沙門(mén)氏菌誘導(dǎo)雞生殖道產(chǎn)生免疫反應(yīng)的研究進(jìn)展

胡慶花，馬 躍，單春蘭，張美玲，孫播東，王鳳嬌，欒維民,2，楊樹(shù)寶*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林長(zhǎng)春130118)

沙門(mén)氏菌可以通過(guò)雞蛋(胚)造成垂直傳播，給家禽養(yǎng)殖帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)沙門(mén)氏菌還是引起人類(lèi)食源性疾病的主要病原菌之一，許多國(guó)家出現(xiàn)了由沙門(mén)氏菌污染的禽蛋、禽肉等禽類(lèi)產(chǎn)品造成的食品安全問(wèn)題[1]。有些血清型的沙門(mén)氏菌還是人畜共患性沙門(mén)氏菌，可以使人類(lèi)出現(xiàn)某些疾病。家禽感染沙門(mén)氏菌可以分為兩種類(lèi)型：一種是人畜共患性沙門(mén)氏菌即腸炎沙門(mén)氏菌(S.enteritidis)和鼠傷寒沙門(mén)氏菌(S.typhimurium)，另一種是家禽特異性沙門(mén)氏菌包括雞傷寒沙門(mén)氏菌(S.gallinarum)和雞白痢沙門(mén)氏菌(S.pullorum)。其中SE 和ST 是最容易引起家禽感染的副傷寒沙門(mén)氏菌，它們可以對(duì)人類(lèi)和其它動(dòng)物健康造成威脅，是引起人類(lèi)食源性疾病的主要病原體，可以使患者出現(xiàn)腹瀉、發(fā)熱、腹痛或痙攣、嘔吐、頭痛等典型癥狀。當(dāng)SE 和ST 感染雞腸道和雞生殖道后，被感染雞會(huì)出現(xiàn)腹瀉，產(chǎn)蛋量下降等癥狀?，F(xiàn)如今已經(jīng)基本排除了家禽特異性沙門(mén)氏菌對(duì)家禽的感染，仍然較為流行的還是人畜共患性沙門(mén)氏菌疾病。目前，對(duì)雞生殖道免疫方面的研究相對(duì)較少，只有少數(shù)學(xué)者對(duì)雞感染SE 后，生殖道的獲得性免疫應(yīng)答情況進(jìn)行研究。當(dāng)沙門(mén)氏菌定植于輸卵管之后，可以一直寄居在生殖道并且會(huì)對(duì)新鮮的雞蛋造成污染。據(jù)報(bào)道陰道免疫相比于輸卵管其它部位免疫更為重要，因?yàn)樾怪城惶幣判刮锖铜h(huán)境中的SE 可以經(jīng)過(guò)陰道進(jìn)入輸卵管上段隨后可能引起雞蛋的污染[2-3]。Gantois 等也發(fā)現(xiàn)當(dāng)SE 感染雞的陰道、峽部和漏斗部后，所形成的雞蛋中蛋殼、蛋膜和蛋白中也會(huì)存在SE[1]，因此保護(hù)雞的輸卵管，尤其防止雞的陰道感染對(duì)阻止病原微生物進(jìn)入剛形成的雞蛋和成功受精是非常有必要的。機(jī)體的免疫系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)可以相互作用，它對(duì)動(dòng)物的生育能力和生殖道健康有重要影響[4]，免疫系統(tǒng)功能的發(fā)揮主要是通過(guò)天然免疫應(yīng)答和獲得性免疫應(yīng)答來(lái)實(shí)現(xiàn)。當(dāng)雞生殖道感染沙門(mén)氏菌后，生殖道中天然免疫應(yīng)答成分，包括Toll 樣受體(Toll-like receptors，TLRs)，雞β-防御素(AvβDs)的表達(dá)和天然免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞等可能會(huì)出現(xiàn)一些變化，而獲得性免疫成分如淋巴細(xì)胞數(shù)量和分布，一些細(xì)胞因子的表達(dá)上也會(huì)有所改變。因此為了更有效的預(yù)防雞生殖道疾病尤其是腸炎沙門(mén)氏菌性疾病，高度重視雞生殖道免疫是十分必要的。

1 雞生殖道相關(guān)淋巴組織概述

生殖道相關(guān)淋巴組織是粘膜相關(guān)淋巴組織重要組成部分，對(duì)雞而言，其沒(méi)有外周淋巴結(jié)，所以粘膜相關(guān)淋巴組織是其主要的次級(jí)免疫器官，對(duì)禽類(lèi)起到免疫保護(hù)的作用。T 細(xì)胞和B 細(xì)胞作為粘膜相關(guān)淋巴組織中重要的免疫細(xì)胞將參與生殖道粘膜免疫反應(yīng)。利用組織學(xué)實(shí)驗(yàn)方法證明在雞輸卵管中存在較多分散的淋巴細(xì)胞和少數(shù)淋巴集結(jié)，而且主要分布于粘膜上皮和上皮周?chē)恼衬す逃袑又衃5]。也表明淋巴組織在生殖道局部免疫中起關(guān)鍵作用。Hrabia等對(duì)成熟母雞生殖道中B 淋巴細(xì)胞分布情況進(jìn)行觀察，結(jié)果顯示B 淋巴細(xì)胞散布在母雞輸卵管中，而卵巢中分布較少，且IgM+和IgA+B 淋巴細(xì)胞明顯多于IgG+。而卵巢和輸卵管中均存在T 細(xì)胞，且在輸卵管局部以淋巴細(xì)胞聚集物形式存在[6]。

2 雞生殖道淋巴組織對(duì)沙門(mén)氏菌感染產(chǎn)生的天然免疫應(yīng)答

禽類(lèi)卵巢和輸卵管易受病原微生物侵害， 宿主天然免疫反應(yīng)對(duì)維持禽類(lèi)卵泡發(fā)育、排卵、受精和蛋形成等生殖生理具有重要的作用[7]。當(dāng)病原微生物侵入家禽生殖系統(tǒng)時(shí)，家禽首先會(huì)啟動(dòng)機(jī)體的非特異性免疫系統(tǒng)。其中TLRs 是宿主防御的天然免疫調(diào)節(jié)中心，同時(shí)又是天然免疫系統(tǒng)和獲得性免疫系統(tǒng)的橋梁。當(dāng)病原進(jìn)入機(jī)體后，首先被TLRs 識(shí)別活化核轉(zhuǎn)錄因子，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞因子、趨化因子并誘導(dǎo)合成β- 防御素等，進(jìn)而觸發(fā)胞內(nèi)直接殺菌機(jī)制或通過(guò)誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，對(duì)侵入機(jī)體的病原微生物進(jìn)行消滅或清除。

2.1 TLRs 在雞生殖道中表達(dá) 盡管對(duì)脊椎動(dòng)物體內(nèi)TLRs 的表達(dá)和功能已經(jīng)得到廣泛地研究，但對(duì)雞體內(nèi)TLRs 的研究還只是停留在其在腸道中對(duì)病原菌的作用，有關(guān)TLRs 在生殖道中的表達(dá)及功能還未見(jiàn)相關(guān)研究報(bào)道。但禽類(lèi)生殖系統(tǒng)存在對(duì)脂多糖(LPS)和其它病原微生物誘導(dǎo)TLRs 介導(dǎo)的免疫應(yīng)答機(jī)制[8]。TLRs1-2、TLRs2-1、TLRs 2-2、TLRs 3、TLRs 4、TLRs 5、TLRs 7、TLRs 15 和TLRs21 可表達(dá)于雞的陰道中[9-10]。整個(gè)輸卵管中均存在TLRs1-2、TLRs2-1、TLRs2-2、TLRs3、TLRs4、TLRs5 和TLRs 7 的表達(dá)，其中在子宮和陰道其表達(dá)量最高[3]。Michailidis 等同時(shí)也證明當(dāng)雞感染沙門(mén)氏菌后卵巢中TLR4 和TLR15 含量均會(huì)增多[9]。盡管雞的陰道免疫很重要，但雞陰道中的TLRs 家族的表達(dá)情況及雞感染SE 后TLRs 的表達(dá)變化之前卻未見(jiàn)相應(yīng)的研究報(bào)道。近幾年有人用LPS 刺激雞后發(fā)現(xiàn)在其輸卵管和陰道TLR4 含量會(huì)增加[3,10]。表明TLRs 在宿主天然免疫防御中起著至關(guān)重要作用[3]。當(dāng)性成熟的雞和體成熟的雞通過(guò)灌胃法注入SE后，檢測(cè)到陰道中TLR3 mRNA 的含量并沒(méi)有明顯的增加[10]，這可能是因?yàn)門(mén)LR3 所識(shí)別的配體是dsRNA 有關(guān)，而對(duì)別的細(xì)菌感染不敏感。但是發(fā)現(xiàn)性成熟的雞在感染SE后，陰道中的TLR5 和TLR15 含量會(huì)明顯增加，TLR7 表達(dá)會(huì)明顯減少，體成熟雞陰道中TLR2-1、TLR4 和TLR15的表達(dá)量明顯增多[10]。靜脈注射SE 后，陰道中IL-1β 表達(dá)量增加[3]。在正常情況下，雞體內(nèi)其它組織器官內(nèi)也會(huì)有TLRs 的表達(dá)，但其在不同品種雞的相同組織中表達(dá)量不同的原因可能與雞所遇到的應(yīng)激情況或與病原接觸后，機(jī)體的抵抗能力有關(guān)。

2.2 β- 防御素在雞生殖道中的表達(dá) β- 防御素是禽類(lèi)重要的免疫調(diào)節(jié)因子，具有抵抗多種病原微生物包括革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌、真菌和酵母等[11]感染功能，Evans 等通過(guò)體外抗菌活性實(shí)驗(yàn)證明了雞體內(nèi)的β-防御素能夠殺死SE、空腸彎曲桿菌和白色念球菌[12]。目前已經(jīng)在家禽生殖系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)了多個(gè)AvβDs 成員。其基因的表達(dá)分為固有表達(dá)(Constitutive expression)和誘導(dǎo)表達(dá)(Inducible expression)。一般認(rèn)為固有表達(dá)的防御素在天然免疫系統(tǒng)中起重要作用。然而在感染等導(dǎo)致的全身性炎癥反應(yīng)中，誘導(dǎo)表達(dá)的β- 防御素比固有表達(dá)的防御素起更為重要的作用。AvβD4、AvβD7、AvβD9 表達(dá)于卵巢和輸卵管可以抵抗沙門(mén)氏菌感染[13]。AvβD3、AvβD11、AvβD12在雞的生殖道中表達(dá)，對(duì)雞接種LPS 后，其表達(dá)量增加[14]?？咕木哂锌咕钚钥梢缘挚辜?xì)菌感染并被認(rèn)為有助于其它多肽對(duì)胚胎的免疫保護(hù)?？咕脑谳斅压艿呐虼蟛亢蜌は俨康玫奖磉_(dá)，因此其可以進(jìn)入雞蛋中[15]，對(duì)雞蛋也起到保護(hù)作用。Sadeyen 等對(duì)有沙門(mén)氏菌抗性的雞群和對(duì)沙門(mén)氏菌易感雞群接種沙門(mén)氏菌后觀察防御素的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)非易感雞體內(nèi)防御素表達(dá)高于易感雞，而易感雞感染沙門(mén)氏菌后，隨時(shí)間推移β- 防御素表達(dá)呈逐漸上升趨勢(shì)[16]。對(duì)雞口服沙門(mén)氏菌后會(huì)發(fā)現(xiàn)其卵巢AvβD 4、AvβD 5、AvβD 7、AvβD 11、AvβD 12 基因表達(dá)增加， 但會(huì)下調(diào)AvβD 14 基因表達(dá)[17]。對(duì)雞靜脈注射LPS 后，發(fā)現(xiàn)其子宮里AvβD 3 和AvβD 11 表達(dá)增加[18]，而陰道中AvβD3、AvβD 5、AvβD 10、AvβD 11 和AvβD 12 表達(dá)也會(huì)增多[14]。這些防御素的表達(dá)將有利于生殖系統(tǒng)抵抗病原微生物的入侵從而維持生殖系統(tǒng)正常的生殖生理等功能。值得注意的是TLRs 和家禽β- 防御素的表達(dá)主要是在雞的下級(jí)輸卵管中，因此推測(cè)這可能是為了更有效地抵抗泄殖腔內(nèi)病原微生物的感染。

3 雞生殖道對(duì)沙門(mén)氏菌感染產(chǎn)生的獲得性免疫應(yīng)答

當(dāng)病原微生物突破機(jī)體天然免疫屏障后，機(jī)體就會(huì)啟動(dòng)獲得性免疫系統(tǒng)對(duì)細(xì)菌、病毒等微生物進(jìn)行抵抗而發(fā)揮作用，產(chǎn)生免疫球蛋白或者使免疫細(xì)胞增殖，細(xì)胞因子表達(dá)水平發(fā)生變化等情況。雞生殖道感染沙門(mén)氏菌后，會(huì)引起其生殖道局部免疫應(yīng)答和全身性免疫應(yīng)答。

3.1 沙門(mén)氏菌誘發(fā)的生殖道內(nèi)局部免疫應(yīng)答 粘膜表面是病原微生物入侵的主要部位，腸炎沙門(mén)氏菌在腸中的最初入侵部位是通過(guò)粘膜上皮細(xì)胞并進(jìn)一步對(duì)內(nèi)臟器官如脾臟，肝臟，卵巢和輸卵管進(jìn)行感染[19]，局部體液免疫應(yīng)答在抵抗病原微生物定植方面起著很重要作用。有人證明對(duì)雌性動(dòng)物生殖道進(jìn)行免疫后，陰道局部SIgA 抗體水平會(huì)顯著升高[20]。Withanage 證明蛋雞感染沙門(mén)氏菌后，輸卵管內(nèi)抗體含量會(huì)增多，且在接種后第14 d IgG 和IgM 抗體水平達(dá)到峰值[21]。各種動(dòng)物生殖道對(duì)病原微生物的處理不能只依靠體液免疫應(yīng)答。Barua 等對(duì)雞腹腔注射腸炎沙門(mén)氏菌后，利用免疫組織化學(xué)技術(shù)對(duì)卵巢基質(zhì)和卵泡膜中CD3+、 CD4+和CD8+T 淋巴細(xì)胞進(jìn)行定位和定量分析，發(fā)現(xiàn)接種SE 12 h 后淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量增加，且接種后的24 h 比12 h 數(shù)量會(huì)進(jìn)一步增多，但CD4+/CD8+沒(méi)有變化，這種比率的平衡對(duì)于雞抵抗SE 感染卵巢至關(guān)重要[22]。Withanage 等證明對(duì)雞靜脈注射SE 7 d 后，卵巢和輸卵管中T 淋巴細(xì)胞均會(huì)增加并在第10 d 數(shù)量達(dá)到高峰，而B(niǎo)淋巴細(xì)胞在感染后第14 d 達(dá)到高峰，兩者均是在21 d 恢復(fù)到感染前水平[23]。McSorley 等也發(fā)現(xiàn)雞感染ST 3 h 后，CD4+T 細(xì)胞數(shù)量會(huì)顯著增多[24]。雞接種LPS 后，卵泡和基質(zhì)中促炎細(xì)胞因子IL-6 和IL-1β 及趨化因子CXCL12 表達(dá)量也會(huì)增加[25]。另外在卵泡基質(zhì)中的CD4+T 淋巴細(xì)胞和異嗜粒細(xì)胞含量也會(huì)增多，只是這種現(xiàn)象是暫時(shí)的。在這些研究中，抗體和淋巴細(xì)胞數(shù)量的增加與機(jī)體對(duì)細(xì)菌的清除同時(shí)發(fā)生。

3.2 沙門(mén)氏菌誘發(fā)的全身性免疫應(yīng)答 Withanage 證明雞感染SE 后第14 d，血清中IgG 和IgM 抗體水平達(dá)到最大值且雞在整個(gè)產(chǎn)蛋期間血清中IgG 抗體水平一直維持較高水平[21]。對(duì)雞接種SE 的鞭毛第4 d、7 d、11 d 和14 d后，血清中一氧化氮(NO)含量較高，它作為清除病原的效應(yīng)分子有利于機(jī)體清除沙門(mén)氏菌，但血清中IFN-γ、IL-1、IL-6 只有在接種后第7 d 出現(xiàn)較高含量[26]。IFN-γ 作為T(mén)h1 類(lèi)輔助T 淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的因子，在粘膜(呼吸道和消化道)免疫反應(yīng)中起著重要的作用，因?yàn)槠浔磉_(dá)量在各個(gè)時(shí)期明顯高于其他細(xì)胞因子含量。近期研究發(fā)現(xiàn)雞感染ST 的LPS 后IL-1 和IFN-γ mRNA 表達(dá)量均增多[27]，然而當(dāng)雞口服ST 后，其血液，盲腸，脾臟中CD8+T 細(xì)胞數(shù)量明顯增多[28]。家禽感染沙門(mén)氏菌的方式是多樣的，可以經(jīng)過(guò)生殖道、口服和腹腔等感染，但其引起的免疫反應(yīng)是局部免疫或全身免疫反應(yīng)。有研究表明，家禽口服感染SE 兩周后脾臟中IFN-γ，IL-12 和IL-18 的表達(dá)水平達(dá)最大值，ST 感染的情況與之相同，性成熟的禽類(lèi)感染ST 后3 周，抗原特異性T 細(xì)胞增殖達(dá)到高峰[29]。SE 和ST 感染的生物學(xué)原理及對(duì)兩種病原體的免疫反應(yīng)非常相似。然而，目前還不清楚反應(yīng)的哪種元素可以保護(hù)機(jī)體不受隨后的感染。但是細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)可能是很重要的，在英國(guó)用滅活菌苗控制蛋雞SE 病的成功初步表明，抗體在保護(hù)機(jī)體免受二次感染中發(fā)揮了重要作用。

4 結(jié) 語(yǔ)

雛雞出殼后，其生殖道末端就直接與外界環(huán)境相接觸，在這種情況下環(huán)境中和泄殖腔處病原菌就很有可能進(jìn)入沒(méi)有免疫保護(hù)作用的生殖道，使雛雞在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中一直處于攜帶病原狀態(tài)或者死亡，哺乳動(dòng)物不同于家禽，哺乳動(dòng)物可以通過(guò)母乳持續(xù)供給獲得母源抗體，而雛雞只能一次性獲得母源抗體，因此研究雞生殖道粘膜免疫對(duì)于疫苗的研發(fā)很重要。雞生殖道粘膜作為機(jī)體粘膜組成成分之一，在抵抗病原微生物侵害方面起重要作用。近些年有關(guān)雞生殖道免疫系統(tǒng)結(jié)構(gòu)及其組成成分的研究越來(lái)越多，可以通過(guò)免疫組織化學(xué)技術(shù)對(duì)免疫細(xì)胞類(lèi)型進(jìn)行檢測(cè)，但是對(duì)這些細(xì)胞免疫功能的研究卻相對(duì)較少，生殖道免疫組織在機(jī)體的整個(gè)免疫系統(tǒng)或局部免疫系統(tǒng)中的作用也不是十分清楚，生殖道局部感染是否可以誘導(dǎo)全身性免疫應(yīng)答或全身性感染是否可以引起生殖道產(chǎn)生獲得性免疫反應(yīng)也值得進(jìn)一步研究。疫苗在家禽養(yǎng)殖中得到了廣泛的應(yīng)用，但是對(duì)家禽接種沙門(mén)氏菌疫苗后產(chǎn)生的局部免疫應(yīng)答情況還不清楚，只知道它可以引起促炎反應(yīng)，而且大部分研究幾乎都集中在疫苗引起機(jī)體產(chǎn)生的全身性免疫保護(hù)和應(yīng)答上?？傊@些研究均較為片面，SE 和ST 作為人畜共患性沙門(mén)氏菌對(duì)人類(lèi)健康造成極大的威脅，因此對(duì)雞生殖道感染沙門(mén)氏菌后生殖道免疫情況進(jìn)行研究有利于人類(lèi)健康和禽類(lèi)養(yǎng)殖，同時(shí)為預(yù)防雞生殖道疾病提供了理論依據(jù)和參考，也為疫苗接種途徑和免疫時(shí)間提供參考。