荷葉離褶傘研究進(jìn)展

李立功

(大石橋市高坎鎮(zhèn)林業(yè)站，遼寧大石橋115100)

荷葉離褶傘(Lyophyllumdecastes)又名“路基蘑”、“鐵道蘑”、荷葉蘑等，屬擔(dān)子菌亞門(mén)(Basidiomycotina)，層菌綱(Hymenomycetes)，傘菌目(Agaricales)，白蘑科(Tricholomataceae)，離褶傘屬(Lyophyllum)，在歐洲被稱(chēng)為“Fried chicken mushroom”。在我國(guó)主要分布在遼寧、吉林、黑龍江、江蘇、青海、四川、貴州、云南、新疆、內(nèi)蒙古大興安嶺中南部等地，其肉肥厚細(xì)膩、清香撲鼻，味道鮮美，富含蛋白質(zhì)、氨基酸、β-1,3-D 葡聚糖與β-1,6-D 葡聚糖[1]，對(duì)先天性糖尿病[2]、特異性皮膚炎[3]等具有很好的抑制效果，同時(shí)還具有降血脂[4]、防輻射[5]、防治癌細(xì)胞[1]等功效，是一種營(yíng)養(yǎng)豐富，兼具食藥用功效的珍稀食用菌，市場(chǎng)應(yīng)用前景十分廣闊。

本文圍繞荷葉離褶傘分離和鑒定、生物學(xué)特性、子實(shí)體和菌絲營(yíng)養(yǎng)成分、人工馴化、生物活性物質(zhì)及開(kāi)發(fā)利用方面的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，并對(duì)下一步研究方向進(jìn)行展望。

1 荷葉離褶傘分離、鑒定

魏生龍等[6]于2000年從海拔2800～3200m的祁連山金露梅灌木叢中采集到荷葉離褶傘野生子實(shí)體，并進(jìn)行了菌種分離，菌株號(hào)為ZY48-1，菌種保藏在“中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心”，菌種保藏號(hào)CGMCC No.1518。PDA培養(yǎng)基和金露梅葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基適宜對(duì)荷葉離褶傘進(jìn)行組織分離和孢子分離，孢子分離法較組織分離法菌絲生長(zhǎng)速度更快[7]。欒慶書(shū)等[8]2003年對(duì)沈陽(yáng)輝山針闊混交林下大型野生菌類(lèi)進(jìn)行調(diào)查，分離獲得荷葉離褶傘菌絲，其中燕麥、玉米和西瓜培養(yǎng)基為最佳分離培養(yǎng)基。

荷葉離褶傘的鑒定目前主要依靠傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)相結(jié)合的方法進(jìn)行。在宏觀形態(tài)上，荷葉離褶傘與煙色離褶傘等十分相近，難以區(qū)分。中國(guó)工程院李玉院士將荷葉離褶傘、煙色離褶傘和玉蕈離褶傘商品化名稱(chēng)統(tǒng)一命名為“來(lái)福蘑”[9]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，利用核糖體rDNA內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internal Transcribed Spacer，ITS)序列分析技術(shù)對(duì)真菌進(jìn)行鑒定，被越來(lái)越廣泛應(yīng)用。ITS序列屬于中度保守序列，表現(xiàn)為種內(nèi)相對(duì)一致，種間差異明顯，多用于真菌屬內(nèi)種間的分析研究。鄭宏亮[10]利用核糖體rDNA ITS序列分析技術(shù)對(duì)荷葉離褶傘(L.decastes24402)進(jìn)行分子鑒定，與基因庫(kù)中下載的L.decastes序列聚為一支，支持率99%，但獨(dú)立成支，表明測(cè)試荷葉離褶傘與國(guó)外相比的存在一定差異。王守現(xiàn)[11]利用ITS序列分析技術(shù)，用ITS1和ITS4通用引物對(duì)野生荷葉離褶傘進(jìn)行擴(kuò)增、測(cè)序并對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對(duì)，與登錄號(hào)為HM 119485的荷葉離褶傘同源性達(dá)到98.91%。

2 荷葉離褶傘生物學(xué)特性

對(duì)荷葉離褶傘生物學(xué)特性的研究多數(shù)以菌絲生長(zhǎng)速度、生長(zhǎng)勢(shì)及菌絲干重等作為衡量指標(biāo)進(jìn)行篩選[11]。魏生龍等[6]對(duì)荷葉離褶傘生物性特研究結(jié)果表明：荷葉離褶傘屬低溫型變溫結(jié)實(shí)型菌類(lèi)，菌絲生長(zhǎng)的溫度范圍是5～35℃，最適溫度25℃，致死溫度是45℃ 30min；擔(dān)孢子萌發(fā)溫度范圍是10～25℃，最適溫度是20℃，致死溫度是50℃ 15min。菌絲生長(zhǎng)最適pH 4～5，擔(dān)孢子萌發(fā)最適pH 4～6。光照有利于子實(shí)體形成，黑暗條件下不能形成子實(shí)體。菌絲生長(zhǎng)最適C/N為15/1～50/1，最適氮源是麥麩，最適碳源是蔗糖和葡萄糖。王守現(xiàn)[11]對(duì)來(lái)自西藏市場(chǎng)上的荷葉離褶傘生物學(xué)特性進(jìn)行研究，篩選出最佳生長(zhǎng)條件：最適碳源為麥芽糖，最適氮源為大豆蛋白胨，最適碳氮比為30∶1，菌絲最適生長(zhǎng)溫度為20℃，最適pH為6.0。Kimuta 等[12]研究結(jié)果表明荷葉離褶傘最是生長(zhǎng)溫度25℃，最佳碳源是果糖，適量的AlCl3能促進(jìn)菌絲生長(zhǎng)。

無(wú)機(jī)鹽是影響食用菌生長(zhǎng)發(fā)育重要因素之一，其中以Mg2+、K+、Zn2+、Na+和Fe3+尤為重要，適當(dāng)濃度的ZnSO4、MgSO4、KH2PO4和FeSO4有利于荷葉離褶傘菌絲萌發(fā)，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)菌絲的生長(zhǎng)。超過(guò)臨界濃度菌絲生長(zhǎng)逐漸緩慢且受到抑制，臨界濃度分別為4.0g/L、6.0g/L、10.0g/L和2.5g/L[13]。1mg/mL KCl對(duì)荷葉離褶傘的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，5mg/mL或10mg/mL的NaCl對(duì)菌絲生長(zhǎng)具有抑制作用。微量元素中，較高濃度的錳、銅、鈷、鋅可以促進(jìn)荷葉離褶傘菌絲生長(zhǎng)[14]。

維生素類(lèi)VB6、VC、VB1對(duì)荷葉離褶傘菌絲生長(zhǎng)起促進(jìn)作用。吲哚丁酸、吲哚乙酸和萘乙酸等生長(zhǎng)素對(duì)菌絲生長(zhǎng)均具有促進(jìn)作用，其中吲哚丁酸促進(jìn)作用明顯[14]。在荷葉離褶傘母種培養(yǎng)基中加入生長(zhǎng)地土壤浸出液、腐殖質(zhì)浸出液和松針浸出液對(duì)菌絲的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用[15]。

3 荷葉離褶傘子實(shí)體和菌絲營(yíng)養(yǎng)成分

荷葉離褶傘子實(shí)體蛋白質(zhì)含量高(21.4%)，脂肪含量低(1.44%)，碳水化合物(53.03%)，氨基酸種類(lèi)齊全(17種)，同時(shí)還含有對(duì)人體有益的微量元素鋅、銅和硒以及大量的維生素B1、B2、B3、B6，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[16]。席亞麗等[17]以氨基酸評(píng)分、化學(xué)評(píng)分、必需氨基酸指數(shù)、生物價(jià)、營(yíng)養(yǎng)指數(shù)和氨基酸比值系數(shù)分，評(píng)價(jià)了子實(shí)體、菌絲體和菌絲體發(fā)酵液的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。用不同的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)指標(biāo)，子實(shí)體和菌絲體營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的高低略有不同，綜合評(píng)價(jià)認(rèn)為荷葉離褶傘菌絲體和子實(shí)體均具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，而菌絲體發(fā)酵液中蛋白質(zhì)含量和氨基酸種類(lèi)遠(yuǎn)低于子實(shí)體和菌絲體，菌絲發(fā)酵液含有VB2、VB3、VB6和VC，含有谷氨酸、甘氨酸等6種氨基酸，不含鎘、汞、鉛、砷等重金屬離子[18]。

4 荷葉離褶傘人工馴化研究

荷葉離褶傘被視為味鮮宜人的野生食用菌，日本早就將它列入馴化的對(duì)象。對(duì)荷葉離褶傘人工馴化研究分為野外林下或灌木叢、室內(nèi)或菇棚4種方式，可以利用瓶栽、袋栽獲得子實(shí)體。Kang等[19]對(duì)荷葉離褶傘進(jìn)行了栽培研究，發(fā)現(xiàn)荷葉離褶傘菌絲在赤楊木屑和添加啤酒渣的培養(yǎng)料上生長(zhǎng)較好，子實(shí)體形成的適宜溫19～23℃。Yoshihama等[20]1994年申請(qǐng)美國(guó)專(zhuān)利，報(bào)道了荷葉離褶傘在人工培養(yǎng)基上能形成子實(shí)體。國(guó)內(nèi)學(xué)者也相繼開(kāi)展了荷葉離褶傘的人工馴化研究。我國(guó)最早關(guān)于成功栽培荷葉離褶傘的的記錄是1973年，李植森利用蕨苔根和茅草制作腐殖土作為培養(yǎng)料，在室內(nèi)和山林就地栽培獲得成功[21]。

無(wú)論何種馴化方式，培養(yǎng)料起到至關(guān)重要的作用。培養(yǎng)料是大型真菌生長(zhǎng)發(fā)育的基礎(chǔ)，木屑、玉米芯、棉籽殼等農(nóng)作物下腳料已經(jīng)成為各種食用菌栽培培養(yǎng)料不可缺少的配方成分。周會(huì)明研究發(fā)現(xiàn)，以玉米芯為主料的培養(yǎng)料荷葉離褶傘菌絲體生長(zhǎng)優(yōu)于以棉籽殼、木屑，但未形成子實(shí)體。以棉籽殼為主，添加部分木屑、闊葉及腐殖土或者添加部分發(fā)酵料和小麥有利于子實(shí)體形成[22]。魏生龍[7]篩選出荷葉離褶傘適宜原種與栽培種生長(zhǎng)的配方為小麥89%+麥麩10%+葡萄糖0.5%+過(guò)磷酸鈣0.5%。棉籽殼75%+高粱12%+麥麩12%+白糖0.5%+過(guò)磷酸鈣0.5%瓶栽生物學(xué)效率47.5%，顯著高于其他配方。程繼紅[23]對(duì)荷葉離褶傘工廠化栽培基本工藝進(jìn)行了研究，生產(chǎn)工藝流程包括原材料制備、攪拌、填料、滅菌、冷卻、接種、搔菌、栽培、采收包裝等步驟，使用PP塑料瓶栽培污染率低，發(fā)菌時(shí)間52d，采收期2～3d，單瓶產(chǎn)量為104g。

5 荷葉離褶傘生物活性物質(zhì)研究

荷葉離褶傘生物活性物質(zhì)的研究主要集中在胞外多糖的提取、富硒發(fā)酵、胞外酶活性等方面，對(duì)荷葉離褶傘中活性物質(zhì)的提取制備和活性機(jī)理的深入研究將為荷葉離褶傘保健產(chǎn)品或功能食品的開(kāi)發(fā)提供參考。閆培生[24]首次利用10L發(fā)酵罐對(duì)荷葉離褶傘胞內(nèi)和胞外多糖產(chǎn)量以及6種酶對(duì)發(fā)酵菌絲體多糖提取效果。篩選出在25℃、120r/min、空氣流量為200L/h條件下，8d時(shí)胞內(nèi)多糖含量和胞外多糖產(chǎn)量達(dá)最高，分別為63.1mg/g干菌絲體和3.54g/L。同年張芬琴[25]報(bào)道了荷葉離褶傘多糖提取工藝，提取溫度為85℃，pH9.0，料液比1∶15，提取時(shí)間1.5h，獲得固形物中多糖含量為62.52%。王曉琴[26]研究表明荷葉離褶傘菌絲體生長(zhǎng)及胞內(nèi)外多糖及胞外還原糖含量隨發(fā)酵時(shí)間變化，適宜時(shí)間為11d。

多糖和硒結(jié)合成為硒多糖，是一種多糖有機(jī)硒化合物，其生物藥理活性普遍高于多糖和硒，更容易被機(jī)體吸收和利用[27]。高慧娟[28]以菌絲體干重和富硒率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定荷葉離褶傘菌絲體最優(yōu)富硒發(fā)酵條件。對(duì)富硒荷葉離褶傘菌絲體胞內(nèi)粗多糖發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，得出的最佳發(fā)酵條件為：121℃，20min 條件滅菌，在發(fā)酵至第129h，發(fā)酵液中添加4μg/mL Na2SeO3，待發(fā)酵244h，測(cè)得的實(shí)際胞內(nèi)粗多糖含量為349.8mg/100mL。

李霞[29]研究了玉米穎殼、發(fā)酵棉籽殼、木屑、麥草、未發(fā)酵棉籽殼、棉籽殼與木屑的混合物6種培養(yǎng)基中荷葉離褶傘胞外淀粉酶濾紙纖維素酶、羧甲基纖維素酶、半纖維素酶、濾紙纖維素酶等胞外酶的活性變化，酶活性變化總體趨勢(shì)相似，在接種后第8周達(dá)到酶活性的最大值。梁倩倩等[30]對(duì)該菌的漆酶進(jìn)行了研究，其漆酶最適作用溫度為35℃，在30～35℃較為穩(wěn)定；最適反應(yīng)pH 為3.0，pH 在2.2～3.8 較為穩(wěn)定，保持了80%以上的酶活，ABTS 的漆酶動(dòng)力學(xué)常數(shù)為72.622μmol/L。2016年又對(duì)產(chǎn)酶條件進(jìn)行了優(yōu)化，得出荷葉離褶傘發(fā)酵產(chǎn)漆酶最優(yōu)發(fā)酵條件，獲得最大漆酶酶活為829.83U/mL[31]。

6 開(kāi)發(fā)利用

張琰珍[32]等進(jìn)行了荷葉離褶傘保健飲料的研制，以豆?jié){、玉米汁為天然培養(yǎng)基，經(jīng)過(guò)深層發(fā)酵后，以發(fā)酵液40%、檸檬酸0.12%、羧甲基纖維素鈉0.02%、白砂糖4%為配方的產(chǎn)品為最佳。楊秋慧子[33]從荷葉離褶傘菌絲體中利用DEAE-SepharoseF.F.色譜和SephadexG-100色譜技術(shù)，分離得到凝集素，相對(duì)分離質(zhì)量為48.2ku，為單亞基糖蛋白，對(duì)兔血紅細(xì)胞具有較強(qiáng)的凝集作用。

荷葉離褶傘作為一種亟需開(kāi)發(fā)的食用菌菌種，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)掌握了其基本生物學(xué)特性，實(shí)現(xiàn)了其工廠化栽培，摸索其適宜培養(yǎng)條件、縮短栽培周期、提高栽培產(chǎn)量將會(huì)是下一步的研究重點(diǎn)。荷葉離褶傘品種選育應(yīng)在菌種篩選的基礎(chǔ)上進(jìn)行，也可利用菌種的多樣性采用細(xì)胞融合、單孢雜交等技術(shù)達(dá)到育種的最終目的，最后實(shí)現(xiàn)菌種推廣以及生產(chǎn)化。另外荷葉離褶傘生活史、交配系統(tǒng)、有性生殖中基因重組的遺傳分析、分子生物學(xué)等在遺傳學(xué)中的應(yīng)用幾乎是空白，有待于進(jìn)一步研究。同時(shí)應(yīng)加強(qiáng)生物活性物質(zhì)成分和主要功能的研究，探明其作用途徑及機(jī)理，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)新藥的第三代功能食品奠定良好的基礎(chǔ)。