貓兒屎DS37菌株次生代謝產(chǎn)物化學(xué)成分的研究

王寧寧， 楊秀芳， 馬養(yǎng)民

（陜西科技大學(xué)，陜西省輕化工助劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西西安710021）

貓兒屎 Decaisnea insignis（Griff.） Hook.f.＆Thomson系木通科貓兒屎屬植物。是我國傳統(tǒng)的民間中草藥，別名貓屎瓜、矮杞樹等，為叢生落葉直立灌木［1］，莖有圓形或橢圓形的皮孔，枝粗而脆，易斷，廣泛分布于我國西南部和中部地區(qū)。貓兒屎味辛、甘、性平，據(jù) 《陜西中草藥》記載其根及果實(shí)具有清熱解毒、滋潤去燥、抗腫瘤［2］等功效。迄今為止，對貓兒屎的研究主要集中在植物化學(xué)成分，而對其內(nèi)生真菌的研究較少［3］。內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物種類主要有生物堿類［4］、 萜類［5］、 甾體［6］、 有機(jī)酸類［7］等。 為進(jìn)一步開發(fā)貓兒屎植物的藥用成分，本實(shí)驗(yàn)對從貓兒屎莖部分離得到的DS37菌株的次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行了研究，從中分離得到10個化合物，其中化合物3～9為首次從該發(fā)酵物中分離得到。

1 儀器與材料

1.1 儀器 核磁共振光譜用Bruker avanceⅢ-400 MHz核磁共振儀測定 （TMS內(nèi)標(biāo)）、ESI-MS譜用Bruker micrOTOF-QⅡ 型質(zhì)譜儀測定 （瑞士Bruker公司）；R502B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 （上海市申生科技有限公司）；XT-5顯微熔點(diǎn)測定儀 （北京科儀光電儀器廠）；ZHJH-C1109B型超凈工作臺 （上海智城分析儀器制造有限公司）；YX280B手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌鍋 （江蘇江陰市濱江醫(yī)療設(shè)備廠）；HZQQ空氣恒溫振蕩器 （哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司）；DH5000B恒溫培養(yǎng)箱 （天津泰斯特儀器有限公司）。

1.2 試劑 柱層析色譜硅膠 （200～300目）、柱色譜凝膠和薄層層析硅膠G（青島海浪硅膠干燥劑廠）。石油醚、乙酸乙酯、甲醇 （天津市紅巖試劑廠）；氘代氯仿 CDCl3、氘代 DMSO （ARMAR Chemicals）。所用試劑均為分析純。

1.3 藥材 貓兒屎采自陜西秦嶺山區(qū)，經(jīng)本課題組王鵬飛等［3］從其莖部分離得到內(nèi)生真菌DS37。通過對其形態(tài)學(xué)觀察結(jié)合ITS序列分析構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，最終鑒定該菌株為Aspergillus tubingensis（Genbank序列號為MG495096），保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心 （保藏編號為 CCTCC M 2018147）。

2 提取與分離

菌株DS37經(jīng)過活化后，從斜面接種到裝有400 mL察氏培養(yǎng)基的1 000 mL錐形瓶中，在28℃，180 r／min下振蕩培養(yǎng)7 d制備成種子培養(yǎng)液。將裝好大米培養(yǎng)基的發(fā)酵瓶置于手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌鍋內(nèi)滅菌20 min，然后按照10%的接種量將種子培養(yǎng)液接種于上述大米培養(yǎng)基中，共計(jì)接種300瓶，在室溫下靜置培養(yǎng)35 d。

貓兒屎內(nèi)生真菌固體發(fā)酵物 （9.2 kg）用石油醚-乙酸乙酯-甲醇浸提8次，合并提取液并過濾，回收混合溶劑，減壓濃縮，得到粗品浸膏1 500 g。粗品浸膏在硅膠色譜柱上，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇 （1∶0∶0、 0∶1∶0、0∶1∶1、 0∶0∶1） 洗脫，得4個組分 Fr.A （110 g）、 Fr.B （420 g）、Fr.C （700 g）、 Fr.D （100 g）。 取 Fr.B 組分200 g與硅膠1∶1拌樣，經(jīng)硅膠柱，以石油醚-乙酸乙酯（100 ∶0、 100 ∶20、 100 ∶50、 100 ∶100、 100 ∶200、0∶100） 和乙酸乙酯-甲醇 （100 ∶20、 100 ∶50、100∶100、0∶100）洗脫，得10個組分 Fr.B1-Fr.B10。Fr.B4再經(jīng)硅膠柱，以石油醚-乙酸乙酯（100∶0、 100 ∶25、 100 ∶50、 100 ∶70、 100 ∶90、100 ∶100、 100 ∶130、 100 ∶150、 100 ∶180、100∶200、0∶100）洗脫，重結(jié)晶得化合物 1（1.2 g）、 2 （2.1 g）、 7 （3.5 g）、 9 （17.3 mg）、10（6.1 mg）；Fr.B5經(jīng)硅膠柱和重結(jié)晶得化合物5 （72.4 mg）、 6 （120.8 mg）、 8 （106.2 mg）；Fr.B6經(jīng)硅膠柱，以石油醚-乙酸乙酯 （100∶0、100∶10、 100∶20、 100∶25、 100 ∶30、 100 ∶50、100∶100、100∶200、0∶100） 洗脫，得9個組分Fr.B6.1-Fr.B6.9，F(xiàn)r.B6.8經(jīng)Sephadex LH-20柱分離純化，得化合物3（4.2 mg）、4（7.6 mg）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色晶體（甲醇），ESI-HR-MS m／z：273.074 5 ［M＋H］＋， 分子式為 C15H12O5， mp 277～ 278 ℃。1H-NMR （400 MHz， DMSO-d6）： δ 7.18 （1H，d，J＝1.8 Hz，H-6），6.71 （1H， d， J＝1.8 Hz， H-5′）， 6.63 （1H， d， J＝ 2.4 Hz， H-3′），6.59 （1H， d， J＝1.8 Hz， H-4）， 3.90 （3H， s， H-8）， 2.71 （2H， s， H-7′）；13C-NMR （100 MHz，DMSO-d6）： δ 165.93 （C-5）， 164.52 （C-7），164.00 （C-3）， 158.43 （C-4′）， 152.47 （C-2′），138.17 （C-6′）， 137.57 （C-1）， 117.47 （C-5′），108.62 （C-1′）， 103.07 （C-6）， 101.52 （C-3′），98.91 （C-4）， 98.26 （C-2）， 55.62 （C-8）， 24.89（C-7′）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn) ［8］基本一致，故鑒定為交鏈孢酚甲醚。

化合物2：白色粉末（甲醇），ESI-HR-MS m／z：259.059 9 ［M＋H］＋， 分子式為 C14H10O5， mp 264～ 266 ℃。1H-NMR （400 MHz， DMSO-d6）： δ 7.24 （1H， s， H-6）， 6.71 （1H， s， H-5′）， 6.63（1H， s， H-3′）， 6.37 （1H， s， H-4）， 2.70 （3H， s，H-7′）；13C-NMR （100 MHz， DMSO-d6）： δ 165.33（C-5）， 164.63 （C-7）， 164.02 （C-3）， 158.34 （C-4′）， 152.56 （C-2′）， 138.23 （C-6′）， 138.05 （C-1）， 117.46 （C-5′）， 108.92 （C-1′）， 104.24 （C-6）， 101.54 （C-3′）， 100.80 （C-4）， 97.35 （C-2），25.15（C-7′）。 以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［9］基本一致， 故鑒定為交鏈孢酚。

化合物3：紅色針晶（甲醇），ESI-HR-MS m／z：209.081 4 ［M＋H］＋， 分子式為 C11H10O4， mp 189～ 191 ℃。1H-NMR （400 MHz， DMSO-d6）： δ 10.28 （1H， s， 7-OH）， 6.73 （1H， d， J＝7.8 Hz，H-6）， 5.58 （1H， d， J＝7.8 Hz， H-8）， 4.16 （1H，s， H-3）， 3.95 （3H， s， 4-OMe）， 2.60 （3H， s， 5-Me）；13C-NMR （100 MHz， DMSO-d6）： δ 169.68（C-2）， 161.75 （C-7）， 158.50 （C-4）， 153.93 （C-9），137.09 （C-5），115.56 （C-6），106.08 （C-10），105.70 （C-8）， 86.46 （C-3）， 56.55 （4-OMe），23.21（5-Me）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn) ［10］基本一致，故鑒定為7-羥基-4-甲氧基-5-甲基香豆素。

化合物4：棕色粉末（甲醇），ESI-HR-MS m／z：439.137 6 ［M＋H］＋， 分子式為C24H22O8， mp 297～298 ℃。1H-NMR （400 MHz， DMSO-d6）： δ 7.02（2H， s， H-6， H-6′）， 5.65 （2H， s， H-3， H-3′），3.97 （6H， s， 4-OMe， 4′-OMe）， 3.76 （6H， s， 7-OMe， 7′-OMe）， 2.71 （6H， s， 5-Me， 5′-Me）；13CNMR （100 MHz， DMSO-d6）： δ 169.35 （C-4， C-4′）， 161.40 （ C-2， C-2′）， 159.16 （ C-7， C-7′），152.80 （C-9， C-9′）， 138.28 （C-5， C-5′）， 111.56（C-6， C-6′）， 107.58 （C-8， C-8′）， 106.74 （C-10，C-10′）， 87.38 （C-3， C-3′）， 56.72 （4-OMe， 4′-OMe）， 56.11 （7-OMe， 7′-OMe）， 23.44 （5-Me， 5′-Me）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn) ［11］基本一致，故鑒定為5， 5′-二甲基-4， 4′， 7， 7′-四甲氧基-8， 8′-雙香豆素。

化合物5：棕色粉末（甲醇），ESI-HR-MS m／z：425.122 0 ［M＋H］＋， 分子式為 C23H20O8， mp 305～307 ℃。1H-NMR （400 MHz， DMSO-d6）： δ 10.20（s， 7-OH）， 7.02 （1H， s， H-6′）， 6.73 （1H， s， H-8）， 5.64 （1H， s， H-3）， 5.58 （1H， s， H-3′），3.97 （3H， s， 4′-OMe）， 3.95 （3H， s， 4-OMe），3.76 （3H， s， 7′-OMe）， 2.72 （3H， s， 5′-Me），2.60 （3H， s， 5-Me）；13C-NMR （100 MHz， DMSO-d6）： δ 169.66 （C-4）， 169.35 （C-4′）， 161.72 （C-2′）， 161.37 （C-2）， 159.18 （C-7′）， 158.47 （C-7）， 153.95 （C-9）， 152.81 （C-9′）， 138.26 （C-5′）， 137.07 （C-5）， 115.56 （C-6）， 111.57 （C-8′）， 107.59 （C-6′）， 106.78 （C-10′）， 106.16 （C-10）， 105.71 （C-8）， 87.39 （C-3）， 86.49 （C-3′），56.71 （4′-OMe）， 56.54 （4-OMe）， 56.11 （7′-OMe）， 23.43 （5′-Me）， 23.19 （5-Me）。 以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn) ［12］基本一致，故鑒定為5，5′-二甲基-7-羥基-4， 4′， 7′-三甲氧基-6， 8′-雙香豆素。

化合物6：無色晶體（甲醇），ESI-HR-MS m／z：200.056 1 ［M-H］－， 分子式為 C8H11NO5， mp 214～ 216 ℃。1H-NMR （400 MHz， DMSO-d6）： δ 10.03 （1H， s， NH），7.45 （1H， d， J＝3.2 Hz， H-3）， 5.17 （1H， dd， J＝9.8， 3.0 Hz， H-4）， 4.83（1H， m， H-5）， 3.70 （1H， dd， J＝11.0， 6.0 Hz，H-6a）， 3.46 （1H， dd， J＝11.0， 6.6 Hz， H-6b），2.07 （3H， s， 8-Me）；13C-NMR （100 MHz， DMSO-d6）： δ 169.58 （C-1）， 169.02 （C-7）， 127.50 （C-2）， 126.50 （C-3）， 81.51 （C-4）， 71.41 （C-5），62.62（C-6）， 22.95 （C-8）。 以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［13］基本一致，故鑒定為leptosphaepin。

化合物7：黃色油狀 （石油醚）。1H-NMR（400 MHz， CDCl3）： δ 5.35 （4H， m， H-9″， H-10″， H-12″， H-13″）， 5.26 （1H， m， H-2）， 4.32 （2H， dd，J＝14.2 Hz， H-1b， H-3b）， 4.18 （2H， dd， J＝14.2 Hz， H-1a， H-3a）， 2.78 （2H， m， H-11″）， 2.33（4H， t， J＝7.8 Hz， H-2′， H-2?）， 2.31 （2H， t， J＝7.8 Hz， H-2″）， 2.05 （4H， m， H-8″， H-14″）， 1.62（6H， m， H-3′， H-3″， H-3?）， 1.31 （28H， m， H-4′， H-5′， H-6′， H-7′， H-4″， H-5″， H-7″， H-15″， H-16″， H-17″， H-4?， H-5?， H-6?， H-7?）， 0.89 （9H，bt， H-8′， H-8?， H-18″）；13C-NMR （ 100 MHz，CDCl3）： δ 172.83 （C-1″）， 172.79 （C-1′）， 172.38（C-1?）， 129.70 （C-13″）， 129.50 （C-12″）， 127.56（C-10″）， 127.39 （C-9″）， 68.39 （C-2）， 61.61 （C-1b），61.61 （C-3b），61.61 （C-1a），61.61 （C-3a），33.69 （ C-2″）， 33.55 （ C-2′）， 33.52 （ C-2?），31.44 （ C-16″）， 31.42 （ C-6′）， 31.03 （ C-6?），29.28 （C-7?）， 29.22 （C-5?）， 29.04 （C-4?），28.84 （ C-17″）， 28.69 （ C-15″）， 28.63 （ C-7″），28.59 （ C-5″）， 28.55 （ C-8″）， 26.70 （ C-14″），26.68 （ C-3′）， 25.13 （ C-3″）， 24.37 （ C-11″），24.34 （ C-3?）， 24.19 （ C-4″）， 22.20 （ C-7′），22.20 （C-5′）， 22.09 （C-4′）， 13.62 （C-8′）， 13.62（C-8?）， 13.58 （C-18″）。 以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn) ［14］基本一致，故鑒定為1，3-二辛酰基-2-亞油酸甘油酯。

化合物 8：白色粉末 （甲醇），mp 294～295 ℃。1H-NMR （400 MHz， DMSO-d6）： δ 5.34（1H，m，H-6）， 4.89 （1H， m， H-1′）， 4.43 （2H，t， J＝11.6 Hz， H-6′）， 4.21 （1H， d， J＝7.8 Hz， H-4′），3.65 （1H， m， H-3）， 0.96 （3H， m， H-21），0.91（3H，m，H-19），0.90（3H，d，J＝6.4 Hz，H-4′），0.83 （3H， m， H-29）， 0.81 （3H， m， H-27），0.66 （3H， s， H-18）；13C-NMR （100 MHz， DMSO-d6）： δ 140.43 （C-5）， 121.30 （C-6）， 100.63 （C-1′）， 76.90 （C-3）， 76.72 （C-3′）， 73.42 （C-2′），70.09 （ C-4′）， 61.04 （ C-6′）， 56.14 （ C-14），55.39 （C-17），49.51 （C-9），45.10 （C-24），41.90（C-13）， 40.10 （C-12）， 38.27 （C-4）， 36.80 （C-20）， 36.18 （C-1）， 35.50 （C-10）， 33.30 （C-22），31.32 （C-7）， 29.30 （C-2）， 28.65 （C-25）， 27.77（C-16），25.37 （C-23），23.83 （C-15）， 22.56 （C-28），20.52 （C-11），19.69 （C-26），19.07 （C-19），18.86 （C-21）， 18.54 （C-27）， 11.75 （C-18），11.64（C-29）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn) ［15］基本一致，故鑒定為胡蘿卜苷。

化合物9：橘色晶體（甲醇），ESI-HR-MS m／z：571.159 7 ［M＋H］＋， 分子式為 C32H26O10， mp 292～294 ℃。1H-NMR （400 MHz， CDCl3）： δ 15.25（1H， s， 5-OH）， 12.84 （1H， s， 5′-OH）， 7.06（1H， s， H-9）， 6.99 （1H， s， H-10）， 6.45 （1H，d， J＝2.2 Hz， H-9′）， 6.35 （1H， s，， H-3′）， 6.21（1H， d， J＝ 2.2 Hz， H-7′）， 6.02 （1H， s， H-3），4.04 （3H， s， 10′-OMe）， 3.80 （3H， s， 6-OMe），3.63 （3H， s， 8′-OMe）， 3.45 （3H， s， 8-OMe），2.50 （3H， s， 2-Me）， 2.14 （3H， s， 2′-Me）；13CNMR （100 MHz， CDCl3）： δ 184.06 （C-4）， 182.43（C-4′）， 167.00 （C-2）， 166.38 （C-2′）， 162.31（C-5）， 161.11 （C-8′）， 160.64 （C-10′）， 159.55（C-6）， 156.44 （C-5′）， 156.18 （C-8）， 154.61 （C-10b′）， 150.35 （C-10a）， 140.31 （C-6a′）， 140.16（C-9a）， 116.65 （C-7）， 110.14 （C-5a）， 108.90（C-3′）， 108.13 （C-4a′）， 107.51 （C-3）， 106.85（C-6′）， 105.54 （C-9）， 104.56 （C-10a′）， 103.75（C-4a）， 101.08 （C-10）， 96.52 （C-9′）， 95.88 （C-7′）， 60.71 （5′-OH）， 55.72 （8-OMe）， 55.48 （10′-OMe）， 54.68 （8′-OMe）， 20.16 （2-Me）， 20.03（2′-Me）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn) ［16］ 基本一致，故鑒定為asperpyrone C。

化合物 10：橘色晶體 （甲醇），ESI-HR-MS m／z： 557.142 2 ［M＋H］＋， 分子式為 C31H24O10，mp 268～270 ℃。1H-NMR （400 MHz， DMSO-d6）： δ 15.12 （1H， s， 5-OH）， 12.98 （1H， s， 5′-OH），10.24 （1H， s， 8-OH）， 7.34 （1H， s， H-9）， 7.15（1H， s， H-10）， 6.55 （1H， d， J＝2.2 Hz， H-9′），6.52 （1H， s， H-3′）， 6.22 （1H， d， J＝2.2 Hz， H-7′）， 6.09 （1H， s， H-3）， 3.93 （3H， s， 10′-OMe），3.76 （3H， s， 6-OMe）， 3.58 （3H， s， 8′-OMe），2.48 （3H， s， 2-Me）， 2.13 （3H， s， 2′-Me）；13CNMR （100 MHz， DMSO-d6）： δ 183.90 （C-4），182.45 （C-4′）， 168.52 （C-2）， 168.25 （C-2′），162.07 （C-5）， 161.24 （C-8′）， 160.80 （C-10′），159.53 （C-6）， 156.28 （C-5′）， 155.89 （C-8），154.48 （C-10b′）， 150.12 （C-10a）， 140.34 （C-6a′）， 139.97 （C-9a）， 116.41 （C-7）， 110.05 （C-5a）， 108.52 （C-3′）， 107.54 （C-4a′）， 107.32 （C-3）， 106.78 （C-6′）， 105.45 （C-9）， 104.85 （C-10a′）， 103.24 （C-4a）， 102.06 （C-10）， 96.54 （C-9′）， 96.52 （C-7′）， 61.05 （5′-OH）， 56.08 （10′-OMe）， 55.05 （8′-OMe）， 20.11 （2-Me）， 19.91（2′-Me）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn) ［17］ 基本一致，故鑒定為asperpyrone D。

4 結(jié)論

通過對貓兒屎內(nèi)生真菌DS37發(fā)酵物進(jìn)行提取分離，從中得到10個化合物，其中化合物3～9為首次從該發(fā)酵物中分離得到。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該菌株發(fā)酵物中不僅含有目前報(bào)道的生物堿類、甾體類、有機(jī)酸類等化合物，還含有香豆素類化合物。本研究豐富了貓兒屎內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物的化學(xué)成分，以期為天然產(chǎn)物的開發(fā)提供參考。