紅苞鳳梨嵌合體組織細(xì)胞學(xué)觀察與葉綠素合成特性研究

劉和平，曹 莉，楊轉(zhuǎn)英，張俊麗，林劍波 ，何業(yè)華

（1.陽(yáng)江職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與環(huán)境工程系，廣東 陽(yáng)江 529566；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，廣東 廣州 510642；3.廣東海洋大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣東 湛江 524088；4.茂名市水果科學(xué)研究所，廣東 茂名 525000）

葉綠素是植物進(jìn)行光能吸收與轉(zhuǎn)化的主要色素，其合成途徑主要為：Glu（Glutamate，谷氨酸） →ALA（δ-Aminolevulinic acid，δ-氨基酮戊）→PBG（Porphobilinogen，膽色素原）→UroⅢ（Uroorphyrinogen Ⅲ,尿卟啉原 Ⅲ）→ProtoⅨ（Protoporphyrin Ⅸ,原卟啉 Ⅸ） →Mg-ProtoⅨ（Mg-Protoporphyrin Ⅸ，鎂原卟啉Ⅸ）→Pchl原脫植基葉綠素Pch（Protochlorophyll,原葉綠素酸）→Chl a（Chlorophylla，葉綠素a）→Chl b（Chlorophyll b, 葉綠素 b），以上任何一個(gè)步驟受阻都會(huì)影響葉綠素正常的生物合成，隨之引起一系列的生長(zhǎng)表型變化［1-2］。冬小麥［1］、水稻［3-4］、也門(mén)鐵［6］、紅苞鳳梨［7］等多種植物具有葉綠素合成前體物質(zhì)發(fā)生變化導(dǎo)致葉綠素合成受阻而表現(xiàn)出花葉等嵌合現(xiàn)象。

紅苞鳳梨（Ananas bracteatus）又名艷鳳梨、斑葉鳳梨，為鳳梨科鳳梨屬觀賞植物，因其冠芽和葉片白、綠相間的嵌合特點(diǎn)，頗具觀賞價(jià)值，為國(guó)際上重要的盆栽花卉和鮮切花［8-9］。紅苞鳳梨等花葉植物不僅具有觀賞價(jià)值，也是研究葉色嵌合形成機(jī)理的重要材料，在觀賞植物育種和開(kāi)發(fā)利用中占重要地位［10-11］。近年來(lái)，曹莉等［8,12-16］分別從紅苞鳳梨嵌合性狀變異規(guī)律和組織細(xì)胞學(xué)、轉(zhuǎn)錄組信息、葉綠素前體物質(zhì)及葉片白化關(guān)鍵基因篩選、內(nèi)參基因篩選、胚性懸浮系及轉(zhuǎn)基因等方面開(kāi)展研究，并取得一定成果，但鮮見(jiàn)結(jié)合組織細(xì)胞學(xué)與葉綠素合成兩個(gè)方面研究紅苞鳳梨嵌合形成特性的報(bào)道。

本研究通過(guò)對(duì)紅苞鳳梨嵌合體進(jìn)行組織細(xì)胞學(xué)觀察，結(jié)合分析葉綠素及其合成前體物質(zhì)含量變化，初步確定紅苞鳳梨嵌合葉片的組織細(xì)胞學(xué)特性及其葉綠素合成受阻位點(diǎn)，闡述其嵌合性狀形成的組織細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)及葉綠素合成生理因素，為揭示紅苞鳳梨嵌合性狀形成機(jī)理、提高紅苞鳳梨嵌合體繁殖的穩(wěn)定性提供理論基礎(chǔ)，為植物花葉嵌合性狀理論研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為紅苞鳳梨金邊、金心、全白與全綠4個(gè)品種，來(lái)源于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科研基地。其中紅苞鳳梨金邊、金心及全綠植株均為生長(zhǎng)良好、長(zhǎng)勢(shì)一致的2年生盆栽植株，全白材料為嵌合體組培苗全白突變芽發(fā)育而成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 切片 選取紅苞鳳梨金邊和全綠植株幼嫩葉片，截取較寬部位2～3 cm置于載玻片上，用兩片新雙面刀片貼緊垂直向下橫向切取獲得15～20 μm薄片，將其展于清水中，做成簡(jiǎn)易切片并在顯微鏡下觀察。

1.2.2 葉綠素及其合成前體物質(zhì)含量測(cè)定 分別剪取紅苞鳳梨各品種植株葉片的綠色和白色部分測(cè)定葉綠素及其合成前體物質(zhì)含量。設(shè)全綠株葉片為對(duì)照，并設(shè)定其葉綠素及合成前體物質(zhì)含量為100%。3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)取自3棵不同植株。

（1）ALA、PBG、UroⅢ含量測(cè)定。參照徐培洲等［3］方法并稍作改進(jìn)。

ALA測(cè)定：取0.5 g葉片，用4%三氯乙酸（15 mL）及少量石英砂研磨，合并上清液并定容至20 mL，18 000 r/min離心15 min，取5 mL上清液，加入2.35 mL 1 mol/L醋酸鈉和0.15 mL乙酰丙酮，沸水浴10 min后冷卻至室溫。取2 mL加入顯色液（Ehrlich-Hg 試劑：1 g P- 二甲氨基苯甲醛溶解于30 mL冰醋酸中，加入8 mL 70%高氯酸，冰醋酸稀釋到50 mL，最后加入0.2 g 氯化汞）黑暗下顯色15 min，然后測(cè)定OD553值。

PBG 含量測(cè)定：0.5 g葉片用液氮研磨后，加入5 mL提取緩沖液（0.6 mol/L Tris，0.1 mol/L EDTA，用鹽酸調(diào)節(jié) pH至8.2），過(guò)濾或18 000 r/min離心 10 min。加入2 mL Ehrlich-Hg 試劑，黑暗中顯色15 min，測(cè)定OD553值。

UroⅢ含量測(cè)定：1 g葉片用液氮研磨后，加入10 mL 提取緩沖液（0.067 mol/L磷酸緩沖液，pH 6.8），過(guò)濾或18 000 r/min 離心10 min。取5 mL加入0.25 mL 1%Na2S2O3，劇烈振蕩后強(qiáng)光照射20 min。加入1 mol/L 甲酸（或冰醋酸）至pH 值3.5。用10 mL乙醚萃取3次，分層后測(cè)定水相的OD405.5值。

（2）ProtoⅨ、Mg- ProtoⅨ、Pchl含量測(cè)定。采用Hodgins等［17］方法。取0.3 g去主脈鮮葉，加25 mL 80%堿性丙酮，研磨提取后，分別在波長(zhǎng)575、590、628 nm處測(cè)得OD值，計(jì)算其含量。

（3）葉綠素（Chl）含量測(cè)定。取新鮮葉片0.5 g，置于2 mL丙酮∶乙酸=1∶1中浸泡24 h，浸提液在663、645 nm處測(cè)OD值，計(jì)算葉綠素的濃度和含量。

式中，Ca為葉綠素a濃度（mg/L），Cb為葉綠素b濃度（mg/L），Ct為葉綠素總濃度（mg/L）,V為浸提液體積（mL），w為材料質(zhì)量（g）。

2 結(jié)果與分析

2.1 嵌合體植株葉片的組織細(xì)胞學(xué)觀察

紅苞鳳梨葉片切片如圖1～圖3（封三）所示。圖1（封三）是紅苞鳳梨金邊嵌合體葉片紅色物質(zhì)較少時(shí)（圖4，封三）的切片，圖2（封三）是該植株紅色物質(zhì)較多時(shí)（圖4B,封三）的葉片切片，圖3（封三）是全綠植株葉片切片。嵌合體植株葉片細(xì)胞表現(xiàn)出含葉綠體、不含葉綠體和含紅色物質(zhì)等3種類(lèi)型。組織細(xì)胞學(xué)觀察表明，紅苞鳳梨金邊嵌合體植株葉片白色部分（即金邊）的細(xì)胞中幾乎不含葉綠體（圖1A、圖1B、圖2A，封三）。紅苞鳳梨金邊嵌合體植株葉片中部的海綿細(xì)胞含有豐富的葉綠體（圖1C、圖1D、圖2A，封三）。葉片中部上表皮下有兩層?xùn)艡诩?xì)胞，柵欄細(xì)胞都幾乎不含葉綠體。其中上層?xùn)艡诩?xì)胞排列緊密，形狀稍短；下層?xùn)艡诩?xì)胞具典型形態(tài)，形狀稍長(zhǎng)。從圖1E～F（封三）可以觀察到，該狀態(tài)下紅苞鳳梨金邊嵌合體植株葉片白色部分的上下表皮中分布少量的含紅色物質(zhì)細(xì)胞。從圖2B～D可以看出，該狀態(tài)下紅苞鳳梨嵌合植株的整個(gè)葉片上下表皮中都分布了豐富的紅色物質(zhì)細(xì)胞。從圖3（封三）可以看出，紅苞鳳梨全綠植株整個(gè)葉片含有豐富的葉綠體，但基本無(wú)紅色細(xì)胞。全綠植株葉片中部上表皮下有2層?xùn)艡诮M織，但第一層?xùn)艡诮M織細(xì)胞基本不含葉綠體（圖3C，封三）。

紅苞鳳梨金邊嵌合體植株葉片切片結(jié)果與田間觀察嵌合表型相一致。金邊嵌合體植株葉片白色部分幾乎不含葉綠體（圖1、圖2，封三），田間觀察即表現(xiàn)為白色；嵌合體植株葉片中部含有豐富的葉綠體（圖1、圖2，封三），田間觀察即表現(xiàn)為綠色。全綠植株葉片含有豐富的葉綠體，田間觀察即全葉呈現(xiàn)綠色，即紅苞鳳梨嵌合體植株葉片的綠色部分主要是該部位細(xì)胞含有葉綠體所致，白色部分主要是該部位細(xì)胞幾乎不含有葉綠體所致。

2.2 紅苞鳳梨各品種葉綠素及其合成前體物質(zhì)含量

由圖5可知，紅苞鳳梨金邊嵌合體植株葉片綠色和白色部位的葉綠素含量均低于對(duì)照，田間觀察也表明葉片綠色部位的顏色比全綠株葉片要淺。紅苞鳳梨金邊嵌合體植株葉片綠色部位的葉綠素合成前體物質(zhì)含量在Pchl合成前一直高于對(duì)照，且ALA、PBG含量顯著高于對(duì)照；而白色部位僅ALA和PBG含量高于對(duì)照，其中ALA含量約為對(duì)照的2.5倍，但從UroⅢ開(kāi)始葉綠素合成前體物質(zhì)含量就迅速下降，且顯著低于對(duì)照。

從圖6可以看出，紅苞鳳梨金心嵌合體植株葉片綠色和白色部位的葉綠素含量都低于對(duì)照，其中白色部位葉綠素含量很低，綠色部位含量顯著高于白色部位，與田間表型一致。紅苞鳳梨金心嵌合體植株葉片白色部位的ALA和PBG含量高于綠色部位，但從UroⅢ開(kāi)始，綠色部位的葉綠素及其合成前體物質(zhì)含量呈上升趨勢(shì)，且都顯著高于白色部位。紅苞鳳梨金心嵌合體植株葉片綠色和白色部位的葉綠素合成前體物質(zhì)PBG含量高于對(duì)照，此后其前體物質(zhì)都低于對(duì)照。其中白色部位的UroⅢ含量不到對(duì)照的1/10，ProtoⅠ、Mg-protoⅨ和Pchl含量接近對(duì)照的1/5。

從圖7可以看出，紅苞鳳梨全白植株葉片的葉綠素及其合成前體物質(zhì)含量一直都顯著低于對(duì)照。

圖5 紅苞鳳梨金邊嵌合體葉綠素及前體物質(zhì)含量

圖6 紅苞鳳梨金心嵌合體葉綠素及前體物質(zhì)含量

圖7 紅苞鳳梨全白株葉綠素及前體物質(zhì)含量

2.3 紅苞鳳梨各品種葉綠素含量比較結(jié)果

由圖5～ 圖7可知，紅苞鳳梨金邊、金心、全白植株葉片的各部位都含有葉綠素，但含量豐富程度不同。以對(duì)照葉綠素含量為100%，各品種葉片葉綠素相對(duì)含量表現(xiàn)為全綠株＞金心綠色部位＞金邊綠色部位＞金邊白色部位＞金心白色部位＞全白株，可見(jiàn)，葉綠素含量與田間觀察結(jié)果相一致。

3 結(jié)論與討論

葉綠素生物合成受阻會(huì)導(dǎo)致葉綠素合成量減少，從而引起黃化甚至白化。本研究結(jié)果表明，紅苞鳳梨全綠、金邊、金心、全白植株葉片各部位的葉綠素含量豐富程度不同，各品種葉綠素相對(duì)含量表現(xiàn)為全綠株＞金心綠色部位＞金邊綠色部位＞金邊白色部位＞金心白色部位＞全白株，葉綠素含量與植株葉片田間表型對(duì)應(yīng)。結(jié)合切片結(jié)果可以確定，植株葉片綠色部分細(xì)胞含有豐富的葉綠素，而白色部分細(xì)胞葉綠體含量少是紅苞鳳梨葉片嵌合性狀形成的主要原因，這與也門(mén)鐵研究結(jié)果［11］相一致。

紅苞鳳梨金邊嵌合體植株葉片綠色部位的葉綠素合成前體物質(zhì)含量在Pchl合成之前一直比全綠苗（對(duì)照）高；白色部位的ALA和PBG含量高于對(duì)照，但從UroⅢ開(kāi)始葉綠素合成前體物質(zhì)含量迅速下降，且顯著低于對(duì)照。初步確定紅苞鳳梨金邊嵌合體植株葉片白色部位的葉綠素合成在UroⅢ合成時(shí)受阻，導(dǎo)致葉綠素合成代謝下降。

紅苞鳳梨金心嵌合體植株葉片綠色部位和白色部位的葉綠素合成前體物質(zhì)PBG含量高于對(duì)照，從UroⅢ開(kāi)始合成前體物質(zhì)都低于對(duì)照，其中白色部位的UroⅢ含量不到對(duì)照的1/10，ProtoⅨ、Mg-protoⅨ和Pchl含量?jī)H接近對(duì)照的1/5。初步確定紅苞鳳梨金心嵌合體植株葉片白色部位的葉綠素合成也是在UroⅢ合成時(shí)受阻，導(dǎo)致葉綠素合成代謝下降。該研究結(jié)果與水稻［5］、金邊也門(mén)鐵［6］等植物一致。

紅苞鳳梨全白植株葉綠素及合成前體物質(zhì)含量均顯著低于對(duì)照，說(shuō)明紅苞鳳梨白化植株的葉綠素合成是在前體物質(zhì)ALA合成時(shí)受阻，導(dǎo)致葉綠素合成代謝下降，這與冬小麥等研究結(jié)果［1］一致。

紅苞鳳梨各品種葉綠素合成受阻，表明在葉綠素合成途徑中存在某個(gè)調(diào)控因子，導(dǎo)致葉綠素合成代謝下降，葉綠素含量低的部位出現(xiàn)白化現(xiàn)象，最終導(dǎo)致紅苞鳳梨金邊、金心等品種植株葉片表現(xiàn)出條斑等花葉嵌合性狀。但調(diào)控機(jī)理還需進(jìn)一步深入研究。