粳稻栽培品種中淀粉合成相關基因的等位變異及群體結構分析

張善磊，岳紅亮，趙春芳，陳 濤，張亞東，周麗慧，趙 凌，梁文化，王才林

(1.南京農業(yè)大學 農學院，江蘇省現(xiàn)代作物生產協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210095； 2.江蘇省農業(yè)科學院 糧食作物研究所，江蘇省優(yōu)質水稻工程技術研究中心，國家水稻改良中心南京分中心，江蘇 南京 210014)

水稻是我國最重要的糧食作物，其產量和品質指標直接關系到商品價值和種植推廣[1-2]。豐富優(yōu)異的種質資源是新品種選育和遺傳改良工作的基礎，而種質資源親緣關系的遠近和遺傳多樣性的高低則是育成品種產量、品質和抗性突破的關鍵[3]。近年來，隨著分子生物學和基因組學研究的深入，利用分子標記從DNA水平對水稻群體進行遺傳結構與遺傳多樣性研究較多。鄧宏中等[4]發(fā)現(xiàn)，選育品種的等位基因數(shù)及稀有等位基因數(shù)顯著低于地方品種。陳錦文等[5]揭示云南哈尼族當前栽培水稻的遺傳基礎較狹窄，多樣性較低。遺傳多樣性和群體遺傳結構分析，可揭示不同材料的遺傳狀況，規(guī)避遺傳背景相似的親本組合，降低育種工作量，拓寬育成品種間的遺傳距離，同時也是重要農藝性狀的優(yōu)異等位基因關聯(lián)挖掘工作的基礎。

胚乳中淀粉的品質是稻米蒸煮食味品質的主要決定因素，其生物合成的遺傳調控系統(tǒng)非常復雜，涉及的基因有20多個，包括ADP-葡萄糖焦磷酸化酶大小亞基的編碼基因AGPlar、AGPsma、AGPis；顆粒結合淀粉合成酶的編碼基因Wx、GBSSⅡ；可溶性淀粉合成酶的編碼基因SSⅠ、SSⅡa、SSⅡb、SSⅡc、SSⅢa、SSⅢb、SSⅣa、SSⅣb；淀粉分支酶的編碼基因SBE1、SBE3、SBE4及脫分支酶的編碼基因ISA、PUL等[6-7]。已有研究表明，每個基因都存在數(shù)目不一的復等位基因變異，這些復等位基因對稻米的外觀品質，尤其是蒸煮食味品質具有顯著影響。王才林等[8]將水稻蠟質基因Wx的等位變異型Wx-mq在水稻育種中進行廣泛應用，育成一系列食味品質優(yōu)良的粳稻品種南粳46、南粳5055、南粳9108等，在江蘇及周邊地域進行了大面積推廣。水稻特別是栽培品種中淀粉合成相關基因優(yōu)異變異位點的發(fā)掘，對水稻優(yōu)質育種中食味品質性狀的改良具有重要意義。

本研究利用來源于18個淀粉合成相關基因的34個分子標記對國內外181份粳稻栽培品種的等位基因變異進行檢測，并結合185個水稻基因組上均勻分布的SSR/Indel標記，共219個分子標記，對群體結構及親緣關系進行了詳細分析，以明確淀粉合成相關基因的遺傳多樣性及當前粳稻栽培品種特別是江蘇省內品種的遺傳結構現(xiàn)狀，為粳稻新品種選育過程中親本的選配、優(yōu)質基因的充分利用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試材料181份粳稻，包括：江蘇地區(qū)粳稻品種76份；遼寧地區(qū)粳稻品種12份；山東地區(qū)粳稻品種10份；黑龍江地區(qū)粳稻品種9份；浙江地區(qū)粳稻品種8份；天津地區(qū)粳稻品種7份；河南、寧夏和云南地區(qū)粳稻品種各6份；吉林地區(qū)粳稻品種5份；新疆地區(qū)粳稻品種4份；貴州地區(qū)粳稻品種2份；北京、河北、陜西、上海地區(qū)粳稻品種各1份；國外粳稻品種26份，含23份日本粳稻、2份韓國粳稻和1份蘇聯(lián)粳稻。供試材料均種植于江蘇省農業(yè)科學院糧食作物研究所試驗田。2016年5月13日播種，6月13日移栽，每個品種種植4行，每行12株，株行距13.3 cm×26.7 cm，常規(guī)栽培方式管理。

1.2 DNA提取和標記檢測

水稻分蘗盛期采集各品種幼嫩的新鮮葉片，采用盧揚江等[9]的CTAB法并略作修改提取基因組DNA。選取均勻分布于水稻12條染色體上的185個多態(tài)性SSR/Indel標記和34個淀粉合成相關基因分子標記(強新濤等[10])對供試材料進行遺傳分析。引物由上海英濰捷基貿易有限公司合成。

1.3 PCR擴增和電泳檢測

10 μL的PCR反應總體系包含：ddH2O 7.2 μL，模板DNA(20 ng/μL)1 μL，10×Buffer(25.0 mmol/L)1 μL，dNTP(2.5 mmol/L)0.2 μL，正反向引物(10 μmol/L)0.4 μL，TaqDNA聚合酶(2 U/μL)0.2 μL。PCR擴增反應條件:94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，46～58 ℃復性30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

SSR/Indel引物的擴增產物在9%的聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離，銀染后在膠片觀察燈上拍照、統(tǒng)計多態(tài)性條帶；CAPS標記的擴增產物經酶切后在2%～3%濃度的瓊脂糖凝膠上電泳分離，DuRed核酸燃料染色后，在紫外凝膠成像儀上觀察記載。

1.4 統(tǒng)計分析

根據(jù)PCR擴增圖譜，按多態(tài)性條帶遷移位置不同次序編號(如“1/1”、“2/2”等)，無條帶記為“?/?”。標記統(tǒng)計結果使用PowerMarker v3.25軟件[11]進行遺傳多樣性分析，分別計算等位基因數(shù)、基因多樣性指數(shù)、多態(tài)信息含量(PIC)及品種間的Nei′s遺傳距離，采用Nei′s遺傳距離按非加權配對法(UPGMA)進行聚類分析[11-12]，使用NTSYSpc version 2.1軟件[13]對181份粳稻栽培品種進行基于Nei′s遺傳距離的主成分分析。

使用Structure 2.3.4軟件[14]對181份粳稻栽培品種進行遺傳結構分析，粳稻群體亞群數(shù)K值設為1～15，將軟件運行時的參數(shù)迭代(Length of burn-in period)設為50 000，蒙特卡羅迭代(Marko chain monte carlo, MCMC)設為100 000，每個K值重復運行5次，依據(jù)似然值最大的原則,分析群體最佳亞群數(shù)K值。計算所有品種在各個亞群中的Q值，以Q值大于0.5作為亞群歸類標準，若某一品種在所有亞群中的Q值均小于0.5，表明該品種的遺傳組分較豐富，應歸類到混合亞群中[15]。

基于219個分子標記的檢測結果，使用SPADiGe version 1.4c軟件[16]對181份粳稻栽培品種進行親緣關系分析。親緣關系矩陣中的負值表明，這2份品種間的親緣關系小于其他任意2份品種，故統(tǒng)計時將其值設為0[15]。

2 結果與分析

2.1 分子標記檢測及淀粉合成相關基因標記的多態(tài)性分析

利用219個分子標記對181份粳稻栽培品種進行多態(tài)性檢測，結果表明,所有分子標記在供試材料中均可檢測到多態(tài)性(圖1)。219個標記共檢測到665個等位變異，平均為3.037個?；蚨鄻有灾笖?shù)變幅為0.011～0.766，平均為0.264。多態(tài)信息含量(PIC)變幅為0.011～0.727，平均為0.235，中度多態(tài)位點(0.250.50)有20個。

1.南粳46；2.南粳49；3.南粳5055；4.南粳9108；5.常農粳5號；6.華粳3號；7.蘇香粳1號；8.鹽豐47；9.鐵粳7號；10.龍粳25號；11.津稻263；12.圣稻15；13.臨稻13；14.浙粳59；15.蘇秀10號；16.寧粳12號；17.伊粳12號；18.畢粳44號；19.中國91；20.農林24；21.農林229；22.一品；23.京稻2號；24.遼粳10號。

群體內34個淀粉合成相關基因分子標記共檢測到74個等位變異，變幅為2～4個，平均每個標記檢測到的等位基因數(shù)為2.176個，在Wx基因第一內含子剪切點上游的(CT)n微衛(wèi)星序列的標記L05中，可檢測到4個等位基因。L10、L11等29個標記均只檢測到2個等位基因?；蚨鄻有灾笖?shù)變幅為0.011～0.494，平均為0.148，Wx、SSSⅢ-2、PUL基因變異率較高，而SSSⅠ基因的等位變異率最低。多態(tài)信息含量(PIC)變幅為0.011～0.399，平均為0.128，中度多態(tài)位點(0.250.50)(表1)。

2.2 粳稻栽培品種群體遺傳結構分析

基于219個分子標記檢測結果，對181份粳稻栽培品種進行群體遺傳結構分析。發(fā)現(xiàn)LnP(D)值隨著K=1～15持續(xù)增大，無明顯峰值，不能確定最佳亞群數(shù)K(圖2-A)。根據(jù)Evanno等[17]方法，當K=3和5時，ΔK分別取得第1峰值和第2峰值，即181份粳稻品種可分成3或5個亞群(圖2-B)。根據(jù)各品種在不同亞群中的Q值，以遺傳成分值大于0.5作為亞群歸類標準，結果表明，98.34%的品種遺傳結構比較單一，分別歸類到3個相應的亞群中，1.66%的品種遺傳背景比較復雜，被歸類到一個混合亞群中(圖2-C)。在亞群分布上，歸類于第1亞群(POP1)的粳稻品種有中國91(日本)、農林229(日本)和一品(韓國)，占供試材料的1.66%。歸類于第2亞群的粳稻品種有79份，占供試材料的43.65%，主要來源于長江中下游地區(qū)和貴州；歸類于第3亞群的粳稻品種有96份，占供試材料的53.04%，除貴州外，來源地區(qū)相對廣泛。歸類于混合亞群的品種有TD70(江蘇)、農林24(日本)和香血糯(江蘇)，占供試材料的1.66%。

表1 粳稻栽培品種中淀粉合成相關基因分子標記的遺傳變異Tab.1 Genetic variation of molecular markers of starch synthesis-related genes in Japonica rice cultivars

2.3 粳稻栽培品種聚類和主成分分析

基于Nei′s遺傳距離的聚類分析表明，粳稻品種可被分成離散程度較好的4大類。來自云南的楚粳27單獨聚為Ⅰ類；類群Ⅱ包含12份粳稻品種，占供試材料的6.63%，其中，63.9%的品種來源于東北和日本；類群Ⅲ由龍粳24號、松遼1號、鹽粳48號等36份品種組成，占供試材料的19.89%，包含22份國內品種、13份日本品種和1份韓國品種；類群Ⅳ由132份品種組成，占供試材料的72.93%，其中，長江中下游地區(qū)(江蘇、浙江、山東等)粳稻品種大多聚于此類群的左側分支中，而遼寧、天津及日本等地區(qū)的粳稻品種大多聚于此類群的右側分支中。結合Structure分析，同一亞群的粳稻品種大多聚集在同一類群分支上，而混合亞群的粳稻品種分布較為分散(圖2-D)。因此，181份粳稻品種可分成3個亞群和一個混合群，即K=3為該粳稻群體的最佳亞群數(shù)。

主成分分析表明，181份粳稻栽培品種可分成3個亞群(POP1、POP2、POP3)和一個混合群(Mixed)，主成分1(PC1)和主成分2(PC2)分別解釋了48.2%和12.5%的遺傳變異，與群體聚類結果基本一致，進一步對群體遺傳結構中亞群的劃分進行了驗證(圖2-E)。

A.對數(shù)似然函數(shù)值LnP(D)隨亞群數(shù)增加的變化；B.隨亞群數(shù)增加ΔK值的變化；C.K=3和5時，基于219個分子標記的粳稻群體遺傳結構；D.粳稻群體基于Nei′s遺傳距離的系統(tǒng)聚類，紅色、綠色、藍色和紫色分別代表亞群1(POP1)、亞群2(POP2)、亞群3(POP3)和混合亞群(Mixed)；E.粳稻群體主成分分析。

2.4 粳稻栽培品種親緣關系分析

親緣關系分析表明,品種間親緣關系系數(shù)小于0.5的占99.7%，多數(shù)系數(shù)在0.1以下。其中，品種間親緣關系系數(shù)為0的占56.0%；親緣關系系數(shù)為0.0～0.1的占27.2%；親緣關系系數(shù)為0.1～0.2的占11.7%；親緣關系系數(shù)為0.2～0.3的占3.6%；親緣關系系數(shù)為0.3～0.4的占0.9%；親緣關系系數(shù)為0.4～0.5的占0.3%；親緣關系系數(shù)大于0.5的僅占0.3%(圖3)。表明供試材料來源較廣，群體內個體間的親緣關系較遠。

3 討論

不同品種間的遺傳多樣性差異和親緣關系遠近是評價作物種質資源狀況、培育突破性品種的重要依據(jù)。前人對粳稻遺傳多樣性已有較多研究，張科等[18]利用62個SSR標記分析黑龍江省近年審定的73個水稻品種，遺傳相似性均值為0.759。羅兵等[19]利用24個SSR標記分析太湖地區(qū)42份粳稻品種，遺傳相似性系數(shù)均值為0.610。樊傳章等[20]利用77個SSR標記分析云南及不同地理分布的粳稻，多態(tài)信息含量均值為0.62。本研究中，219個分子標記共檢測到665個等位變異，基因多樣性指數(shù)均值為0.264，多樣性較低。多態(tài)信息含量均值為0.235，其中，中度以上的多態(tài)位點有93個。

圖3 181份粳稻栽培品種的親緣關系系數(shù)分布Fig.3 Distribution of kinship coefficients in 181 Japonica rice cultivars

34個淀粉合成相關基因的分子標記共檢測到74個等位變異，基因多樣性指數(shù)均值為0.148，多態(tài)信息含量均值為0.128，低于強新濤等[10]基于秈稻栽培品種的研究結果，可見粳稻栽培品種中淀粉合成相關基因的遺傳多樣性明顯小于秈稻。Wx基因的CT重復序列可在基因表達水平上影響胚乳中直鏈淀粉的合成，而SSSⅡ-3和PUL基因對胚乳支鏈淀粉的合成及分支鏈延伸起重要作用，其中SSSⅡ-3是決定糊化溫度的主效基因。本研究中，這3個基因位點均表現(xiàn)出較高的等位變異率，在Wx的(CT)n位點檢測到4個等位基因，在SSSⅡ-3(Y12)和PUL(Y37)位點上均檢測到3個等位基因，高于敖雁等[21]的檢測結果。Wx(CT)n位點在鹽糯12、南粳9108、日本晴、一品等江蘇和日本粳稻品種中的變異率較其他地區(qū)高。SSSⅡ-3(Y12)位點的稀有變異主要存在于南粳46、鎮(zhèn)稻16號、武運粳19號等江蘇育成品種中。PUL(Y37)位點的稀有變異主要存在于農林229、遼粳10號、龍粳24號等具有日本粳稻血緣的品種中。后期將通過分析這些位點與供試材料中的稻米食味品質性狀的關聯(lián)性，從而評估這些多態(tài)位點的育種利用價值。

通過群體遺傳結構、聚類和主成分分析，181份粳稻栽培品種的群體分類結果是相似的，呈現(xiàn)明顯的地域傾向性，地理位置相近的品種大都聚于同一大類群中，地理位置相同或處在同一積溫帶的品種大都聚于同一類群的亞類群中，如類群Ⅱ包含的品種63.9%來源于東北和日本，類群Ⅳ包含的品種主要來源于遼寧、天津和長江中下游地區(qū)，類群內左側亞類群的粳稻品種大多來源于長江中下游地區(qū)(江蘇、浙江、山東等)，而右側亞類群以東北、天津和日本粳稻為主。較其他品種，歸類于混合亞群(Mixed)的TD70(江蘇)、農林24(日本)和香血糯(江蘇)具有更為豐富的遺傳多樣性，后期可作育種親本加以利用。

受自然環(huán)境和生產需求的影響，不同地區(qū)的育種目標有所不同，導致育成品種在農藝性狀、生理生化和遺傳基礎上存在較大差異[22]。馬作斌等[23]發(fā)現(xiàn)，水稻品種之間的遺傳差異與緯度和地理距離有很大關系，緯度相近的國家或地區(qū)的水稻品種之間的遺傳距離較近，而緯度較遠的國家或地區(qū)的水稻品種之間的遺傳距離較遠。徐振華等[22]認為，地理位置相對較近的材料間，具有較近親緣關系，反之，親緣關系較遠。本研究中親緣關系系數(shù)大于0.5的僅占0.3%，其中，江蘇育成品種間親緣關系系數(shù)大于0.5的占0.6%，可見，粳稻群體內大部分品種間存在較大的遺傳差異，親緣關系較遠，而少數(shù)來源于同一地區(qū)或地理分布上臨近的品種，親緣關系較近，同一育種單位育成品種間的親緣關系系數(shù)會更高，如江蘇的鎮(zhèn)稻14號與鎮(zhèn)稻16號，鹽粳9號與淮稻5號，其親緣關系系數(shù)值均大于0.7，這可能與骨干親本來源有關。因此，針對省內品種遺傳基礎狹窄性，要強化省外、國外等地理位置較遠地區(qū)粳稻品種的引進和利用，尤其注意發(fā)掘和利用淀粉合成相關基因的優(yōu)異等位變異，在粳稻育種過程中，考慮育種材料目標性狀的同時，應盡量拓寬親本材料間的遺傳基礎，培育出遺傳多樣性豐富的優(yōu)質高產多抗廣適水稻新品種。