根施5-氨基乙酰丙酸對(duì)亞適宜溫光下黃瓜幼苗生長(zhǎng)的影響

董榮榮 鄧嬌燕 郭 佳 于賢昌 賀超興 李衍素

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081)

近年來(lái)，我國(guó)設(shè)施蔬菜面積和產(chǎn)值不斷擴(kuò)大，2014年已達(dá)到386萬(wàn)hm2，約占蔬菜總產(chǎn)值的50%[1]。黃瓜(Cucumis sativusL.)是世界各地普遍栽培的蔬菜作物之一，也是我國(guó)北方設(shè)施栽培的主要蔬菜。然而，冬春季節(jié)設(shè)施內(nèi)長(zhǎng)期存在亞適宜溫光環(huán)境(15～18℃/10～12℃，165～300 μmol·m-2·s-1)[2]，嚴(yán)重影響了黃瓜的生長(zhǎng)、產(chǎn)量和品質(zhì)。研究表明，亞適宜溫光可引起黃瓜幼苗生理代謝活動(dòng)失調(diào)，降低活性氧清除系統(tǒng)的防御能力，誘導(dǎo)膜脂過(guò)氧化作用，使膜結(jié)構(gòu)和功能受損[3]。同時(shí)，亞適宜溫光會(huì)降低黃瓜幼苗的葉綠素含量、抑制碳同化相關(guān)酶活性，導(dǎo)致光合作用受阻，生長(zhǎng)延緩，進(jìn)而降低黃瓜產(chǎn)量和品質(zhì)[4]。因此，如何緩解亞適宜溫光環(huán)境對(duì)黃瓜生長(zhǎng)、產(chǎn)量和品質(zhì)產(chǎn)生的不利影響是研究者們亟待解決的難題。

5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid，ALA)，又名δ-氨基酮戊酸，是一種廣泛存在于動(dòng)植物等機(jī)體活細(xì)胞中的非蛋白氨基酸，是生物體合成葉綠素、血紅素和維生素B12等四吡咯環(huán)色素必不可少的物質(zhì)，參與生物體中多種生物化學(xué)反應(yīng)，具有植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的作用[5]。隨著人類社會(huì)對(duì)生態(tài)和環(huán)境安全的日益關(guān)注，具有無(wú)毒、無(wú)公害、在環(huán)境中易降解無(wú)殘留特點(diǎn)[6]的ALA備受國(guó)內(nèi)外學(xué)者及產(chǎn)業(yè)界的重視。研究表明，外源ALA高濃度時(shí)可以作為光敏除草劑[7]，低濃度時(shí)可以增強(qiáng)植物的耐鹽[7-8]、弱光[9]、低溫[10-11]、高溫[12]、干旱[13]等抗逆性，具有促進(jìn)種子萌發(fā)[14]、幼苗生長(zhǎng)[11]、提高抗氧化酶活性、增強(qiáng)活性氧清除能力[15]、調(diào)節(jié)植物葉綠素合成、增強(qiáng)光合作用能力[16]、提高產(chǎn)量和改善果實(shí)品質(zhì)[17]等生理作用。目前，對(duì)ALA的研究主要集中在通過(guò)葉面噴施ALA提高植物光合效率、促進(jìn)植株生長(zhǎng)發(fā)育和提高植物抗鹽能力等方面。研究表明，無(wú)論是根施還是葉面噴施[7]，ALA均能對(duì)植物產(chǎn)生生理效應(yīng)，但葉面噴施會(huì)導(dǎo)致空氣濕度加大，使植物更易感染病害。前人研究發(fā)現(xiàn)葉面噴施ALA預(yù)處理可通過(guò)提高抗氧化酶活性有效緩解高溫等脅迫對(duì)黃瓜幼苗的生長(zhǎng)抑制[12]。燕飛[18]研究發(fā)現(xiàn)噴施外源ALA可提高鹽脅迫下黃瓜幼苗的葉片水勢(shì)，緩解植物礦質(zhì)元素吸收平衡的紊亂。與葉面噴施相比，根施ALA更符合現(xiàn)代設(shè)施農(nóng)業(yè)生產(chǎn)省工省時(shí)的需求，且不需要考慮ALA見(jiàn)光易分解的特性。目前，關(guān)于根施ALA對(duì)亞適宜溫光下黃瓜幼苗生長(zhǎng)、抗氧化酶活性、礦質(zhì)元素吸收和分配及葉綠素合成過(guò)程中相關(guān)基因表達(dá)影響的研究尚鮮見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究以人工氣候室模擬亞適宜溫光環(huán)境，通過(guò)根區(qū)灌溉ALA處理，探究根施ALA能否緩解亞適宜溫光對(duì)黃瓜幼苗生長(zhǎng)產(chǎn)生的不利影響，并確定其最適施用濃度，以期為ALA緩解植物亞適宜溫光傷害提供理論依據(jù)，并為ALA在設(shè)施農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試黃瓜品種為中農(nóng)26號(hào)，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所提供。供試藥劑為5-氨基乙酰丙酸鹽酸鹽(ALA)，由北京科創(chuàng)欣達(dá)科技有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2016年10月-2017年2月在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所人工氣候室進(jìn)行。選取飽滿、大小一致的黃瓜種子，55℃溫水浸種后，于30℃恒溫箱中催芽至露白，播于32孔穴盤中，基質(zhì)為“商道”育苗基質(zhì)。一葉一心時(shí)，將穴盤剪開，然后挑選生長(zhǎng)一致的幼苗移至人工氣候室，進(jìn)行根施不同濃度ALA(0、1、5、10 mg·L-1)和亞適宜溫光(光周期為 12 h/12 h，相對(duì)濕度為80%，溫度為18/12℃，光照強(qiáng)度為180±20 μmol·m-2·s-1)處理，以亞適宜溫光下施清水處理為對(duì)照。試驗(yàn)共設(shè)4個(gè)處理，即亞適宜溫光＋清水(CK)、亞適宜溫光＋根施1 mg·L-1ALA(T1)、亞適宜溫光＋根施5 mg·L-1ALA(T3)和10(亞適宜溫光＋根施10 mg·L-1ALA)。將ALA溶于清水中得到不同濃度的ALA溶液，然后進(jìn)行根區(qū)灌溉，每株澆50 mL溶液，每3 d處理一次，共6次，每處理設(shè)3次重復(fù)，每重復(fù)45株苗，18 d后測(cè)定各指標(biāo)。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.3.1 生長(zhǎng)量指標(biāo)的測(cè)定 每處理取20株幼苗，將植株分為地上和地下兩部分，用去離子水沖洗干凈后擦干，測(cè)量植株株高(莖基部到生長(zhǎng)點(diǎn)的距離)、莖粗(地上部1 cm位置)和鮮重后，將樣品于105℃殺青15 min，75℃烘干至恒重，用分析天平稱其干物質(zhì)量，按照公式計(jì)算壯苗指數(shù):

1.3.2 葉面積、根系活力、葉綠素含量、氣體交換參數(shù)和葉片ALA含量的測(cè)定 1)葉面積測(cè)定:將全株葉片剪下，平鋪到光源板上，再用數(shù)碼相機(jī)水平拍照，把照片傳到電腦上，采用LA-S葉面積分析系統(tǒng)(杭州萬(wàn)深檢測(cè)科技有限公司)對(duì)葉面積進(jìn)行分析計(jì)算[3]。

2)根系活力測(cè)定[3]:稱取0.5 g根系，剪成長(zhǎng)約2 cm的片段，放入試管中，設(shè)置2個(gè)空白對(duì)照。對(duì)照先加入 2 mL 1 mol·L-1H2SO4，其余試管中加 10 mL 0.4%2，3，5-三苯基氯化四氮唑(2，3，5-triphenyte trazolium chloride，TTC)和 6.67 mol·L-1pH 值 7.0 磷酸緩沖液等量混合液，封口后放入37℃恒溫箱中，4 h后取出，除對(duì)照外，其余試管加入 2 mL 1 mol·L-1H2SO4終止反應(yīng)，放置15 min后，將根系取出并用濾紙吸干，放回原試管，各試管中加入95%乙醇10 mL，提取24 h至根變白，根據(jù)顏色稀釋3～5倍后，利用UV-1800分光光度計(jì)(日本島津公司)在波長(zhǎng)485 nm下測(cè)定吸光值，按照公式計(jì)算根系活力:

式中，h為時(shí)間(h=4)；W為樣品鮮重(W=0.5)。

3)葉綠素含量測(cè)定[3]:取新鮮植物葉片，擦凈組織表面污物，去除中脈剪碎。稱取剪碎葉片0.2 g于試管中，加入95%乙醇20 mL后封口，置于暗處24～36 h，至葉片發(fā)白，用分光光度計(jì)分別在波長(zhǎng)665、649和470 nm下測(cè)定吸光值，以95%乙醇為空白，根據(jù)公式分別計(jì)算葉綠素 a(chlorophyll a，Chla)、葉綠素 b(chlorophyll b，Chla)、類胡蘿卜素濃度及色素含量:

式中，Ⅴ為提取液體積(Ⅴ=0.02 L)；n為稀釋倍數(shù)(n=1)；W為樣品鮮重(W=0.2 g)。

4)氣體交換參數(shù)的測(cè)定:利用Li-6400光合測(cè)定儀(美國(guó)基因有限公司)測(cè)定功能葉的凈光合速率(net photosynthetic rate，Pn)、 氣孔導(dǎo)度 (stomatal conductance，Gs)、蒸騰速率(transpiration rate，Tr)和胞間 CO2濃度(intercellular CO2concentration，Ci)，測(cè)定時(shí)設(shè)定光量子通量密度(photon flux density，PFD)為400 μmol·m-2·s-1。 稱取 5 g 新鮮葉片，加入 6 mL pH值4.6乙酸鈉緩沖液冰浴研磨，于4℃下，12 000×g離心15 min，然后用4 mL提取液清洗沉淀2次，合并上清液，吸取1 mL提取液，加入4滴乙酰乙酸乙酯，沸水浴15 min，取出冷卻后，加入等體積艾氏試劑，15 min后測(cè)定波長(zhǎng)553 nm下的吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算ALA 含量[7]。

1.3.3 抗氧化酶活性及丙二醛含量的測(cè)定 稱取0.5 g鮮樣，加入 4 mL 磷酸緩沖液(0.05 mol·L-1，pH值為7.8)冰浴研磨成勻漿，于4℃下，10 500 r·min-1離心20 min后冷藏保存[19]，用于抗氧化酶活性測(cè)定。

1)超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性測(cè)定[19]:向試管中加入上述酶液50 μL(2支對(duì)照試管各加同體積磷酸緩沖液)，加入3 mL反應(yīng)液(蒸餾水∶pH 值7.8 磷酸緩沖液∶130 mmol·L-1甲硫氨酸 ∶750 μmol·L-1氮藍(lán)四唑 ∶100 μmol·L-1EDTA-Na2∶20 μmol·L-1核黃素=5∶30∶6∶6∶6 ∶6)，其中 1 支對(duì)照試管置于暗處，其余各管于4 000 lx日光下反應(yīng)20～30 min，反應(yīng)結(jié)束后，以不照光的對(duì)照管作空白，利用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)560 nm下測(cè)定吸光值，以抑制氮藍(lán)四唑(nitroblue tetrazolium，NBT)光化學(xué)還原50%所需酶量為一個(gè)酶活性單位(U)。

2)過(guò)氧化物酶(peroxidase，POD)活性測(cè)定[19]:取上述酶液20 μL于比色杯中(對(duì)照加20 μL磷酸緩沖液)，加入3 mL反應(yīng)液(0.1 mol·L-1pH值6.0磷酸緩沖液50 mL，加入愈創(chuàng)木酚28 μL，于磁力攪拌器上加熱溶解，加入30%H2O219 μL保存于冰箱中)，于波長(zhǎng)470 nm下測(cè)定吸光值并計(jì)時(shí)，每隔1 min讀取數(shù)據(jù)一次(分別讀取 0、1、2、3 min吸光值)，以每分鐘內(nèi)吸光值變化0.01為一個(gè)酶活性活力單位(U)。

3)過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)活性測(cè)定[19]:取上述酶液100 μL于比色杯中(對(duì)照加100 μL磷酸緩沖液)，加入3 mL反應(yīng)液(0.1 mol L-1pH值7.0磷酸緩沖液 20 mL，加入 0.1 mol·L-1H2O25 mL)，于波長(zhǎng) 240 nm下測(cè)定吸光值并計(jì)時(shí)，每隔1 min讀取數(shù)據(jù)一次(分別讀取0、1、2、3 min 的吸光值)，以每分鐘吸光值減少0.01為1個(gè)酶活性單位(U)。

4)丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量測(cè)定[19]:取上述酶液1 mL(對(duì)照加1 mL蒸餾水)，加入2 mL 0.67%TBA溶液，封口后沸水浴15 min，迅速冷卻(用冷水沖泡)，倒入指形管中，4 000 r·min-1離心20 min，取上清液分別于波長(zhǎng)600、532、450 nm下測(cè)定吸光值，然后按照公式計(jì)算MDA含量:

MDA(μmol·g-1FW)=C×V/W=0.154 8(A532-A600)-0.013 44 A450

式中，V為提取液體積(Ⅴ=0.012 L)；W為樣品鮮重(W=0.5 g)。

1.3.4 礦質(zhì)元素含量的測(cè)定 將新鮮的黃瓜幼苗根、莖、葉分別取樣、洗凈、烘干磨碎后保存。稱取0.2 g植物干樣于消化管中，加入10 mL濃硫酸，1 g硫酸亞銅和硫酸鉀(質(zhì)量比為1∶3)混合試劑，380℃消煮50 min，冷卻后用hanon k9840凱氏定氮儀(濟(jì)南海能儀器股份有限公司)測(cè)定黃瓜幼苗根、莖、葉中的含氮量[18]。取0.1 g干樣于消化管中，加硝酸 5 mL，MARS240/50用微波消解儀(Milestone公司，德國(guó))進(jìn)行消煮至澄清，定容至15 mL，采用5300 DV電感耦合等離子發(fā)射光譜儀(PE公司，美國(guó))測(cè)定磷、鉀、鈣、鎂、鐵等元素含量[20]。

1.3.5 葉綠素合成相關(guān)基因表達(dá)的測(cè)定 參照王平榮等[21]方法獲取葉綠素合成相關(guān)基因的登錄號(hào)和序列，在黃瓜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，用Primer 5軟件設(shè)計(jì)引物(表1)，總RNA提取和cDNA第一鏈合成分別采用多糖多酚植物總RNA快速提取試劑[天根生化科技(北京)有限公司]和Fast Quant cDNA第一鏈合成試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR采用 SYBR?Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)試劑盒，利用MX3000P熒光定量PCR儀(Agilent Technologies Strata gene，德國(guó)) 進(jìn)行，采用的內(nèi)參為Actin。根據(jù)2-△△Ct法[22]計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2007和GraphPad Prism 6軟件處理數(shù)據(jù)和作圖；SAS 9.2軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，并運(yùn)用Duncan檢驗(yàn)法對(duì)顯著性差異(P＜0.05)進(jìn)行多重比較。圖表中數(shù)據(jù)均為平均值±SD(標(biāo)準(zhǔn)差)。

2 結(jié)果與分析

2.1 根施ALA對(duì)亞適宜溫光下黃瓜幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)的影響

由表2可知，根施ALA明顯緩解了亞適宜溫光處理對(duì)黃瓜幼苗生長(zhǎng)的抑制。亞適宜溫光下，根施不同濃度ALA不同程度的提高了黃瓜幼苗的莖粗、根冠比、全株干重和壯苗指數(shù)，其中以T2(5 mg·L-1ALA)的效果為最好。與CK相比，T2黃瓜幼苗全株干重和壯苗指數(shù)分別顯著提高32.5%和47.1%。

表1 熒光定量PCR引物序列Table1 Gene-specific primers used for qPCR

2.2 根施ALA對(duì)亞適宜溫光下黃瓜幼苗葉面積和根系活力的影響

由圖1可知，亞適宜溫光下，根施ALA可促進(jìn)黃瓜幼苗葉片生長(zhǎng)，其中以T2處理效果最佳，較CK顯著提高23.7%，而T1、T3處理的效果稍差，但仍顯著高于CK(圖1-A)。根施不同濃度ALA均顯著提高了黃瓜幼苗的根系活力，以T2效果最佳，較CK提高95.0%(圖1-B)。結(jié)果表明，根施ALA可以顯著緩解亞適宜溫光對(duì)黃瓜幼苗葉片生長(zhǎng)和根系活力產(chǎn)生的抑制作用。

圖1 根施ALA對(duì)亞適宜溫光下黃瓜幼苗葉面積和根系活力的影響Fig.1 Effect of root application of ALA on leaf area and root activity of cucumber seedlings under suboptimal temperature and light intensity

2.3 根施ALA對(duì)亞適宜溫光下黃瓜幼苗葉片葉綠素、類胡蘿卜素和ALA含量的影響

由表3可知，亞適宜溫光下根施不同濃度ALA不同程度地提高了黃瓜幼苗葉片的葉綠素、類胡蘿卜素和ALA含量，且上述指標(biāo)均呈先升高后降低的趨勢(shì)；以T2效果最佳，與CK相比，其葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素、總?cè)~綠素和ALA含量分別顯著提高了50.6%、63.3、41.6%、49.5%和 55.7%。亞適宜溫光下，根施ALA可降低葉綠素a/b，表明根施ALA可以促進(jìn)葉綠素a和葉綠素b的合成，還可以促進(jìn)葉綠素a向葉綠素b的轉(zhuǎn)化，有利于提高黃瓜幼苗葉片對(duì)弱光的耐受性。

表3 ALA對(duì)亞適宜溫光下黃瓜幼苗葉片葉綠素、類胡蘿卜素和ALA含量的影響Table3 Effects of root application of ALA on chlorophyll，carotenoid and ALA content in leaves of cucumber seedlings under suboptimal temperature and light intensity

2.4 根施ALA對(duì)亞適宜溫光下黃瓜幼苗氣體交換參數(shù)的影響

由表4可知，亞適宜溫光下根施不同濃度ALA不同程度地提高了黃瓜幼苗的凈光合速率、氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率，其中以T2效果最好，與CK相比，T2分別顯著提高了22.9%、42.2%和34.1%。表明根施ALA可緩解亞適宜溫光對(duì)黃瓜幼苗光合作用的影響。

表4 ALA對(duì)亞適宜溫光下黃瓜幼苗葉片氣體交換參數(shù)的影響Table4 Effect of root application of ALA on the gas exchange parameters in leaves of cucumber seedlings under suboptimal temperature and light intensity

2.5 根施ALA對(duì)亞適宜溫光下黃瓜幼苗抗氧化酶活性及丙二醛含量的影響

由表5可知，亞適宜溫光下根施ALA可不同程度地提高黃瓜幼苗葉片和根系的抗氧化酶活性，以T2效果最佳。與CK相比，T2幼苗葉片中的SOD、POD和CAT活性分別提高了10.9%、19.2%和41.3%，根系中分別提高了261.5%、35.6%和29.7%。結(jié)果表明，亞適宜溫光下，根施ALA可明顯提高黃瓜幼苗的抗氧化酶活性，加速活性氧等物質(zhì)的清除，提高其抗氧化能力，緩解亞適宜溫光傷害。

亞適宜溫光下根施ALA可顯著降低黃瓜幼苗的MDA含量。與CK相比，T1、T2、T3的黃瓜幼苗葉片MDA含量分別降低了31.1%、35.3%和25.9%，根中分別降低16.4%、18.1%和13.9%。結(jié)果表明，根施ALA可顯著降低黃瓜幼苗的膜脂過(guò)氧化程度，從而緩解亞適宜溫光對(duì)黃瓜幼苗的生長(zhǎng)抑制。

2.6 根施ALA對(duì)亞適宜溫光下黃瓜幼苗礦質(zhì)元素吸收和分配的影響

由表6可知，亞適宜溫光下，ALA處理的黃瓜幼苗根、莖、葉中N、K和Mg含量明顯提高，以T2效果最佳。與CK相比，T2處理N、K和Mg含量在黃瓜幼苗根系中分別顯著提高了7.0%、36.3%和11.1%；莖中分別顯著提高了9.2%、10.3%和9.8%；葉中分別顯著提高了15.3%、18.5%和22.0%，說(shuō)明亞適宜溫光下根施ALA可促進(jìn)黃瓜幼苗對(duì)N、K、Mg的吸收和運(yùn)輸。此外，根施5 mg·L-1ALA(T2)顯著提高了黃瓜幼苗根系和葉片中P含量，與CK相比，分別提高了14.0%和19.3%；黃瓜幼苗莖和葉片中Fe含量分別較CK顯著提高了7.7%和16.7%；顯著提高了根系中Ca含量，但降低了莖和葉中Ca的含量，抑制了Ca向莖和葉運(yùn)輸。說(shuō)明根施ALA促進(jìn)亞適宜溫光下黃瓜幼苗對(duì)N、P、K、Mg和Fe元素的吸收和運(yùn)輸，這與根施ALA可以提高黃瓜幼苗葉綠素含量、促進(jìn)生長(zhǎng)的結(jié)果相一致。

表5 ALA對(duì)亞適宜溫光下黃瓜幼苗SOD、POD、CAT活性及MDA含量的影響Table5 Effect of root application of ALA on SOD，POD，CAT activities and MDA contents of cucumber seedlings under suboptimal temperature and light intensity

表6 ALA對(duì)亞適宜溫光下黃瓜幼苗礦質(zhì)元素吸收和分配的影響Table6 Effect of root application of ALA on absorption and partition of mineral element in cucumber seedlings under suboptimal temperature and light intensity

圖2 根施ALA對(duì)亞適宜溫光下黃瓜幼苗葉片葉綠素合成相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.2 Effect of root application of ALA on transcript level of genes in related to chlorophyll synthesis of cucumber seedlings under suboptimal temperature and light intensity

2.7 根施ALA對(duì)亞適宜溫光下黃瓜幼苗葉片葉綠素合成相關(guān)基因表達(dá)的影響

ALA合成是葉綠素合成的第1個(gè)主要調(diào)控位點(diǎn)，高等植物體內(nèi)的ALA合成主要由谷氨酰-tRNA還原酶和谷氨酸-1-半醛氨基轉(zhuǎn)移酶催化，編碼基因分別為HEMA和GSA。亞適宜溫光下，根施ALA對(duì)HEMA的表達(dá)量有一定影響(圖2-A、B)，與CK相比，T2處理HEMA2和GSA的表達(dá)量分別提高了1.53倍(圖2-B)和2.15倍(圖2-C)，這與根施ALA提高了黃瓜幼苗葉片中ALA含量的結(jié)果相一致。由HEMB編碼的ALA脫水酶是ALA代謝的第1個(gè)酶，與CK相比，T2顯著提高了HEMB的表達(dá)量，是CK的1.75倍(圖2-D)。Mg離子螯合酶是葉綠素合成的另外一個(gè)主要調(diào)控位點(diǎn)，黃瓜中Mg離子螯合酶有3個(gè)亞基，分別為Mg離子螯合酶H亞基、Mg離子螯合酶Ⅰ亞基和D亞基Mg離子螯合酶，依次由CHLH、CHLI和CHLD編碼(圖2-E、F、H)，亞適宜溫光下，根施 5 mg·L-1ALA(T2)對(duì)CHLH、CHLI和CHLD的表達(dá)量無(wú)明顯影響。CRD編碼的Mg-原卟啉Ⅸ單甲基酯環(huán)化酶是葉綠素合成必不可少的酶，亞適宜溫光下根施ALA其表達(dá)量略有提高(圖2-Ⅰ)。CAO編碼葉綠素酸酯a加氧酶，催化葉綠素a向葉綠素b的轉(zhuǎn)化，與CK相比，亞適宜溫光下根施ALA對(duì)CAO的表達(dá)量略有提高(圖2-G)，這與根施ALA降低了葉綠素a/b的結(jié)果相一致。綜上，亞適宜溫光下，根施ALA雖然對(duì)葉綠素合成相關(guān)基因的表達(dá)有一定的提高作用，但效果并不顯著。

3 討論

植物的生長(zhǎng)發(fā)育與溫度、光照等環(huán)境條件密切相關(guān)，亞適宜溫光環(huán)境使黃瓜生理代謝活動(dòng)失調(diào)，抑制其株高、莖粗和葉面積的增加，降低根系活力，生物量增加幅度顯著降低[18]。徐曉潔[23]研究表明，噴施低濃度的ALA能有效緩解NaCl脅迫對(duì)番茄植株生長(zhǎng)的抑制作用，表現(xiàn)為葉片受害程度降低，株高、莖粗、葉面積增大幅度提高，并顯著提高番茄植株根系活力。柳翠霞等[24]認(rèn)為葉面噴施低濃度ALA可明顯增加莖粗，緩解弱光下黃瓜幼苗徒長(zhǎng)的趨勢(shì)。本研究表明，根區(qū)灌溉低濃度ALA可不同程度地增加黃瓜幼苗的莖粗、株高、根冠比、生物量、壯苗指數(shù)、葉面積、根系活力和葉片ALA含量，其中以5 mg·L-1ALA(T2)效果最好，高濃度ALA會(huì)抑制黃瓜幼苗的生長(zhǎng)，這與前人研究[25]結(jié)果一致。表明根施適宜濃度的ALA可有效緩解亞適宜溫光對(duì)黃瓜幼苗生長(zhǎng)的抑制。

ALA是葉綠素生物合成的第1個(gè)關(guān)鍵前體，可以調(diào)節(jié)葉綠素的合成。本研究表明，亞適宜溫光下，根區(qū)灌溉ALA可顯著提高黃瓜幼苗葉片的葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量，并降低葉綠素a/b比值，促進(jìn)葉綠素a的合成，進(jìn)而促進(jìn)葉綠素a轉(zhuǎn)化為葉綠素b，同時(shí)提高 Pn、Gs和 Tr，這與郭曉青[26]、楊蕊等[27]和劉衛(wèi)琴等[28]的研究結(jié)果一致。Tanaka等[29]研究發(fā)現(xiàn)葉綠素b可與PSⅡ脫輔基蛋白結(jié)合，起到穩(wěn)定蛋白結(jié)構(gòu)的作用。葉綠素相對(duì)含量的增加可提高捕光色素復(fù)合體中天線色素的比例，更有效地捕獲有限的光能，彌補(bǔ)光照不足對(duì)光合作用的影響，這與根施ALA提高亞適宜溫光下黃瓜幼苗葉片光合效率的結(jié)果相一致。表明根施ALA不僅可以提高黃瓜幼苗葉片的耐弱光性，還能夠提高其光合作用，以5 mg·L-1ALA的效果最好。葉綠素合成有ALA合成和Mg離子插入原卟啉Ⅸ2個(gè)主要的調(diào)控位點(diǎn)。本研究表明，根區(qū)灌溉不同濃度的ALA 對(duì)HEMA、HEMB、CHLH、CHLI、CHLD和CRD等基因的表達(dá)量均無(wú)顯著提高或降低效果，表明亞適宜溫光下，根區(qū)灌溉ALA處理對(duì)葉綠素合成過(guò)程中相關(guān)基因的表達(dá)并無(wú)明顯的調(diào)控作用，這與前人[7，30]研究結(jié)果一致。表明亞適宜溫光下，根區(qū)灌溉ALA可能通過(guò)提高ALA含量來(lái)增加葉綠素合成的底物量，從而提高了黃瓜幼苗葉片葉綠素含量，也有可能是由于根施ALA處理可以調(diào)節(jié)葉綠素合成過(guò)程中相關(guān)酶的活性，進(jìn)而提高了黃瓜幼苗葉片葉綠素含量。外源ALA對(duì)葉綠素合成過(guò)程中相關(guān)酶活性的影響及其調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

ALA是亞鐵血紅素合成的前體，外源ALA可增加亞鐵血紅素的含量[31]。而SOD、CAT和POD屬于亞鐵血紅素蛋白酶類，是細(xì)胞內(nèi)清除活性氧的主要酶促保護(hù)系統(tǒng)。Shen等[32]研究發(fā)現(xiàn)逆境條件下ALA提高抗氧化酶的活性是一種普遍效應(yīng)。外源供給適宜濃度的ALA可提高抗氧化酶活性，加速活性氧物質(zhì)的清除[33]，這可能是ALA提高植物抗性的一種作用機(jī)制。本研究表明，亞適宜溫光下，根區(qū)灌溉ALA可不同程度地提高黃瓜幼苗根系和葉片的SOD、POD和CAT活性，并降低MDA含量，這與前人研究[28，34]結(jié)果一致。表明亞適宜溫光下根施ALA可通過(guò)提高SOD等抗氧化酶活性來(lái)提高黃瓜幼苗的抗氧化能力，降低活性氧自由基的生成速率，降低膜脂過(guò)氧化程度，維持膜系統(tǒng)的完整性，提高黃瓜幼苗的耐亞適宜溫光能力，以5 mg·L-1ALA的效果最好。

低溫弱光環(huán)境使植物吸收礦質(zhì)元素的能力下降[2]，嚴(yán)重影響黃瓜幼苗的生長(zhǎng)發(fā)育。研究表明，外源ALA具有引導(dǎo)植物根系對(duì)土壤營(yíng)養(yǎng)元素吸收運(yùn)輸和分配、提高肥料利用效率、減少施肥量的作用[35]。低濃度ALA可以減少作物根系對(duì)生長(zhǎng)介質(zhì)中Na＋和K＋的吸收，同時(shí)能促進(jìn)作物對(duì)大量元素(N、P、Ca、Mg)及微量元素(Fe、Zn)的吸收[34]。鹽脅迫處理?xiàng)l件下，外源ALA可降低黃瓜幼苗體內(nèi)的Na＋含量，提高K＋、Ca2＋和Mg2＋含量，維持細(xì)胞膨壓，提高黃瓜幼苗的耐鹽性，保持其正常的生理代謝[21]。本研究表明，亞適宜溫光下，根施ALA提高了黃瓜幼苗根系中 N、P、K、Ca、Mg和Fe含量，莖中N、K和Mg含量，葉片中N、K、Mg和Fe含量，這與前人研究[35]結(jié)果基本一致。表明亞適宜溫光下，根施ALA可以促進(jìn)黃瓜幼苗對(duì)部分大量元素和微量元素的吸收和運(yùn)輸，進(jìn)而促進(jìn)生長(zhǎng)。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，根區(qū)灌溉5 mg·L-1ALA可以顯著促進(jìn)亞適宜溫光下黃瓜幼苗生長(zhǎng)，提高黃瓜幼苗干重和壯苗指數(shù)。但根施ALA對(duì)黃瓜幼苗葉綠素合成相關(guān)酶的活性及后期生長(zhǎng)、產(chǎn)量和品質(zhì)的影響還有待進(jìn)一步研究。