金針菇黃酮類化合物的體外抗氧化活性研究

劉蘭慶，汪鋆植，倪炎＊

三峽大學(xué)，湖北宜昌443002；2.武漢華夏理工學(xué)院，湖北武漢 430223）

金針菇黃酮類化合物是其生物活性成分，方玉梅等人通過鄰苯三酚自氧化法、水楊酸法比色法分別測定了金針菇的黃酮類化合物清除超氧陰離子自由基（·O2-）和羥基自由基（OH·）的效果，結(jié)果表明，金針菇黃酮提取液清除超氧陰離子自由基和羥基自由基的效果是相當(dāng)顯著的，且其抗氧化性作用伴隨著金針菇黃酮類化合物濃度的增大而增大。后來繆成貴等人采用烘箱儲藏法測定金針菇總黃酮抗油脂氧化作用，結(jié)果表明金針菇總黃酮對豬油的氧化具有明顯的抑制作用，且隨著質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大其抗氧化能力增強，強有力證明了金針菇總黃酮具有一定的抗氧化作用[2]。目前對金針菇活性氧的研究比較多，而本課題則是從更多方面對金針菇黃酮類化合物的抗氧化活性進行探討，為研究金針菇黃酮類化合物的抗氧化活性研究提供了參考依據(jù)。

1 實驗方法

1.1 粗金針菇黃酮溶液的提取及含量的測定

采用微波輔助法提取金針菇黃酮類化合物。（1）樣品的處理：將金針菇置于烘箱中60攝氏度烘干，研磨用80目的篩子過篩。（2）取金針菇中總黃酮：準(zhǔn)確稱取烘干的金針菇適量，置于錐形瓶中，并且加入一定濃度的乙醇溶液后，在微波功率539W的條件下微波設(shè)置好的時間；再準(zhǔn)確汲取所需用量的粗黃酮提取液，最后置于容量瓶中定量。

1.2 金針菇黃酮溶液含量的測定

以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度作為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，對測得的數(shù)據(jù)進行線形回歸分析。用比色法測定金針菇黃酮溶液的吸光值，以金針菇黃酮提取液的濃度為橫坐標(biāo)，以吸光值為縱坐標(biāo)制作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，將樣品吸光值帶入回歸方程得到金針菇黃酮溶液濃度。

1.3 金針菇黃酮溶液體外抗氧化活性研究

1.3.1 羥基自由基的清除能力的測定

利用Fenton反應(yīng)原理，通過鄰二氮菲-亞鐵法測定，參考方玉梅[1]的測定方法。

1.3.2 過氧化氫的清除能力的測定

采用紫外法，通過H2O2溶液的吸光度和加入樣品液的H2O2溶液吸光度的變化值來了解樣品液的清除效果。方法如下：以pH=7.40的磷酸鹽緩沖溶液配制10mmol/L H2O2溶液。取5mL上述溶液加入5mL不同濃度的樣品液，均勻混合后用紫外可見分光光度計測定其在230nm處的吸光值A(chǔ)1。實驗中以不加樣品液的H2O2溶液吸光值為A0，以不加H2O2溶液的樣品溶液的吸光值為A2，按式1-1計算則可得出過氧化氫清除率。

A0為H2O2溶液的吸光度

A2為樣品液的吸光度

1.3.3 超氧陰離子自由基清除能力的測定

通過鄰苯三酚自氧化法，參考方玉梅[1]的測定方法。

取14支干燥潔凈的離心管，1～5號試管中加入0.2mol/l的Tris-HCl緩沖溶液（PH=7.4）4.5mL，然后加入5、10、20、30、40μg/mL濃度的金針菇黃酮溶液2.0mL（其中6～10號試管以等量蒸餾水代替不同濃度的2.0mL樣品液），放入25℃水浴鍋中水浴10min，取出后加25℃預(yù)溫的10mmol/l鄰苯三酚溶液1.0mL，混合均勻，加鄰苯三酚時開始計時，反應(yīng)三分鐘后加12mol/L的濃鹽酸終止，10min后，在325nm處測得吸光值A(chǔ)，按式1-2計算清除超氧陰離子的清除率(E)，然后測定三次的平均值。

A0：用2.0mL的蒸餾水取代樣品液

1.3.4 DPPH自由基的清除能力的測定

Nagai法，參考方玉梅[3]的測定方法。

取2.0mL 5、10、20、30、40μg/mL濃度的金針菇黃酮溶液置于1～5號干燥潔凈的10mL離心管中，6號離心管中加入2.0mL的無水乙醇，隨后各離心管中分別加入3.0mL 0.2mmol/LDPPH溶液，7號離心管加2.0mL無水乙醇和2.0mL樣品溶液為對照，

振蕩搖勻，遮光反應(yīng)30min后，在517nm處測定吸光度，按式1-3計算清除DPPH自由基的清除率(E)，實驗結(jié)果為三次測定的平均值。

A i：2.0mL待測液加3.0mLDPPH溶液 1～5號離心管

Ac：2.0mL無水乙醇加3.0mLDPPH溶液 6號離心管

對照：2.0mL無水乙醇加2.0mL樣品溶液 7號離心管

1.4 統(tǒng)計與分析

使用DPS9.0進行分析，對不同濃度的黃酮溶液的活性氧清除能力進行顯著性檢驗，從而對金針菇黃酮溶液體外清除活性氧的效果進行進一步比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 金針菇黃酮類化合物濃度的測定結(jié)果

利用蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液得到線性方程為y=14.8x-0.0104，相關(guān)系數(shù)R2=0.9985，表明擬合方程線性關(guān)系良好。如圖1所示。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度與吸光度的關(guān)系

在510nm處測得金針菇黃酮提取液的吸光度y=1.402，根據(jù)公式計算得到金針菇黃酮提取液的濃度為95μg/mL。

向50mL容量瓶中分別取金針菇黃酮提取液2.6、5.3、10.5、15.8 mL和21.1mL，然后均加入80%的乙醇溶液至刻度線，得到不同濃度梯度的金針菇黃酮樣品液，5、10、20、30 μg/mL和40 μg/mL，記為樣品1～5。

2.2 金針菇黃酮類化合物對OH·的清除效果

從圖2看出，金針菇黃酮溶液對OH·擁有良好的清除能力，而且隨著濃度的提高，清除率也在不斷的提高，最高清除率到達了81.00%以上。不同濃度的金針菇黃酮提取液之間有顯著差異，隨著濃度的不斷升高，從低濃度的5μg/mL，升到濃度為40μg/mL，清除OH·的能力在不斷提升，但高濃度下對提升OH·的清除能力并不顯著。說明金針菇黃酮提取液OH·清除能力與其濃度是存在一定的正協(xié)同性，適當(dāng)?shù)奶岣唿S酮溶液的濃度，可以提高金針菇黃酮提取液的抗氧化活性。

2.3 金針菇黃酮類化合物對過氧化氫的清除效果

從圖3看出，金針菇黃酮溶液具備比較好的過氧化氫清除能力，濃度為40μg/mL時過氧化氫清除率達到了96.00%以上。不同濃度的金針菇黃酮溶液之間差異并不顯著，即使在5μg/mL的濃度下，清除率也能達到94.67%，接近100%，再提高黃酮的濃度，其清除率并沒有顯著性提高。

圖2 黃酮提取液對OH·的清除效果

圖3 黃酮提取液對過氧化氫的清除效果

2.4 金針菇黃酮類化合物對O2-·的清除效果

從圖4看出，金針菇黃酮溶液有比較好的超氧陰離子自由基（O2-·）清除能力，一定條件下，在濃度為5μg/mL時，清除率為94.75%，伴隨著濃度的上升，對O2-·的清除率也在逐漸的增強，在40μg/mL濃度下，清除率高達96.63%。不同濃度的金針菇黃酮溶液之間有極顯著差異，隨著樣品液濃度的不斷增大，清除率幾乎接近100%，由此看出金針菇黃酮溶液O2-·清除能力與其濃度呈正相關(guān)，適當(dāng)?shù)脑龃簏S酮溶液的濃度能提高金針菇黃酮類化合物的抗氧化活性。

圖4 黃酮提取液對O2-·的清除效果

2.5 金針菇黃酮類化合物對DPPH自由基的清除效果

從圖5看出，金針菇黃酮溶液有比較好的DPPH自由基清除能力，一定條件下，伴隨著濃度的上升，DPPH自由基清除率也在逐漸的上升，黃酮濃度在5μg/mL時對DPPH自由基的清除率僅為32.26%，適當(dāng)提高濃度到10μg/mL時其清除率就能達到64.09%，而后再提高黃酮濃度對清除DPPH自由基的能力提升并不明顯。不同濃度的金針菇黃酮溶液之間有差異，而且較高濃度的金針菇黃酮溶液清除DPPH自由基的效果更為顯著，可以通過改變黃酮提取液的濃度來改變金針菇黃酮類化合物的活性。低濃度下金針菇黃酮能對DPPH自由基的清除能力較弱，但在較高濃度下時，就能有效清除DPPH自由基。

圖5 黃酮提取液對DPPH的清除效果

3 討論

生物機體中常見的自由基有羥基自由基（OH·）、過氧化氫（H2O2）、超氧陰離子自由基（O2-·）、DPPH自由基。羥基自由基（OH·）相對于其他的自由基來說，其氧化能力很強，是已知的最強的氧化劑之一，因為體內(nèi)沒有清除OH·的機制，所以它能夠?qū)ι眢w造成強有力的破壞。而過氧化氫，它能夠造成各種各樣的疾病，給人造成危害，它會消耗體內(nèi)抵抗氧化性的物質(zhì)，從而導(dǎo)致人的抗氧化能力降低，它是一種強氧化劑，另外過氧化氫還能夠?qū)е掳┬?，比如通過與食物中的淀粉形成環(huán)氧化物從而達到致癌的效果，尤其是消化道癌癥[4]。O2-·也屬于一種活性氧，具有很強的氧化性，同時人體內(nèi)也不具備清除它的能力，在體內(nèi)產(chǎn)生極大的危害性。

本研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度的金針菇黃酮溶液在一定條件下對OH·的清除率表現(xiàn)出了正協(xié)同性，隨著濃度的增大，清除OH·的能力越來越明顯。通過測定不同濃度的金針菇黃酮溶液在一定條件下對過氧化氫的清除率，發(fā)現(xiàn)金針菇黃酮溶液對過氧化氫清除能力很強，即使在低濃度條件下，依然可以有極高的過氧化氫清除能力。通過測定不同濃度金針菇黃酮溶液對O2-·的清除效果，發(fā)現(xiàn)金針菇黃酮溶液能夠在一定程度上清除O2-·自由基，效果顯著，而且清除O2-·自由基的能力與金針菇黃酮溶液的濃度有很大的聯(lián)系，具體趨勢是呈正相關(guān)的。通過測定不同濃度金針菇黃酮溶液對DPPH·的清除效果，發(fā)現(xiàn)在有黃酮溶液存在時，自由基會被清除，金針菇中的黃酮溶液清除DPPH 自由基的能力強，即便在濃度不太高的情況下也能夠達到相當(dāng)不錯的清除效果。最后通過測定不同濃度的金針菇黃酮溶液的還原力，了解到金針菇黃酮溶液的濃度與其還原能力有相關(guān)性，并且表現(xiàn)出明顯的正比關(guān)系，說明其能夠在體內(nèi)有效的清除自由基，具有較強的抗氧化性。

通過實驗得出結(jié)論：金針菇黃酮化合物能有效清除OH·、H2O2、O2-·、DPPH自由基，并且具有較強的還原能力。清除OH·、O2-·自由基的能力與金針菇黃酮溶液的濃度是呈正比趨勢的，而對H2O2和DPPH的清除能力，即便在低濃度的條件下清除效果也很好。說明金針菇黃酮化合物具有良好的抗氧化活性。