精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)：全基因組關(guān)聯(lián)研究在藥物基因組學(xué)中的進(jìn)展

牟奕 肖恒怡 董碧蓉

(1成都市第八人民醫(yī)院，四川 成都 610083；四川大學(xué)華西醫(yī)院 2老年病研究室；3老年醫(yī)學(xué)中心)

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)一直遵循精準(zhǔn)理念，不斷融入新理論、新技術(shù)、新設(shè)備以提高臨床實(shí)踐的準(zhǔn)確性和客觀性〔1〕，比如CT、磁共振成像、染色體診斷等技術(shù)。精準(zhǔn)理念克服傳統(tǒng)醫(yī)療的盲目性，減少漏診和誤診，避免治療不足或過度，是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)進(jìn)步的推動(dòng)力。在世界范圍內(nèi)，精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)被研究者廣泛接受〔1,2〕。精準(zhǔn)用藥是精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的重要分支；在美國，三分之一的處方藥被認(rèn)為無效，每年浪費(fèi)約7 126億元人民幣(1 000億美元)；對(duì)患者健康不僅無益，反而具有潛在危險(xiǎn)性〔3〕。藥物反應(yīng)與個(gè)體遺傳差異的密切聯(lián)系早已引起研究者重視，并先后提出了藥物遺傳學(xué)和藥物基因組學(xué)(PGx)〔4〕的概念。如ryanodine受體基因突變是導(dǎo)致全身麻醉藥后高熱的重要原因之一〔5〕。所以，基于藥物遺傳的精準(zhǔn)用藥可以減少臨床用藥的試錯(cuò)法，避免患者暴露于無效或有毒的藥物。鑒于藥物遺傳研究是實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)用藥和精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的必要途徑，本文主要綜述藥物遺傳的重要領(lǐng)域PGx全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS)，闡述藥物遺傳研究的策略共性和特點(diǎn)、最新的進(jìn)展和發(fā)展趨勢(shì)。

1 PGx與GWAS

藥物遺傳學(xué)和PGx的概念并不嚴(yán)格區(qū)分。但特指研究方法時(shí)，兩者也存在差異：藥物遺傳學(xué)是從單基因水平研究藥物反應(yīng)；而PGx是基因組水平的研究。藥物反應(yīng)多數(shù)屬于復(fù)雜性狀；復(fù)雜性狀是由許多遺傳和環(huán)境因子共同作用的結(jié)果；其中，每個(gè)基因?qū)π誀畹倪z傳貢獻(xiàn)非常微弱〔5〕。

藥物遺傳學(xué)和PGx的研究思路存在明顯區(qū)別。藥物遺傳學(xué)研究多采用候選基因法，即根據(jù)已有的藥理學(xué)知識(shí)推測(cè)相關(guān)的基因并加以驗(yàn)證的方法，包括藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和代謝酶。然而，許多藥物反應(yīng)的生物機(jī)制并不清楚，這限制了候選基因法的藥物遺傳研究。PGx采用全基因組關(guān)聯(lián)研究的方法，這種方法無須假設(shè)，可系統(tǒng)地檢測(cè)基因組中成千上萬的遺傳變異，無須任何相關(guān)先驗(yàn)知識(shí)，甚至可發(fā)現(xiàn)復(fù)雜的生物機(jī)制。

藥物的臨床轉(zhuǎn)化不能遺漏任何與藥物反應(yīng)有重要關(guān)系的遺傳因子，PGx GWAS可以排除未知基因?qū)λ幬锓磻?yīng)的影響，比如，最初華法林和氯吡格雷在臨床研究開展之前都進(jìn)行了GWAS驗(yàn)證。事實(shí)上，研究者已經(jīng)知道華法林的劑量穩(wěn)定性與維生素K環(huán)氧化物還原酶復(fù)合體(VKORC)1和細(xì)胞色素氧化酶(CYP)2C9基因相關(guān)，但并不清楚是否存在其他影響華法林劑量的基因〔6〕。

值得注意的是，GWAS的主要研究領(lǐng)域是常見病和常見表型研究，包括老年視網(wǎng)膜黃斑退行性變、2型糖尿病、炎癥性腸病、肥胖等；而PGx GWAS發(fā)展則相對(duì)較為緩慢，PGx GWAS在全世界所有的GWAS研究中所占比例非常小，還不到10%〔7〕。截至2017年，GWAS catalog一共收錄了216個(gè)關(guān)于藥物治療的PGx GWAS研究；其中145個(gè)是關(guān)于藥物療效，69個(gè)是關(guān)于藥物不良反應(yīng)(ADR)或毒性反應(yīng)〔7〕。研究者認(rèn)識(shí)到，藥物反應(yīng)的遺傳效應(yīng)可能要比常見疾病的要強(qiáng)，有助于發(fā)現(xiàn)新的藥物靶點(diǎn)、闡明病理生理和促進(jìn)精準(zhǔn)治療〔8〕。

2 PGx GWAS的方法、特點(diǎn)與進(jìn)展

2.1GWAS的方法學(xué) 概括地說，PGx GWAS是在符合藥學(xué)特點(diǎn)的流行病學(xué)設(shè)計(jì)基礎(chǔ)上，收集大量符合納入條件受試者的基因組DNA，在基因組水平進(jìn)行遺傳關(guān)聯(lián)研究〔9〕。遺傳關(guān)聯(lián)是研究基因型和表型關(guān)系的重要方法；有學(xué)者1996年提出了GWAS，適用于常見疾病/復(fù)雜表型的遺傳研究，可檢驗(yàn)等位基因頻率和表型在人群中的統(tǒng)計(jì)差異；單核苷酸多態(tài)性(SNP)是當(dāng)時(shí)基因分型的主要技術(shù)之一〔10〕。GWAS研究主要基于常見疾病-常見變異假設(shè)(CD-CV)和常見疾病-多重稀有變異(CO-MRV)假說。GWAS不僅是一種復(fù)雜的系統(tǒng)研究方法，而且其快速發(fā)展使標(biāo)準(zhǔn)流程建立存在困難。本節(jié)就GWAS在流行病學(xué)設(shè)計(jì)、基因分型和數(shù)據(jù)處理、統(tǒng)計(jì)分析與數(shù)據(jù)解釋等共性問題進(jìn)行簡要概述。

同所有GWAS研究一樣，PGx GWAS流行病學(xué)設(shè)計(jì)的第一步是準(zhǔn)確界定藥物反應(yīng)的表型(或性狀)，分為定性和定量兩類；表型定義的嚴(yán)謹(jǐn)性會(huì)影響統(tǒng)計(jì)分析。PGx GWAS主要采用病例-對(duì)照、隊(duì)列研究，而橫斷面研究和家系的樣本較難獲得〔6〕。研究設(shè)計(jì)必須充分考慮各種因子間潛在的修飾效應(yīng)或效應(yīng)交互作用，其是指一種風(fēng)險(xiǎn)因子改變另一種風(fēng)險(xiǎn)因子同疾病的關(guān)聯(lián)強(qiáng)度，可能會(huì)影響檢出疾病風(fēng)險(xiǎn)因子的能力〔6〕。常見病SNP的遺傳效應(yīng)微弱，因此GWAS所需樣本量非常大。遺傳富集來提高GWAS的統(tǒng)計(jì)能力，有助于減小樣本量和篩選出更可能攜帶遺傳風(fēng)險(xiǎn)因子的個(gè)體〔11〕。

SNP基因芯片、外顯子組和全基因組測(cè)序是目前主要的基因分型方法。SNP基因芯片的遺傳信息含量遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)常規(guī)測(cè)序且市場(chǎng)價(jià)格相對(duì)低，在PGx GWAS的研究中有很大的應(yīng)用前景。本文以SNP基因芯片為例，論述GWAS在PGx中的應(yīng)用。SNP是GWAS研究的重要分子標(biāo)記〔次要等位基因頻率(MAF)>0.01〕。第一例SNP基因芯片的報(bào)道是在1998年；高密度基因分型芯片是目前市場(chǎng)上主要的產(chǎn)品，比如Illumina公司已開發(fā)出能檢測(cè)1.1M的SNP位點(diǎn)的芯片。自2005年，SNP的GWAS研究方法已經(jīng)趨向成熟，研究結(jié)果重復(fù)性好，提供了許多關(guān)于遺傳變異、生物路徑、人類性狀之間內(nèi)在關(guān)系的認(rèn)識(shí)。藥物反應(yīng)是一類特別的表型，在臨床藥物治療中非常重要，為遺傳研究提供了獨(dú)特的機(jī)遇和挑戰(zhàn)〔4〕。

SNP基因芯片的工作原理是基于堿基的互補(bǔ)，SNP基因芯片的數(shù)據(jù)需要嚴(yán)格的質(zhì)量控制，避免細(xì)微偏倚累積所導(dǎo)致的假陽性結(jié)果〔12〕，包括數(shù)據(jù)的清除和增補(bǔ)。數(shù)據(jù)增補(bǔ)可能會(huì)帶入一些稀有變異，但對(duì)次等位基因頻率小于1%的位點(diǎn)需要進(jìn)行測(cè)序證實(shí)〔13〕。質(zhì)量控制需要在SNP、個(gè)體和人群三個(gè)水平依次進(jìn)行〔12〕。

GWAS基因分型的統(tǒng)計(jì)學(xué)研究通常被分成發(fā)現(xiàn)階段和重復(fù)階段。遺傳學(xué)中，重復(fù)被認(rèn)為是關(guān)聯(lián)研究的金標(biāo)準(zhǔn)。GWAS重復(fù)研究是在另一個(gè)獨(dú)立樣本中驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)階段提示有全基因組顯著性的遺傳位點(diǎn)，這能減少發(fā)現(xiàn)階段的大量假陽性結(jié)果(Ⅰ型錯(cuò)誤)〔14〕。

遺傳關(guān)聯(lián)是研究需要區(qū)分不同的模式包括加性、顯性和隱性等。表型的性質(zhì)不同，檢驗(yàn)方法也有所差異；定性性狀采用常用基因型檢驗(yàn)或等位位點(diǎn)趨勢(shì)檢驗(yàn)。常用基因型檢驗(yàn)是一種基于人群的列聯(lián)表統(tǒng)計(jì)，近似于卡方分布，采用卡方檢驗(yàn)。關(guān)聯(lián)強(qiáng)度可以采用相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)和比值比來進(jìn)行衡量，關(guān)聯(lián)強(qiáng)度>3被認(rèn)為是強(qiáng)關(guān)聯(lián)。趨勢(shì)檢驗(yàn)是判斷被檢驗(yàn)位點(diǎn)是否為表型的協(xié)變量，采用Cochran-armitage檢驗(yàn)。定量性狀的常用基因型檢驗(yàn)可以采用單因素方差分析(ANOVA)，加性模型采用線性回歸模型。GWAS數(shù)據(jù)依靠統(tǒng)計(jì)軟件來完成，包括基于人群的連鎖分析軟件(PLINK)；GWAS統(tǒng)計(jì)顯著性水平通常為P<5× 10-8。為防止大量的統(tǒng)計(jì)分析產(chǎn)生的假陽性，GWAS可采用多參數(shù)回歸模型、分層分析和Mantel-Haenszelχ2檢驗(yàn)等多種方法，尋找獨(dú)立效應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)因素〔10〕。

2.2PGx GWAS的特點(diǎn) PGx GWAS同常見疾病GWAS方法學(xué)有很多共性，同時(shí)PGx GWAS也存在一些特性，主要是指樣本量、表型特征、結(jié)果重復(fù)和效應(yīng)量〔4〕。首先，復(fù)雜疾病GWAS所需樣本量巨大，PGx GWAS對(duì)樣本量的需求視情況而定。截至2012年2月，如果以P<10-7為統(tǒng)計(jì)顯著性標(biāo)準(zhǔn)，PGx GWAS的樣本量多數(shù)是幾百例，極少有超過1 000例受試者；而常見病GWAS在初篩階段，受試者常需數(shù)千例〔15〕。但是，大樣本量依然是PGx GWAS不可忽視的潛在限制因素。

其次，效應(yīng)量與遺傳力缺失。效應(yīng)量是指GWAS所發(fā)現(xiàn)的遺傳關(guān)聯(lián)位點(diǎn)占遺傳度的百分?jǐn)?shù)。遺傳度是指個(gè)體間遺傳差異引起人群表型差異的比例，遺傳度的統(tǒng)計(jì)估計(jì)來自于疾病集群的家系研究。實(shí)際效應(yīng)量小于預(yù)測(cè)遺傳度的現(xiàn)象被稱為“遺傳力缺失”，比如關(guān)于身高的GWAS研究可以解釋10%～16%的身高的遺傳變異，遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于30%～40%的預(yù)測(cè)值〔4〕。PGx GWAS中，藥物反應(yīng)相關(guān)的遺傳位點(diǎn)的效應(yīng)量可以超過10%，這與常見病GWAS顯著不同。

第三,GWAS 有助于闡明藥物反應(yīng)的群體遺傳結(jié)構(gòu)。GWAS可以獲知群體中各種基因型在數(shù)量上的分布情況，即群體遺傳結(jié)構(gòu)。藥物反應(yīng)分為藥物療效和ADR兩大類。藥物療效的PGx GWAS主要關(guān)聯(lián)到微弱到中等的遺傳效應(yīng)，這與常見疾病相似。ADR的遺傳結(jié)構(gòu)更接近于孟德爾疾病，表現(xiàn)出較大的遺傳效應(yīng)(OR>3)，這提示ADR存在較強(qiáng)的藥物-機(jī)體相互作用。目前尚不清楚這種PGx 發(fā)現(xiàn)是一種例外或是正常現(xiàn)象〔15〕。

第四，PGx GWAS作為無偏倚的研究方法，可以在沒有先驗(yàn)證知識(shí)的情況下尋找關(guān)聯(lián)的遺傳因子，實(shí)驗(yàn)結(jié)果常常超過候選基因法的預(yù)期〔4〕。編碼區(qū)是候選基因法的主要研究對(duì)象，然而PGx GWAS發(fā)現(xiàn)的遺傳關(guān)聯(lián)位點(diǎn)僅有18%位于基因編碼區(qū)；換言之，更多與藥物反應(yīng)關(guān)聯(lián)的遺傳位點(diǎn)多位于非編碼區(qū)的DNase超敏位點(diǎn)〔16〕。DNase超敏位點(diǎn)通常是基因調(diào)節(jié)區(qū)，這有助于更好地理解藥物反應(yīng)的生物機(jī)制。

第五，PGx GWAS研究很少采用家系作為研究對(duì)象。藥物基因?qū)W采用病例-對(duì)照研究和隊(duì)列研究比收集擴(kuò)展家系和核心家系更為容易，因?yàn)榛颊叩募覍俨⒉灰欢ǘ冀邮芩幬镏委?，也無從知道藥物反應(yīng)的表型。

2.3PGx GWAS研究進(jìn)展 藥物反應(yīng)是繼常見病/常見表型之后的GWAS研究熱點(diǎn)領(lǐng)域，近兩年主要集中在藥物肝毒性、心血管疾病、內(nèi)分泌代謝性疾病、精神疾病和鎮(zhèn)痛相關(guān)的藥物，比如依法韋侖〔14〕、米諾環(huán)素〔17〕、多黏菌素〔18〕、氯吡格雷〔19,20〕、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACEI)〔21〕、二甲雙胍〔22〕、帕利哌酮〔23〕、芬太尼〔24〕和瑞芬太尼〔25〕等。

肝是藥物代謝的重要器官，藥物誘導(dǎo)的肝毒性(DIH)是臨床關(guān)注的重要問題，具有顯著的自體免疫特征。GWAS研究證實(shí)HLA-B *35:02與米諾環(huán)素〔17〕、SNP rs199650082和依法韋侖〔14〕、rs4842407和依法韋倫-抗結(jié)核藥聯(lián)合治療〔14〕的DIH存在統(tǒng)計(jì)顯著性關(guān)聯(lián)。多黏菌素是用于嚴(yán)重革蘭陰性菌感染抗生素，具有顯著的細(xì)胞毒性；GWAS研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化生長因子β誘導(dǎo)的同源異形盒1因子(TGIF1)和同源異形盒基因(HOX)D10同細(xì)胞毒性存在密切關(guān)系。氯吡格雷是心血管事件二級(jí)預(yù)防的常用藥物，第一例氯吡格雷活性代謝產(chǎn)物的GWAS研究提示CYP2C19是決定代謝產(chǎn)物的最強(qiáng)遺傳決定因子〔19〕；另一項(xiàng)漢族冠狀動(dòng)脈性心臟病患者的研究中發(fā)現(xiàn)了新的氯吡格雷的活性代謝產(chǎn)物濃度相關(guān)遺傳位點(diǎn)〔溶質(zhì)運(yùn)載體基因家族成員14變異體(SLC14)A2 rs12456693，ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體(ABC)A1 rs2487032和N6-甲基轉(zhuǎn)移酶(N6AMT)1 rs2254638〕〔19〕。芬太尼的鎮(zhèn)痛效果受遺傳因素影響，rs13093031，rs12633508和rs6961071同冷加壓誘導(dǎo)的疼痛顯著關(guān)聯(lián)〔24〕；瑞芬太尼的術(shù)中鎮(zhèn)痛效果與TMEM8A基因的rs199670311和SLC9A9基因的rs4839603存在顯著性關(guān)聯(lián)〔25〕。在抗精神藥物帕利哌酮的PGx研究中，12項(xiàng)GWAS結(jié)果的Meta分析提示ADCK1內(nèi)含子的rs56240334可以預(yù)測(cè)帕利哌酮的療效〔23〕。Meta分析是改善GWAS統(tǒng)計(jì)顯著性的重要途徑，來自鹿特丹研究和Tayside蘇格蘭研究的ACEI不耐受者進(jìn)行了GWAS研究，發(fā)現(xiàn)了8個(gè)SNP位點(diǎn)達(dá)到了基因組水平的顯著性，結(jié)果提示相關(guān)基因可能增加ACEI的不良反應(yīng)〔21〕。

然而，PGx GWAS發(fā)現(xiàn)了許多微弱效應(yīng)的遺傳位點(diǎn)，其中不少遺傳變異參與了用藥的風(fēng)險(xiǎn)，但由于全基因組關(guān)聯(lián)的多重檢驗(yàn)而達(dá)不到統(tǒng)計(jì)的顯著性水平；構(gòu)建遺傳風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分(GRS)用于概括大規(guī)模關(guān)聯(lián)研究中達(dá)不到顯著性的單個(gè)遺傳標(biāo)記的組合分值〔26～28〕。如果組合分值同被研究性的關(guān)聯(lián)達(dá)到統(tǒng)計(jì)顯著性，那么就具有對(duì)個(gè)體性狀的預(yù)測(cè)價(jià)值。這個(gè)方法可應(yīng)用于GWAS無顯著性發(fā)現(xiàn)、尋找相關(guān)疾病的共同遺傳基礎(chǔ)和構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)模型。偏頭痛個(gè)體差異的遺傳因素?fù)?jù)估計(jì)是在38%～53%，是許多作用微弱、常見變異的聯(lián)合效果，可用于分析不同頭痛類型與偏頭痛的內(nèi)在表型、評(píng)估藥物遺傳的效果，比如即將上市的偏頭痛治療的降鈣素基因相關(guān)肽單克隆抗體。在他汀藥物治療反應(yīng)的研究中，研究者采用隨機(jī)森林模型構(gòu)建了加權(quán)的GRS(wGRS)，wGRS是評(píng)估他汀藥物反應(yīng)的遺傳加性效應(yīng)的有力工具〔27〕。遺傳性QT評(píng)分包括了61個(gè)常見遺傳變異，能解釋相當(dāng)一部分藥物誘導(dǎo)的QT延長和作為藥物誘導(dǎo)的尖端扭轉(zhuǎn)型室速的重要預(yù)測(cè)因子〔28〕。

老年人群是臨床用藥的特殊人群，PGx GWAS的成果逐漸引起老年領(lǐng)域的關(guān)注。抑郁癥在老年人群中高發(fā)，而服用三環(huán)/四環(huán)抗抑郁劑常常導(dǎo)致QT間期的延長，增加心血管疾病的發(fā)病率和死亡率〔29〕。為此，基因組流行病學(xué)的心臟與衰老隊(duì)列研究(CHARGE)開展了一項(xiàng)三環(huán)/四環(huán)抗抑郁劑與RR/QT間期的GWAS研究，顯示歐洲人的RR間期受BRE和泛素結(jié)合酶2E2基因(UBE2E2)基因同三環(huán)類藥物相互作用的影響，拉丁人的QT間期受到TGFBR3遺傳變異同三環(huán)類藥物相互作用的影響〔29〕。老年人是服用他汀藥物的主要人群，rs7412、 rs4420638、rs2002042和rs646776對(duì)他汀藥效有重要影響；在75～80歲的人群中，wGRS同低水平的低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)顯著相關(guān)〔27〕。

3 展望

借助科技的日新月異，精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)將不斷得以完善。一方面，隨著測(cè)序成本的降低，全基因組測(cè)序(WGS)會(huì)最終取代基于芯片的基因分型；但GWAS作為遺傳研究方法，依舊保持重要作用。另一方面，基因組雖是精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的重要支柱，但精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展不會(huì)局限在遺傳領(lǐng)域〔30〕，還將延伸到包括轉(zhuǎn)錄組、蛋白組、干細(xì)胞、營養(yǎng)、代謝、微生物、微量元素等多個(gè)領(lǐng)域，形成環(huán)境-社會(huì)等外界因素與人體自穩(wěn)態(tài)維持為核心的多層次健康管理模式。老年用藥風(fēng)險(xiǎn)和醫(yī)藥支出需要精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的支持。衰老過程中，由于老年人器官功能及功能儲(chǔ)備下降、多病共存及多藥聯(lián)用等因素，老年藥物不良反應(yīng)的發(fā)生率是青年人的7倍。例如，鎮(zhèn)靜、催眠和抗抑郁藥物增高了老年跌倒風(fēng)險(xiǎn)〔31〕。據(jù)報(bào)道，藥物遺傳檢測(cè)能使65歲以上患者的住院率從16.1%下降到9.8%，每個(gè)患者平均節(jié)約1 553元人民幣(218美元)〔32〕。因此，精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)和精準(zhǔn)用藥將會(huì)成為老年醫(yī)學(xué)探索的重要未知領(lǐng)域，并為臨床提供診療的指南。