我國熱帶作物多主棒孢種群多樣性及致病力分化分析

李博勛 馮艷麗 劉先寶 蔡吉苗 陸翠梅 鄭肖蘭 黃貴修

摘? 要? 多主棒孢（Corynespora cassiicola）是一種全球分布的重要植物病原真菌，寄主范圍十分廣泛。近年來，該病原菌侵染危害多種熱帶作物，并在局部地區(qū)大面積暴發(fā)流行，造成巨大的經(jīng)濟損失。本研究利用核糖體轉錄間隔區(qū)（Internal transcribed spacer， ITS）、翻譯延伸因子（translation elongation factor 1 alpha， EF-1α）、β微管蛋白（β-Tubulin， TUB），對來自橡膠樹、木薯、番木瓜和瓜菜等多種熱帶作物的70株多主棒孢進行種群多樣性分析。結果發(fā)現(xiàn)，利用最大似然法，在相似系數(shù)為0.97時可將供試菌株劃分為兩大遺傳類群：類群Ⅰ為國內(nèi)和一些國外橡膠樹的多主棒孢;類群Ⅱ為其他寄主多主棒孢，遺傳類群與寄主來源具有顯著的相關性。致病力測定表明，多主棒孢種內(nèi)致病力分化明顯，類群Ⅰ的橡膠樹多主棒孢僅能侵染橡膠樹，不能侵染其他寄主，具有明顯的寄主?；裕也煌乩韥碓吹木曛虏×Σ町惒伙@著。類群Ⅱ的多主棒孢在不同寄主間可以相互侵染，但菌株在致病力和發(fā)病癥狀上存在一定差異，表現(xiàn)出對其原寄主的高度致病力。多基因序列聚類分析與致病力分化分析結果具有較好的一致性，這為研究我國熱帶作物多主棒孢的種群結構、主要致病型以及為多主棒孢病害的發(fā)生、流行和防治提供了理論依據(jù)。

關鍵詞? 熱帶作物;多主棒孢病菌;種群多樣性;致病力分化

中圖分類號? S432.4+4? ? ? 文獻標識碼? A

Genetic Diversity and Pathogenic Variability Among Isolates of Corynespora cassiicola from Tropical Crops in China

LI Boxun， FENG Yanli， LIU Xianbao， CAI Jimiao， LU Cuimei， ZHENG Xiaolan， HUANG Guixiu*

Environment and Plant Protection Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory of Integrated Pest Management on Tropical Crops， Ministry of Agriculture and Rural Affairs / Hainan Key Laboratory for Monitoring and Control of Tropical Agricultural Pests， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract? Corynespora cassiicola is an important plant pathogenic fungus distributed globally and has a wide host range. In recent years， C. cassiicola had infected a variety of tropical crops. The diseases caused by C. cassiicola has outbroken in some areas， causing huge economic losses. In this study， we used ITS， EF-1α and β-tubulin genes to analyze the population diversity of isolates of C. cassiicola collected from rubber trees， cassava， papaya， tropical fruits and vegetables. When the similarity coefficient was 0.97， the tested isolate could be divided into two divergent clusters by the maximum likelihood method. Cluster I was the isolates of rubber trees， which came from China and some foreign countries， and cluster II was the isolates of other hosts. There was significant correlation between genetic clusters and host source. Pathogenicity test showed that the pathogenic differentiation of C. cassiicola was obvious. The isolates of cluster I could only infect rubber trees， but could not infect other hosts. They had obvious host specificity， and there was no significant difference in pathogenicity among isolates from different geographical sources. C. cassiicola in cluster II could infect each other among different hosts， but the pathogenicity and symptoms of the isolates were different， showing a high pathogenicity to the original hosts. The results of genetic diversity and pathogenic variability showed a good consistency， which would provide a theoretical basis for understanding the population structure and main pathogenic types among the isolates of C. cassiicola from tropical crops in China， as well as the occurrence， epidemic and control method of the diseases caused by C. cassiicola.

Keywords? tropical crops; Corynespora cassiicola; population diversity; pathogenic variability

DOI? 10.3969/j.issn.1000-2561.2019.12.020

多主棒孢病菌（Corynespora cassiicola）是為害我國熱帶作物的主要病原真菌，其寄主范圍廣、癥狀類型多樣、生理小種復雜。由該病原菌侵染引起的橡膠樹棒孢霉落葉病是橡膠樹最為嚴重的病害之一，在全球主要產(chǎn)膠國普遍發(fā)生，造成的經(jīng)濟損失巨大[1]。同時該菌也能為害木薯、番木瓜、香蕉等熱帶果蔬，并在局部地區(qū)暴發(fā)流行。李寶聚等[2]對我國蔬菜多主棒孢病害進行了調(diào)查，發(fā)現(xiàn)海南、云南、廣東、廣西、山東、河北、北京、遼寧、吉林、河南等地的黃瓜、茄子、番茄、菜豆、辣椒受多主棒孢的危害十分嚴重，每年發(fā)生面積超過66.7萬hm2，損失超過50億元。再加上該病原菌的侵染破壞力極強，給防治帶來了巨大困難，近年來已成為我國主要熱帶作物的主要病害之一。

多主棒孢在分子水平上存在明顯的差異，具有豐富的遺傳多樣性。Silva利用RFLP和RAPD標記將采自斯里蘭卡和澳大利亞地區(qū)的多個寄主植物上的多主棒孢劃分為7個遺傳類群，發(fā)現(xiàn)遺傳類群和樣本采集地、致病力、菌株的生長速率之間具有顯著相關性[3]。但也有學者指出，多主棒孢的遺傳類群與致病型、地理或寄主來源不具有相關性[4]。Smith等[5]利用高變異核位點GA4，分析了4個國家58個寄主上多主棒孢進行系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)其種內(nèi)遺傳多樣性豐富，而且不同類群與致病力和寄主來源密切相關。Dixon等[6]利用Cassiicolin毒素基因、ITS、ga4、caa5以及act1基因序列分析了不同寄主植物上的143株多主棒孢，進一步證實了遺傳類群與寄主來源、致病性和生長速率有關，但是與地理來源無關。Shimomoto等[7]利用多基因（β-微管蛋白、EF-1α、鈣調(diào)蛋白和肌動蛋白）分析了64株多主棒孢，發(fā)現(xiàn)遺傳類群與致病型一致。隨著分子生物學技術的發(fā)展和對多主棒孢病害研究的深入，學者們開始利用不同毒素類群的Cassiicolin毒素基因對多主棒孢的致病型進行了詳細的劃分，這也是現(xiàn)階段研究多主棒孢分類的主要依據(jù)[8]。Déon等[8]分析了橡膠樹上6個Cassiicolin毒素類群（Cas1～ Cas6型）基因的11個菌株對兩個橡膠樹品種（RRIM600、PB260）的致病力，發(fā)現(xiàn)不同毒素類型的菌株在致病力強弱上存在顯著差異，Cas1型的致病力最強。而對于不同寄主來源多主棒孢的遺傳多樣性與致病力分化之間的研究進展很少。為此，本研究利用多基因序列和致病力分化測定等方法，分析我國主要熱帶作物和果蔬多主棒孢病菌的遺傳種群結構，進一步明確我國多主棒病菌的優(yōu)勢種群及其致病力分化情況，這為該病原菌的發(fā)生和流行規(guī)律、生理小種的確定以及防控策略的制定提供理論依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 供試菌株和材料? 70株多主棒孢（表1）由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所熱帶工業(yè)原料作物病害研究組分離和保存。致病力測定選用的橡膠樹和木薯種苗均由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所演豐基地保存，瓜菜種苗為市場購買種子培育。

1.1.2? 培養(yǎng)基和試劑? PDA培養(yǎng)基參照《植病研究方法》配制[9]，用于多主棒孢菌株的培養(yǎng)。引物（見表1）均由華大基因股份有限公司合成;克隆載體pMD18-T、PCR擴增反應試劑購于TAKARA公司;pMD-18T載體、Taq DNA聚合酶、dNTP等購自寶生物工程（大連）有限公司。DNA Marker、Trans5α大腸桿菌E. coli感受態(tài)購自北京全式金生物技術有限公司。其他化學試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3? 儀器與設備? Bio-Rad T100型梯度PCR儀，美國伯樂公司; UVI FireReader凝膠成像系統(tǒng)，英國UVItec公司。

1.2? 方法

1.2.1? DNA提取、PCR擴增和測序? 采用CTAB方法[10]提取病原菌DNA，用超微量分光光度計進行DNA質量測定，用ITS、EF-1α、TUB、Cassiicolin

等多基因的引物序列（表2）對病原菌目的基因進行PCR擴增，反應條件參照Déon等[8]的方法，擴增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，經(jīng)Omega Bio-Tek試劑盒進行目的條帶回收，之后克隆到pMD18-T載體，轉化Trans5α大腸桿菌感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆轉化子，送其中的3個克隆至華大基因技術有限公司進行序列測定。

1.2.2? 多基因序列分析、遺傳距離計算和系統(tǒng)發(fā)育樹構建? 將序列在NCBI中進行BLAST分析，利用CodonCode Aligner V7.0.1去除測序峰圖的低質量區(qū)域、完成峰圖校對拼接和引物序列切除，應用PAUP 4.0軟件計算種內(nèi)遺傳距離;利用MEGA 7.0軟件最大似然法中的Tamura-Nei model構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3? 致病力分化分析? 根據(jù)多基因序列分析結果，從每個類群里挑選代表性的27個菌株，用無菌水配制孢子懸浮液濃度為105個/mL，于盆栽黃瓜長出3片真葉，番茄、辣椒、豇豆長出4片真葉時進行噴霧接種，每株接種15 mL孢子懸浮液，每個菌株設3次重復，以清水接種為對照，每個重復15株苗，接種后置于25 ℃光照培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)。在接種后7～14 d，按瓜菜棒孢葉斑病情分級標準[11]進行統(tǒng)計。橡膠樹葉片接種法參照農(nóng)業(yè)行業(yè)標準《熱帶作物種質資源抗病蟲鑒定技術規(guī)程橡膠樹棒孢霉落葉病》（NY/T 3195-2018）[12]。致病性分析所獲數(shù)據(jù)均采用SAS 9.0軟件進行統(tǒng)計分析，多重比較采用Duncans新復極差檢驗（LSR test）。

2? 結果與分析

2.1? ITS、EF-1α、TUB單基因序列分析

用ITS1/ITS4、EF1-728F/EF1-986R和TUB-F/ R的3種引物對供試的70株多主棒孢菌株進行ITS區(qū)、EF-1α和TUB序列的擴增，分別得到大小約為531、304、954 bp的條帶。所有菌株序列在NCBI經(jīng)BLAST比對分析，均為多主棒孢（C. cassiicola），并將各單基因的序列提交至GenBank（表1）。通過序列間的比對發(fā)現(xiàn)，在ITS1區(qū)的第87位點存在單核苷酸多態(tài)性（C/T），其他序列完全一致。

系統(tǒng)發(fā)育樹的分析結果顯示，ITS、EF-1α、TUB 3個單基因序列均能將供試的71個多主棒孢菌株劃分為2大遺傳類群（圖1，圖2，圖3），第Ⅰ類群均為橡膠樹多主棒孢，來源于國內(nèi)各橡膠主產(chǎn)區(qū)以及境外植膠國，不同地理來源的菌株之間沒有顯著的差異;第Ⅱ類群為其他寄主多主棒孢，包括木薯、番木瓜、黃瓜、番茄、豇豆、茄子、西甜瓜等，但也有8株橡膠多主棒孢菌株（占供試橡膠多主棒孢的17%），其中3株（HCcYD1、CYDB3、CYDB2）來自印度，3株（HCcYNHZ M01-1、HCcYNHZM01-2、HCcYNHZM01-3）來自越南，2株（HCcGDMM1402、HCcGDMM1406）來自廣東茂名，這8個菌株與第Ⅰ類群的橡膠多主棒孢遺傳距離較遠，存在顯著的差異。從聚類圖的分支上看，印度橡膠多主棒孢（HCcYD1、CYDB3、CYDB2）與番木瓜多主棒孢同在一個小分支，親緣關系最近;越南橡膠多主棒孢（HCcYNHZM01-2）與萵筍、木薯多主棒孢親緣關系最近，而HCcYNHZM01-1、HCcYNHZM01-3與辣椒多主棒孢同在一個小分支;來自廣東茂名的2株橡膠多主棒孢（HCcGDMM1402、HCcGDM M1406）與黃瓜多株棒孢同在一個小分支，親緣關系最近。

從上述結果可以看出，3個單基因的序列的聚類圖基本上能將橡膠多主棒孢和其他寄主來源的多主棒孢進行有效區(qū)分，而且不同寄主之間的遺傳差異顯著高于地理來源之間的差異。說明寄主因素與多主棒孢的遺傳變異間的相關性更為顯著，但也有少部分橡膠多主棒孢與其他寄主來源多主棒孢的遺傳距離較為接近。從遺傳進化的角度分析，這少部分橡膠多主棒孢可能來源于其他寄主，存在交互侵染的現(xiàn)象，也有可能為橡膠多主棒孢的一個新的類群。

2.2? ITS- EF-1α-TUB多基因序列分析

采用3種多基因的部分序列進行拼接，共同構建系統(tǒng)發(fā)育樹，對來自柬埔寨、越南、印度以及我國的6個省份，10個寄主（橡膠樹、木薯、番木瓜、黃瓜、茄子、辣椒、豇豆、萵筍、西甜瓜、番茄）上的70株多主棒孢進行遺傳進化樹的構建（圖4），發(fā)現(xiàn)不同來源的多主棒孢菌株間存在豐富的遺傳多樣性。根據(jù)多基因序列聚類分析，利用最大似然法，在相似系數(shù)為0.97時可將供試菌株被劃分為兩大遺傳類群。第Ⅰ類群，為橡膠多主棒孢，來源于我國云南、海南、廣東和廣西等橡膠主產(chǎn)區(qū)以及柬埔寨、越南等國外的橡膠多主棒孢，這一類群的菌株與年份、地理來源之間不具有相關性。但越南（HCcYNHZM01-1）和柬埔寨（HCcJPZ03、HCcJPZ04、HCcJPZ05）的橡膠多主棒孢菌株雖然與國內(nèi)的橡膠多主棒孢同屬于一個類群，但處于不同的小分支上，推測國內(nèi)和國外的橡膠多主棒孢菌株間存在略微的差異，而國內(nèi)各植膠區(qū)的橡膠多主棒孢間無明顯差異，所有菌株都聚類在一個分支上，支持率為98%（圖4）。第Ⅱ類群，為不同寄主來源的多主棒孢菌株，與單基因序列聚類分析結果一致。其中供試的所有番木瓜多主棒孢CpCcHNQZ1603、CpCcYNM

X1501、CpCcHNDZ02、CpCcHNQZ1605、CpCcY N02、CpCcJPZ01（柬埔寨番木瓜）和所有黃瓜多主棒孢PaCcHB03、PaCcSD02、PaCcSD04、PaCcHNS Y1703、PaCcHNSY1705、PaCcHNSY 1708、PaCcH NSY1711各自成為一個小分支，單獨聚為一類，支持率為99%和63%。西甜瓜多主棒孢（CmCcHN01、CmCcHN03）、豇豆多主棒孢（VsCcHN07、VsCcHN09、VsCcHN10）和茄子多主棒孢（SmCcHN01）分屬于同一個小分支，支持率為65%。木薯多主棒孢（MeCcHN01、MeCcGD02）和萵筍多主棒孢（LsCcHNSY1101、LsCcHN SY1102）的親緣關系最近。

從多基因序列分析的結果可以看出，不同寄主來源的多主棒孢菌株之間存在顯著的差異，能將國內(nèi)、外的橡膠多主棒孢菌株與其他寄主來源的多主棒孢菌株嚴格區(qū)分開，不同地理來源的菌株之間沒有顯著的差異，而且種內(nèi)相似度較高，推測這類菌株可能存在寄主?；裕枰ㄟ^致病力測定進一步驗證。除橡膠之外的其他寄主多主棒孢的種群分化關系不明顯，盡管有些寄主的多主棒孢聚類在不同的小分支上，但遺傳距離還是比較近，推測第 Ⅱ 類群的多主棒孢之間存在交互侵染的可能。

2.3? 不同寄主來源多主棒孢的致病力分化分析

根據(jù)多基因序列分析結果，從每個類群中選取出27株不同寄主來源的多主棒孢進行致病力測定。在此之前，參照法國學者報道的多主棒孢Cassiicolin毒素類型的劃分[8]，明確了這27株多主棒孢的毒素類型（表3）。采用SAS軟件的Ward最小方差進行聚類分析，將27株多主棒孢分為Clade A和Clade B 2種主要的致病型（圖4，圖5，表3），其中Clade A以Cas5毒素類型為主，Clade B型均為Cas2毒素類型，目前供試的多主棒孢菌株僅存在2種毒素類型，與劉先寶等[13]2016年報道的結果一致。

A1致病型的菌株為多基因序列聚類分析第Ⅰ類群的12株橡膠樹多主棒孢，來自國內(nèi)橡膠主產(chǎn)區(qū)（云南、海南、廣東、廣西）以及柬埔寨，這一致病型的菌株只能侵染橡膠樹，不能侵染其他寄主，表現(xiàn)出明顯的寄主?；裕ū?），進一步驗證了多基因聚類分析的結果。A2致病型的橡膠多主棒孢HCcYNHZM01-3（越南）、辣椒多主棒孢LJCcHN01和番茄多主棒孢LeCcHNSY02既能侵染橡膠樹，也能侵染其他瓜菜，但對豇豆表現(xiàn)出弱致病力。分屬于第 Ⅱ 遺傳類群的其他寄主多主棒孢在橡膠、辣椒、黃瓜、豇豆、番茄上能進行相互侵染，其中B1致病型的番木瓜多主棒孢對黃瓜致病力最強，但不侵染豇豆和番茄;B3致病型的木薯多主棒孢不能侵染黃瓜和番茄，對辣椒和豇豆表現(xiàn)出弱致病力;另外，B4致病型的黃瓜多主棒孢（PaCcSD04、PaCcHB03）和橡膠多主棒孢（HCcGDMM1402）除了對番茄表現(xiàn)出弱致病力外，對其他寄主的致病力都很強。

根據(jù)致病力測定結果發(fā)現(xiàn)，多主棒孢的遺傳類群與致病力分化具有明顯的相關性，致病力的結果能較好地和多基因序列的聚類結果對應。第 Ⅰ 類群的多主棒孢，在致病型上屬于Clade A，毒素類型以Cas5型為主，致病力測定發(fā)現(xiàn)，A1致病型只能侵染橡膠樹，不能侵染其他寄主，表現(xiàn)出明顯的寄主專化性，A2致病型的橡膠多主棒孢既能侵染橡膠樹也能侵染其他寄主。第 Ⅱ 類群，主要以其他寄主多主棒孢為主，也有部分橡膠多主棒孢，致病型上屬于Clade B，毒素類型均為Cas2型，致病力測定不同寄主來源的多主棒孢之間能進行相互侵染，但致病力和發(fā)病癥狀上存在一定差異。

3? 討論

本研究采用分子系統(tǒng)學的分析方法，利用ITS、EF-1α、TUB等多基因序列分析了我國主要熱帶作物和果蔬上的70株多主棒孢的遺傳種群結構和優(yōu)勢種群，發(fā)現(xiàn)不論是單基因還是多基因構建的系統(tǒng)發(fā)育樹，均能較好的將供試菌株劃分為2大遺傳類群，第Ⅰ類群有40株菌，均為國內(nèi)和國外橡膠多主棒孢，國內(nèi)（云南、海南、廣東、廣西）的菌株與柬埔寨和越南的菌株高度同源，從地理來源上沒有顯著的差異。第Ⅱ類群有30株菌，為其他寄主多株棒孢和少數(shù)幾株橡膠多主棒孢，而且相同寄主的多主棒孢能聚到一起，遺傳進化上具有高度的相似性。說明供試的多主棒孢與寄主來源關系密切，但與地理來源不具有顯著的相關性，這與Qi等[4]利用RFLP和RAPD以及Dixon 等[6]利用肌動蛋白、ITS區(qū)以及2個多態(tài)性位點的分析結果一致。

致病力分化分析結果顯示，致病型A1的橡膠多主棒孢只能侵染橡膠樹不能侵染其他寄主，具有明顯的寄主?；裕煌乩韥碓吹南鹉z多主棒孢在致病力上沒有顯著的差異。致病型A2和B1的菌株既能侵染橡膠也能侵染其他瓜菜寄主，不如A1型的致病力強。致病型B3和B4的多主棒孢菌株之間均能進行交互侵染，但菌株間的致病力存在一定的差異，表現(xiàn)為部分多主棒孢菌株對其分離寄主的致病力往往高于其他寄主，而有些菌株對非自身寄主之外的其他寄主表現(xiàn)出弱致病力或不致病。說明多主棒孢菌盡管寄主范圍十分廣泛，但對其原寄主的致病力是最強的，這與多主棒孢與其原寄主植物可能存在協(xié)同進化的關系，在寄主長期作用的影響下，也導致多主棒孢具有寄主?；訹14-15]。另外，發(fā)現(xiàn)采集自相同地點、相同寄主的瓜菜（如西甜瓜和豇豆）多主棒孢在致病力上也存在較大的差異，推測在同一個生態(tài)系統(tǒng)中這些菌株在個體之間可能存在生理生化和遺傳分化上的差異，這導致病原菌對寄主的侵染力、定殖、癥狀以及危害程度上的差異。因此，對多主棒孢主要優(yōu)勢種群和主要致病型的確定，能為多主棒孢的流行特點分析、抗病品種的選育以及防控策略的制定奠定重要的理論依據(jù)。

總體來看，結合多基因序列聚類分析和致病力測定的結果，能較好地反應多主棒孢的遺傳結構、優(yōu)勢種群以及主要致病型等，而且多基因序列聚類分析與致病力分化分析結果能相互印證，具有較好的一致性。就橡膠樹多主棒孢而言，第Ⅰ類群是我國橡膠樹多主棒孢的優(yōu)勢種群具有明顯的寄主專化性，致病型A1是其主要的致病型，結合橡膠樹棒孢霉落葉病在我國的發(fā)生歷史[16]，不排除橡膠多主棒孢是從我國邊境的植膠國通過種苗調(diào)運、貿(mào)易往來等途徑傳入國內(nèi)的可能性，但仍需要更多地理來源的菌株和大量的證據(jù)進行證實。就其他熱帶果蔬多主棒孢而言，雖然不像橡膠多主棒孢具有明顯的寄主專化性，但不同寄主間多主棒孢的致病力存在一定的差異，表現(xiàn)出對其原寄主的高度致病力，加上寄主范圍十分廣

泛，在不同寄主上表現(xiàn)的癥狀也具有顯著的差異，本研究基本查明了這些熱帶果蔬多主棒孢的種群結構和主要致病型，為多主棒孢病害的發(fā)生、流行和防治提供了理論依據(jù)。

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