CD25+T細(xì)胞比例更高。1989年，HAYNES等[15]從AML患者分離出白血病干細(xì)胞，證實(shí)只有表達(dá)CD34的白血病細(xì)胞才能形成集落，CD34可能是腫瘤干細(xì)胞的細(xì)胞表面標(biāo)志物。本研究結(jié)果顯示，原始細(xì)胞CD34陽性組CD39+CD4+CD25+T細(xì)胞高水平組患者比例（72.58%）明顯高于CD34陰性組（27.42%）。有研究結(jié)果顯示，CD34可通過改變CD4+細(xì)胞的分子組成對免疫抑制反應(yīng)產(chǎn)生影響[16]。因此，原始細(xì)胞表達(dá)CD34在改變CD4+淋巴細(xì)胞CD39表達(dá)中起著一定的作用。CD7是一種糖蛋白，是T細(xì)胞發(fā)育中的特征標(biāo)志物之一，曾被證實(shí)在分化成T細(xì)胞、B細(xì)胞和髓細(xì)胞的多能造血干細(xì)胞中表達(dá)。有研究結(jié)果顯示，白血病細(xì)胞也可表達(dá)CD7和CD34[17]，說明CD7分子是一種早期分子標(biāo)志物。本研究結(jié)果顯示，CD39+CD4+CD25+T細(xì)胞比例升高與細(xì)胞發(fā)育階段可能存在聯(lián)系，但仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。同時，CD7和CD34也是AML患者預(yù)后差的標(biāo)志物[18]。因此，CD39+CD4+CD25+T細(xì)胞比例可能與AML預(yù)后有關(guān)。

總之，AML患者CD39+T細(xì)胞比例明顯增高，可能與AML患者髓外浸潤、CD34陽性率、CD7陽性率及預(yù)后有關(guān)。由此可見，AML患者CD39+T細(xì)胞比例增高可能是白血病細(xì)胞的重要免疫逃逸機(jī)制。CD39或可作為AML疾病發(fā)展的新標(biāo)志物和新治療靶點(diǎn)。