微性狀鑒別法在中藥檢驗中應用研究進展

鞠 康， 胡云飛， 王德勝， 李運華， 楊青山， 周建理，?

（1.安徽中醫(yī)藥科學院亳州中醫(yī)藥研究所，安徽亳州 236800；2.亳州職業(yè)技術學院，安徽亳州 236800；3.國家中藥材產(chǎn)品質量監(jiān)督檢驗中心，安徽 亳州 236800；4.安徽中醫(yī)藥大學藥學院，安徽 合肥 230031）

中藥，古稱本草，是我國傳統(tǒng)醫(yī)學和傳統(tǒng)文化的瑰寶，幾千年來為人類健康做出了巨大貢獻[1］，中藥的質量直接關系著中醫(yī)臨床用藥安全。近年來，隨著中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)化與市場化的擴大和轉型升級，中藥質量存在的一些問題也日益凸顯[2］，品種混亂、以偽品充正品、雜質過多 （非藥用部位等）、增重 （摻泥沙或其他物質）、霉變、非法染色等現(xiàn)象層出不窮，傳統(tǒng)檢驗方法如性狀鑒別并不足以區(qū)分；顯微鑒別對基層檢驗人員專業(yè)技術要求較高；現(xiàn)代儀器分析檢驗費時費力，且花費較高，加重了企業(yè)的經(jīng)濟負擔[3］。

微性狀鑒別法是借助儀器觀察中藥材表面 （包括斷面）肉眼不易察覺的細微性狀特征，并采用景深合成技術得出清晰的圖像，進而基于這些微觀特征對中藥材品種與質量情況進行鑒別分析[4］，有著快速、簡便的優(yōu)點，適合中藥基層檢驗人員運用，近年來成為中藥研究熱點之一[5］。然而，該方法在中藥檢驗中的應用尚未報道，本研究就近年來微性狀鑒別法在中藥質量評價中的應用進展進行整理報道。

1 品種鑒別

品種鑒別一直是中藥檢驗與鑒定的難點，微性狀鑒別法基于中藥表面微觀觀察，因而具有獨特的優(yōu)勢。姜紅等[6］采用微性狀觀察鶴虱與蛇床子，鶴虱的邊為棘狀，而蛇床子為比較光滑的脊狀；虞美人種子與罌粟，虞美人種子色較褐暗，略長，表面淺網(wǎng)狀，而罌粟色光亮，較圓，表面深窩狀。鑒別金銀花與山銀花一直是中藥學界比較棘手的問題[7-8］，對其微性狀進行觀察 （苞片、葉下表面被毛、花冠表面放大觀以及花萼放大觀等），得到不同基原藥材均有不同程度的差異，結合性狀、顯微等鑒別結果可以更好地區(qū)別金銀花與山銀花的來源?；覛置潭c細氈毛忍冬分別收載于2015版 《中國藥典》與2008版 《四川省中藥材標準》的山銀花來源之一[9］，二者的花蕾表面被毛情況區(qū)別明顯，灰氈毛忍冬非腺毛眾多，為倒生的短糙伏毛，腺毛偶見，柄短；細氈毛忍冬非腺毛較稀疏，腺毛較多，且展開。大薊與小薊均來源于菊科薊屬植物[5］，解剖鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，在葉上下表面、莖部及花的苞片上的非腺毛形態(tài)、狀花形態(tài)、粘腺上差異明顯。豨薟草為菊科植物豨薟Siegesbeckia oirenatils L、腺梗豨薟S．pubescens或毛梗豨薟S．glabrescens的干燥地上部分，對3種豨薟草的微性狀特征進行觀察 （花盤柄、果實、花序梗等），均有不同程度的差異，可區(qū)分來源[10］。石韋為水龍骨科石韋屬植物石韋 Pyrrosia lingua（Thunb.）Farwell、廬山石韋 P．sheareri（Bak.） Ching 和有柄石韋 P．petiolosa （Christ）Ching的干燥葉，不同來源石韋在干燥葉的星狀毛、斑點凹陷、體部細胞數(shù)、孢子囊群等方面有明顯不同[11］。

馬德強等[12］對4種香茶菜屬植物 （岐傘香茶菜、顯脈香茶菜、香茶菜以及大萼香茶菜）運用微性狀觀察，在葉尖突起程度、毛茸的長短與分布方面有明顯不同，可作為鑒別依據(jù)。邱燕祥等[13］通過對6種紫珠屬藥材 （杜虹花、大葉紫珠、老鴉糊、枇杷葉紫珠、廣東紫珠、窄葉紫珠）的葉上表面、下表面進行微性狀觀察，將葉柄、葉脈、葉肉、腺點進行比較，發(fā)現(xiàn)不同種間具有不同程度的差異。高飛燕等[14］系統(tǒng)研究種子類中藥微性狀鑒定，蕓薹子、芥子易混類群，蕓薹子表面網(wǎng)紋顏色與種子顏色差距不大、稍淺，黃芥子、白芥子以及大白菜種子表面網(wǎng)紋顏色較淺，多為白色，依據(jù)種子表面斑點與顏色可區(qū)別這三者；菥蓂與易混品山菥蓂，兩者表面網(wǎng)紋的深淺且反光不同；牽牛子及其易混類，可依據(jù)表面的非腺毛以及其分布可區(qū)分牽牛子、蔦蘿、小旋花種子。

幕元熹[15］對市場流通較為混亂中藥品種進行研究，發(fā)現(xiàn)廣藿香與藿香梗區(qū)別主要在非腺毛，廣藿香非腺毛較多、較長，而藿香梗僅在溝狀凹陷處有少許雜亂較短非腺毛；旋覆花與條葉旋覆花區(qū)別也在非腺毛的形態(tài)與分布；白蘇葉與紫蘇葉區(qū)別主要在于中部細胞的形態(tài)、葉的網(wǎng)紋顏色等。韋穎等[16］對部分果實種子類中藥進行研究，發(fā)現(xiàn)紫蘇子表面為棕黃色，網(wǎng)紋寬大，邊緣棱線稍寬，白蘇子表面具有白色外層，細密網(wǎng)格紋理樣，脫落后呈寬大網(wǎng)紋，邊緣狹細突起；掌葉大黃、藥用大黃的縱脈貼近翅的邊緣，而唐大黃則是靠近翅的中央處；韭菜種子表面具較多溝壑，板塊樣紋理，而蔥種子表面具有明顯的棱，覆瓦樣突起樣紋理；羌活果實表面近網(wǎng)紋，而寬葉羌活為嚼爛狀。蒲公英為多基原中藥且產(chǎn)地分布較廣，有關于其多品種與混偽品的鑒別研究報道較少，尹利民等[17］對蒲公英正品 （堿地蒲公英、蒲公英、東北蒲公英）及混偽品 （苦苣菜、黃鵪菜、剪刀股）的果實進行微性狀觀察，主要區(qū)別點在于整體形狀、表面特征、冠毛、喙等部位。此外，研究人員[18-22］還對藏藥 “渣馴”、三花蕕、山茱萸、香藤、白巨勝、朱砂等進行微性狀觀察研究，找出相應的鑒別特征。

2 真?zhèn)舞b別

中藥的真?zhèn)舞b別直接影響中藥產(chǎn)品的質量與臨床用藥的安全性。周建理等[4］對八角茴香及其偽品紅茴香進行微性狀特征觀察，發(fā)現(xiàn)主要區(qū)別點在于內果皮細胞，八角茴香呈狹長形且分枝不明顯，而偽品紅茴香為短粗且分枝明顯，偽品莽草為極狹長形。馬逾英等[9］研究發(fā)現(xiàn)，市場采用牛蒡的根切片染色仿制丹參，微性狀觀察偽品具放射狀紋理較密而規(guī)則的導管束，形成層明顯，而丹參具較稀疏的放射狀排列的黃白色導管束，形成層不明顯；白芥子表面呈較為細密的網(wǎng)狀紋理，油菜種子則較為稀疏；市售孜然偽品多采用竹簽包裹淀粉后染色進行摻偽，正品孜然表面具白色剛毛，分果背面有明顯縱棱3條，偽品無以上特征，且針撥后出現(xiàn)淀粉散落。

幕元熹等[15］對全草類中藥材進行微性狀研究，發(fā)現(xiàn)淫羊藿葉脈與葉邊緣處刺毛狀鋸齒不連接，而偽品相連，并于相交處向外延伸；大青葉上、下表面葉脈均有鱗片狀非腺毛，下表面葉脈突出明顯，偽品無毛，上、下表面均有灰綠色或白色的條狀鐘乳體；金錢草表面小點狀細密，分布有較多條帶狀腺體，偶有黑色腺點，非腺毛寶塔狀，葉緣處較光滑，乳頭狀突起偶見；廣金錢草上表面具細密網(wǎng)格，下表面葉緣增厚，氣孔可見，半透明，具細長銀絲狀非腺毛；偽品1（點腺過路黃）表面黃綠色網(wǎng)格明顯，黑色或紅褐色粒狀腺點密布于葉上下表面，葉上、下表面及葉緣處均有多細胞非腺毛，且下表面非腺毛為倒伏狀；偽品2（聚花過路黃）下表面有紅褐色色塊，表面凹凸狀，主脈及葉緣等處分布較多非腺毛，部分為短圓錐狀，具棕黃色腺點；偽品3（巴東過路黃）表面呈集鱗片狀，葉緣處有突起，非腺毛為長絲帶狀，具黑色腺點。

五倍子色澤較深，非腺毛較多，內壁有大量灰白色粉狀物且具深色條紋，而偽品色澤淺，非腺毛少，內壁有少量粉狀物，條紋較淺。孫全峰等[23］運用微性狀鑒別法對10余批市售蒲黃樣品進行觀察，發(fā)現(xiàn)部分樣品中未見蒲黃花粉粒，雜質繁雜 （如黃色塊狀物、條狀物、非腺毛及不明黑色顆粒），可判為偽品。葶藶子[24-25］為十字花科植物播娘蒿Descurainia sophia（L.）Webb.ex Prantl.（南葶藶子）或獨行菜Lepidium apetalum Willd.（北葶藶子）的干燥成熟種子，播娘蒿及其偽品薺菜子、花旗桿在種皮表面長方形網(wǎng)眼與種子長軸的排列方向不同，播娘蒿是橫向排列，而偽品薺菜子是縱向排列，播娘蒿表面為網(wǎng)狀紋理，而偽品花旗桿表面為圓點狀突起；獨行菜及其偽品北美獨行菜、蔊菜種子主要區(qū)別在種子的邊緣，北美獨行菜有刀口樣角質透明的邊緣，而獨行菜無，獨行菜為扁圓形或刀形，而蔊菜種子為卵圓形或橢圓形。紫蘇子[26］與其偽品 （石薺苧、華薺苧、小魚仙草、中華香簡草）的微性狀差異較大，主要鑒別點有網(wǎng)眼大小、表面是否存在向上凸起的網(wǎng)脊以及是否存在腺鱗。天仙子[27］來源于茄科植物莨菪的干燥成熟種子，市場上偽品繁多 （如麥瓶草子、水蓑衣子、菟絲子、地膚子、楮實子、補骨脂和大千生子），采用微性狀鑒別法發(fā)現(xiàn)天仙子及其偽品在光滑度與表面附屬物上具有不同程度差異，可對天仙子進行快速鑒別。

張帆等[28］發(fā)現(xiàn)市場上常以偽品菊花冒充紅花藥材，紅花為管狀花，偽品多為舌狀花；紅花花粉粒呈金黃色，偽品多為紅色；紅花表面呈紅色，色澤均一自然，偽品經(jīng)水浸后由紅色褪至淡紅色或黃色。汪海斌等[29］對薄荷及其偽品留蘭香進行微性狀觀察，發(fā)現(xiàn)薄荷葉上表面的非腺毛明顯長于留蘭香，薄荷葉葉緣和葉脈主脈存在大量的非腺毛，而留蘭香葉緣和葉脈主脈則很少有非腺毛。土鱉蟲[5］為鱉蠊科昆蟲地鱉或冀地鱉的雌蟲干燥體，市場上出現(xiàn)雄若蟲偽充雌性成蟲銷售，微性狀觀察雄蟲生殖口蓋較小，雌蟲較大；雄蟲腹下橫線6條，雌蟲4條；5齡后的雄若蟲中、后胸背板翅芽形成45°角的直行曲線狀，而雌若蟲為60°角的弧形曲線狀。蜈蚣來源于蜈蚣科動物少棘巨蜈蚣的干燥體，近年來市場出現(xiàn)了大量進口藥材[30］，其基原多，難以確定，通過微性狀觀察發(fā)現(xiàn)，不同來源蜈蚣在頭殼以及足的爪、爪刺、跗刺等方面均有較明顯的區(qū)別。穆二廷等[31］通過觀察金錢白花蛇及其偽品蛇背部、鱗片，依據(jù)鱗片的形狀、排列、磷溝以及鱗片斑點與紋理，可判斷真?zhèn)?。崔田等[32］對桃仁、山桃仁、苦杏仁及其常見偽品扁桃仁、甜杏仁進行微性狀觀察，主要區(qū)別點在于脈紋、石細胞形態(tài)和分布，但苦杏仁和甜杏仁的區(qū)分不大，需借助其他方法鑒別。

西紅花[33］為名貴中藥材，市場上偽品頻現(xiàn)，微性狀觀察表明西紅花與其偽品在柱頭顏色、表面黏附物以及花粉粒具有較大區(qū)別。冬蟲夏草偽品一直難以鑒別[34］，運用微性狀觀察可見子座形態(tài)、蟲體背面與足部均有明顯差別，并與性狀、顯微鑒別相結合，可以得到很好的鑒別效果。王雪利等[22］對果實類藥材微性狀進行研究，發(fā)現(xiàn)牛蒡子及其偽品紫穗槐、水飛薊主要在顏色與表面斑塊及其斑塊凹入形成小凹坑的不同；補骨脂及偽品曼陀羅子、白花曼陀羅子、毛曼陀羅子補骨脂表面具內生腺體，具明顯不規(guī)則網(wǎng)紋，而偽品無以上特征；蔓荊子表面粗糙，果表具角質狀紋理，偶見腺鱗及非腺毛，而偽品表面較光滑，具類圓頭狀紋理，未見腺鱗及非腺毛；水紅花具隆起的縱棱 （偽品酸模葉蓼、柳葉蓼子無），正品果表呈細密網(wǎng)紋狀 （偽品垂序商陸呈波狀長條紋）；地膚子胞果五角星形，具放射狀脈紋，且果表有白色點狀突起，偽品藜果實扁圓形，表面具網(wǎng)紋，偶見黃色類腺鱗；女貞子表面具大網(wǎng)紋 （小葉女貞子具圓頭樣突起，均無網(wǎng)紋），表面細胞具不規(guī)則小腔 （鴉膽子表面為點狀小凹坑）；茺蔚子表面具棕黃色不規(guī)則斑塊樣突起，偽品表面凹凸不平，且無不規(guī)則斑塊樣突起。

此外，五味子表面顯油潤，凹凸不平，有的出現(xiàn)類似白霜的物質，南五味子表面具密集的點狀突起，偽品表面具有明顯的極細密的黑色網(wǎng)格狀紋理[15］。高飛燕等[14］對種子類藥材微性狀進行研究，發(fā)現(xiàn)韭菜子及其混偽品種子表面皺縮情況不同，從而區(qū)分真?zhèn)?；急性子及其混偽品水金鳳種子差異表現(xiàn)在表面附屬物的形態(tài)和分布上；白花蛇舌草及其混偽品傘房花耳草種子兩者形狀有較大差異；葉下珠及其混偽品蜜柑草種子表面著生的突起大小不同、突起的排列方式不相同；車前子的種臍與土藿香果柄痕位置不同，表面皺紋分布不同，非腺毛多少和著生位置差異更大；王不留行及混偽品蕓薹子、廣布野豌豆微性狀下差異較大，易區(qū)別；菟絲子偽品泥草子的表面顏色暗淡，沒有明顯種臍和透明突起的棱線，洗去泥沙后表面光滑且顏色較綠。李思詩等[35］對菟絲子及其偽品千穗谷子進行微性狀比較研究，發(fā)現(xiàn)兩者在整體形態(tài)上差異較大，菟絲子為顆粒狀 （偽品千穗谷子為雙凸透鏡狀，如同飛碟）；青葙子及其偽品反枝莧子在表面光澤上差異明顯，青葙子表面光亮 （偽品反枝莧子為光澤較差，有的附著薄膜狀物）。

3 摻雜

摻雜常指非藥用部位冒充藥用部位 （或未除去非藥用部位），多為細小的孢粉類、果實種子類和花類藥材等。周建理等[4］運用微性狀觀察菟絲子中摻入的其他植物的種子及碎片。鄭玉光等[5］觀察發(fā)現(xiàn)，市售血竭中有明顯的麒麟果實碎渣，血竭素含有量高達5%以上 （藥典規(guī)定為1.0%～1.2%）。孫全峰等[23，36］指出， 市場蒲黃藥材中常摻有植物碎屑，摻雜現(xiàn)象嚴重。穆二廷等[37］發(fā)現(xiàn)，市場上海金沙常摻有一些塵沙和黑色雜質。孫春蕾等[38］采用微性狀觀察拍攝結合計算機圖像分析構建藥材微雜質進行快速鑒定法，并成功運用于蒲黃、松花粉等藥材微雜質含有量測定。

4 增重

增重通常指摻入沙石、氯化鈉、糖等增加飲片質量，特別是一些體質疏松藥材。周建理等[4］對摻雜菟絲子進行觀察，能清楚地看出摻入的小土塊、小石塊以及其他植物的種子等雜物。鄭玉光等[5］通過微性狀觀察紅花表面粘附著大量細小的半透明顆粒物，這種增重方式是將粘和劑霧化噴到紅花上，再將細砂粘附于紅花表面，由于顆粒細小不易被察覺。馬逾英等[9］發(fā)現(xiàn)，車前子中人為摻入沙石，這些沙石大小及顏色與車前子相似，但微性狀下外形特征迥然不同，車前子呈橢圓形、不規(guī)則長圓形或三角狀長圓形，略扁，摻入的沙石形狀不規(guī)則，無種子的外形特征。孫全峰等[23］發(fā)現(xiàn)，蒲黃藥材中有添加石膏粉、細沙石等情況。張帆等[28］也發(fā)現(xiàn)，紅花中常摻入糖水或食鹽水、染色的細砂以增加其質量，表明紅花人為增重現(xiàn)象嚴重。汪楠楠等[33］發(fā)現(xiàn)，金銀花中摻入明礬、鹽、滑石粉和石膏粉等異物，不僅會影響金銀花的療效，甚至改變藥性及作用。穆二廷等[37］發(fā)現(xiàn)，市售海金沙中常摻有沙土等雜質。

5 霉變

霉變是引起中藥材質變的重要因素之一，產(chǎn)生的霉菌毒素會給患者帶來安全隱患，同時藥材霉變后還會造成有效成分的降解，目前一些商家對霉變藥材多采用反復洗刷去除霉變藥材表面的霉菌，再投入市場。鄭玉光等[5］從斷面中可以觀察到偽品制何首烏部分有霉變；市售血竭偽品、運輸貯藏不當?shù)纳n術也有發(fā)霉現(xiàn)象。楊青山等[39］選取甘草、菊花、金錢草等9種中藥材進行模型復制，微性狀鑒別法通過藥材皺折及裂隙處的霉菌觀察，進而對霉變藥材進行快速鑒別。李莉等[40］通過微性狀研究發(fā)現(xiàn)，霉變的辛夷藥材苞片的內表面以及花被片的外表面布滿了菌絲體，用水洗刷后的霉變木瓜中仍可清晰看出藥材縫隙和伸入組織中的菌絲體。周建理等[41］運用體式顯微鏡，觀察到霉變藥材百合、大血藤的菌絲。

6 非法染色

非法染色是中藥材通過添加色素或染料來以次充好或冒充正品，不僅降低了中藥藥效，而且部分染色劑具有致癌風險，嚴重影響了患者的用藥安全。鄭玉光等[5］發(fā)現(xiàn)，有用提取后的何首烏經(jīng)染色冒充制何首烏的情況。劉治民等[20］研究表明，朱砂存在有808猩紅染色的問題。張帆等[28］對市售紅花藥材進行微性狀觀察，通過花冠顏色與微性狀特征確定是否為正品，花粉粒為紅色即可認定為染色紅花。穆二廷等[31］運用微性狀鑒別，發(fā)現(xiàn)部分金錢白花蛇的偽品是用黑漆染色的赤練蛇。

7 其他

我國枸杞子主產(chǎn)區(qū)分布較廣，張?zhí)焯斓萚42-43］通過微性狀觀察不同產(chǎn)地藥材種子，發(fā)現(xiàn)寧夏、青海、新疆和瓜州枸杞子種子區(qū)別不大，而寧夏、河北兩地枸杞子種子在大小、顏色、表面形狀及種臍上皆有不同，進一步調研了解到寧夏、青海、新疆和瓜州枸杞子均是引種的中寧枸杞，其基原植物為寧夏枸杞Lycium barbarum L.，而河北枸杞子基原為枸杞 L．chinese Miller的變種北方枸杞 L．chinese Miller var.potaninii（Pojarkova） A.M.Lu， 從而可以判斷出不同產(chǎn)地枸杞子植物基原。車前子炮制前后微性狀比較，發(fā)現(xiàn)炒香者種臍有不同程度的開裂，表面可見起泡現(xiàn)象，而生品卻無[5］。張帆等[28］對市售紅花藥材進行研究，可通過花絲、花藥顏色及水浸后的花冠顏色區(qū)別判斷是否被提取過有效成分。

8 討論

近年來，隨著現(xiàn)代儀器分析技術的不斷發(fā)展，新技術、新方法被不斷運用到中藥檢驗中，彌補了傳統(tǒng)鑒別的不足，提高了中藥標準。但與此同時，質量標準的不斷提高，特別是LC-MS／MS、GC-MS／MS等技術的引用，又增加檢驗的工作量與經(jīng)濟支出。因而，如何制定科學、合理、簡便的質量標準是目前中藥質量研究的難題，尋求新技術、替代法或許是解決質量標準困境的途徑[44］。

微性狀鑒別法是借助儀器觀察中藥材表面肉眼不易察覺的細微性狀特征，并通過圖像分析技術得到清晰圖像，找出中藥材鑒別特征，選取多樣本進行特征鑒別點驗證，與傳統(tǒng)鑒別技術、理化分析等相佐證，進而擬定微性狀鑒別方法。通過文獻整理，該方法已經(jīng)對200余種中藥材進行鑒別，涉及到品種、真?zhèn)巍诫s、增重、霉變、非法染色等中藥質量問題。

隨著攝影技術的發(fā)展[45-46］，今后將不斷嘗試與其他學科方法結合，研制微性狀專用的儀器設備，豐富檢測品種與檢測項目。在此基礎上構建微性狀圖像數(shù)據(jù)庫，并積極運用到檢驗工作中，申請成為國家標準、地方標準或補充檢驗方法，構建快檢平臺。