2012—2016年上海地區(qū)AIDS患者分枝桿菌分離及耐藥情況分析

蔡金鳳， 張桂紅， 鄭江花

（1. 上海市公共衛(wèi)生臨床中心醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，上海 201508；2. 上海健康醫(yī)學(xué)院附屬周浦醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 201318）

獲得性免疫缺陷綜合征（acquired immune deficiency syndrome，AIDS）是由人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）感染引起的慢性傳染病，主要通過血液和性行為傳播。HIV攻擊人體免疫細(xì)胞，引起機(jī)體免疫力下降，從而繼發(fā)各種機(jī)會(huì)性感染，是AIDS患者主要死因之一[1-2]。近年來，HIV感染合并結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）感染已成為公共衛(wèi)生系統(tǒng)的重大問題。分離自AIDS患者的大量非結(jié)核分枝桿菌（nontuberculous Mycobacterium，NTM）[3]，進(jìn)一步提示為AIDS患者合并分枝桿菌感染的防治提供新策略已經(jīng)迫在眉睫。上海市公共衛(wèi)生臨床中心為上海地區(qū)AIDS患者唯一定點(diǎn)收治醫(yī)院，為了解本地區(qū)AIDS患者分枝桿菌感染狀況及藥物敏感情況，本研究對(duì)上海市公共衛(wèi)生臨床中心2012—2016年收治的所有AIDS患者分枝桿菌分離及耐藥情況進(jìn)行分析。

1 材料和方法

1.1 樣本來源

收集2012年7月—2016年12月上海市公共衛(wèi)生臨床中心收治的1 940例AIDS住院患者所有送檢分枝桿菌培養(yǎng)的臨床樣本，包括痰液、灌洗液、尿液、糞便、穿刺液、胸水、腹水、分泌物、引流液、支刷物、全血和腦脊液等。同一患者相同樣本類型的同一分離菌株不重復(fù)計(jì)算。

1.2 儀器與試劑

美國(guó)BD公司BACTEC MGIT 960全自動(dòng)分枝桿菌檢測(cè)系統(tǒng)和SIRE系列試劑盒、BACTEC9120血液培養(yǎng)系統(tǒng)及配套培養(yǎng)瓶；美國(guó)Sigma-Aldrich公司生產(chǎn)的改良中性羅氏培養(yǎng)基；杭州創(chuàng)新生物檢控技術(shù)有限公司生產(chǎn)的凱必利MTB抗原檢測(cè)試劑盒（膠體金法）。所有AIDS患者均經(jīng)過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和免疫印跡法（western blot，WB）確診HIV抗體陽性。

1.3 方法

1.3.1 分枝桿菌分離培養(yǎng) 非血液樣本采用BACTEC MGIT 960全自動(dòng)分枝桿菌液體培養(yǎng)技術(shù)、血液樣本接種于含溶血素分枝桿菌/真菌瓶，采用BACTEC9120血液培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行分枝桿菌培養(yǎng)。

1.3.2 分枝桿菌菌型鑒定 采用MTB抗原檢測(cè)試劑盒（膠體金法）對(duì)分枝桿菌進(jìn)行菌型鑒定，區(qū)分MTB和NTM。

（1）固體培養(yǎng)基培養(yǎng)物處理方法。用培養(yǎng)抗酸菌的固體培養(yǎng)基（如改良羅氏培養(yǎng)基）37°C培養(yǎng)2～4周，直至培養(yǎng)基上能確認(rèn)菌落生長(zhǎng)為止。步驟為：在試管中加入0.2 mL生理鹽水，從培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落中采集菌體1 μL，將采集的菌體懸混在試管內(nèi)的緩沖液中，試管加蓋后用渦旋混合器充分?jǐn)嚢?，將懸濁的菌液作為樣本待測(cè)。

（2）液體培養(yǎng)基培養(yǎng)物處理方法。用培養(yǎng)抗酸菌的液體培養(yǎng)基37°C培養(yǎng)1～2周，直至能確認(rèn)菌落生長(zhǎng)、培養(yǎng)液渾濁為止。攪拌培養(yǎng)容器內(nèi)的培養(yǎng)液，將其作為樣本待測(cè)。

（3）分枝桿菌菌型鑒定。將100 μL樣本滴到檢測(cè)板，15 min后觀察，判定方法為：檢測(cè)線（T）及質(zhì)控線（C）均出現(xiàn)紫紅色條帶判定為MTB，僅質(zhì)控線（C）出現(xiàn)紫紅色條帶判定為NTM。

1.3.3 分枝桿菌藥物敏感性分析 采用《中國(guó)結(jié)核病防治規(guī)劃實(shí)施工作指南（2008）》[4]推薦的比例法進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，以改良中性羅氏培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，按照《結(jié)核菌檢驗(yàn)細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程》[5]的要求進(jìn)行操作。采用BACTEC MGIT 960全自動(dòng)分枝桿菌檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)分枝桿菌對(duì)一線抗結(jié)核藥物的敏感性，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2 結(jié)果

2.1 分枝桿菌分離情況

2012—2016年共送檢1 940例AIDS住院患者的分枝桿菌培養(yǎng)樣本4 648例，人均送檢樣本2.4例，其中分枝桿菌陽性樣本892例（19.19%）；1 940例AIDS患者中分枝桿菌感染者420例（21.65%）。分枝桿菌年度分布見表1。

2.2 不同類型樣本分枝桿菌分離情況

送檢樣本中以痰液及腦脊液樣本居多，二者的分枝桿菌分離率分別為20.08%和6.98%；而全血樣本5年內(nèi)僅送檢了37例，有31例分離出分枝桿菌。

2.3 MTB和NTM樣本分布情況

通過MTB抗原檢測(cè)試劑盒（膠體金法）對(duì)陽性樣本中的分枝桿菌進(jìn)行菌型鑒定，共鑒定出409株不重復(fù)菌株，其中MTB 199株（48.66%）、NTM 210株（51.34%）。MTB和NTM樣本來源均以痰液為主，分別占58.29%和71.43%；MTB樣本來源居第2位的為腦脊液，共19例（9.55%）；而以腦脊液為樣本來源的NTM則僅有3例（1.43%）。NTM除分離自痰液外，主要分離自全血和糞便樣本，分別為16例（7.62%）和15例（7.14%）。見表3。

表1 2012—2016年各年AIDS住院患者分枝桿菌檢出情況

表2 不同類型樣本分枝桿菌分離情況

2.4 MTB藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)128株MTB進(jìn)行一線抗結(jié)核藥物的耐藥分析。MTB對(duì)利福平、鏈霉素、乙胺丁醇和異煙肼的耐藥率分別為18.75%、28.13%、15.63%和32.03%。根據(jù)2013年世界衛(wèi)生組織對(duì)耐多藥結(jié)核?。╩ultidrug-resistant tuberculosis，MDRTB）的定義——結(jié)核病患者感染的MTB藥物敏感性試驗(yàn)證實(shí)至少同時(shí)對(duì)異煙肼和利福平耐藥，確定128株MTB菌株中，耐多藥結(jié)核分枝桿菌共23株，MDR-TB耐藥率為17.97%。

表3 MTB和NTM的本本分布情況

表4 128株MTB藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

NTM是指MTB及麻風(fēng)分枝桿菌以外的所有分枝桿菌。隨著人們對(duì)NTM認(rèn)識(shí)的深入以及分枝桿菌菌型鑒定技術(shù)的發(fā)展，NTM的檢出率也越來越高。NTM廣泛存在于自然環(huán)境中，包括土壤和水，為條件致病菌，目前尚無NTM在人與人之間相互傳播的證據(jù)。人類感染的NTM主要來源于生活環(huán)境，其中肺部NTM感染的病例較多[6]。對(duì)于AIDS等免疫缺陷患者，NTM的分離率也較高。近年來，NTM在AIDS患者中的感染上升趨勢(shì)明顯，成為AIDS合并機(jī)會(huì)性感染的重要病原體之一[7]。

目前，龜-膿腫分枝桿菌復(fù)合群和鳥-胞內(nèi)分枝桿菌復(fù)合群為人類主要NTM致病性菌種[8-10]。NTM感染患者常無明顯臨床癥狀，而肺部感染患者常表現(xiàn)出與MTB感染相似的癥狀，臨床難以區(qū)分[8]。由于NTM與MTB感染在致病機(jī)制和防治策略上存在差異，準(zhǔn)確區(qū)分MTB和NTM感染很有必要。現(xiàn)行的分枝桿菌菌種鑒定試驗(yàn)主要有傳統(tǒng)的對(duì)硝基苯甲酸（p nitro benzoicacid，PNB）/噻吩-2-羧酸酰肼（2-thiophenecarborylicacid hydrazide，TCH）改良羅氏法、免疫膠體金法或熒光探針聚合酶鏈反應(yīng)，傳統(tǒng)的PNB/TCH改良羅氏法將分枝桿菌初步分為結(jié)核復(fù)合群、牛結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌，但耗時(shí)較長(zhǎng)，需要28 h才能報(bào)告結(jié)果；熒光探針聚合酶鏈反應(yīng)雖然僅3 h即可報(bào)告結(jié)果，但需特殊儀器，對(duì)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境和技術(shù)人員要求高，在大部分基層實(shí)驗(yàn)室難以推廣。相比較而言，膠體金法各項(xiàng)分析指標(biāo)（敏感性、特異性、陽性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值）均高于PNB/TCH改良羅氏法，且檢測(cè)所需時(shí)間僅為15 min，與熒光探針聚合酶鏈反應(yīng)（3 d）和傳統(tǒng)法（28 d）比較，具有明顯優(yōu)勢(shì)。因此，培養(yǎng)法結(jié)合基于MPB64的膠體金法對(duì)分枝桿菌的鑒定具有快速、經(jīng)濟(jì)、操作方便、無須大型儀器投入的優(yōu)點(diǎn)，有望在結(jié)核病診斷中被廣泛應(yīng)用，是對(duì)現(xiàn)有結(jié)核病細(xì)菌學(xué)檢測(cè)手段的有益補(bǔ)充。

上海地區(qū)NTM感染情況目前尚未見文獻(xiàn)報(bào)道，胡忠義等[11]對(duì)上海地區(qū)1987—1996年分離自患者肺部的5 619株分枝桿菌做菌型鑒定時(shí)發(fā)現(xiàn)，2.3%的分枝桿菌為NTM。本研究通過分析1 940例AIDS住院患者分枝桿菌感染及NTM分離情況來推測(cè)NTM在AIDS等免疫缺陷患者中的流行狀況。從分枝桿菌分離情況來看，1 940例AIDS患者中有420例患者分枝桿菌培養(yǎng)陽性，陽性率達(dá)21.65%；共送檢患者樣本4 648例，陽性樣本892例，陽性檢出率為19.19%；共分離出不重復(fù)菌株409株，包含199株MTB（48.66%）和210株NTM（51.34%）。分枝桿菌分離鑒定結(jié)果提示上海地區(qū)AIDS患者中NTM感染比例較大，感染情況較MTB感染更為嚴(yán)重。樣本來源分布顯示，MTB和NTM主要分布在痰液樣本中。2012年，MCCARTHY等[3]對(duì)東南亞地區(qū)AIDS患者的NTM感染情況進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，來自越南、泰國(guó)和柬埔寨的AIDS患者中，有13%的患者合并MTB感染，11%的患者合并NTM感染；而泰國(guó)與越南AIDS患者NTM占分枝桿菌培養(yǎng)陽性樣本的64%，與上海地區(qū)AIDS患者NTM感染情況一致；并且他們發(fā)現(xiàn)高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療能夠降低AIDS患者的NTM感染率。

藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，從AIDS患者中分離的MTB對(duì)鏈霉素和異煙肼的耐藥率均較利福平和乙胺丁醇高，且多重耐藥率增高，達(dá)到17.97%。因未常規(guī)開展NTM藥物敏感性試驗(yàn)，且未對(duì)NTM進(jìn)行菌株的鑒定是本研究的不足。2017年《非結(jié)核分枝桿菌肺病治理指南》[12]提出，不同的NTM在治療前需進(jìn)行的藥物敏感性試驗(yàn)所需藥物不同，如需操作和報(bào)告藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果應(yīng)遵循美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)的要求進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)。同時(shí)，單純的敏感或耐藥已不能滿足臨床需求，最低抑菌濃度和臨界濃度更有指導(dǎo)意義。但本研究的回顧分析結(jié)果表明，上海地區(qū)AIDS患者NTM陽性分離率很高，有效的預(yù)防NTM感染的措施應(yīng)成為NTM感染研究的主要方向之一。

綜上所述，上海地區(qū)AIDS患者NTM感染嚴(yán)重，及早對(duì)HIV感染合并NTM感染患者進(jìn)行診斷，有利于早期防治NTM感染，最大程度地減少NTM感染給患者帶來的危害。