胎盤組織中CYP1A1表達(dá)在孕期香煙煙霧暴露致胎鼠宮內(nèi)發(fā)育遲緩中的作用

蔡恒 李智文 滕佩宏 賈童童 王越 張永鎮(zhèn) 于向民 王東

胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩(intrauterine growth retardation, IUGR)是圍產(chǎn)兒死亡和出生后生長發(fā)育落后等的重要原因，已受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注[1-3]。研究表明[4-5]，妊娠期間香煙煙霧暴露是導(dǎo)致IUGR的常見原因之一。香煙煙霧中的有害化合物眾多，不僅對母體產(chǎn)生傷害，而且影響胚胎的發(fā)育過程。胎盤是胎兒從母體獲得生長發(fā)育所必需的營養(yǎng)物質(zhì)、排除自身代謝廢物的重要器官，同時它又對可能進(jìn)入胎兒體內(nèi)的有害物質(zhì)起到重要的屏障作用。在胎盤中存在多種微粒體細(xì)胞色素P450(cytochrome P450， CYP)酶系，有研究指出CYP1A1、CYP1B1和CYP2B1等主要參與致癌物的氧化代謝，并在芳香化合物、尼古丁等的代謝中發(fā)揮重要作用[6]。然而，香煙煙霧暴露時胎盤中CYP同工酶的變化情況與IUGR發(fā)生之間的關(guān)系研究較少。鑒于此，本研究在建立金黃地鼠被動吸煙模型的基礎(chǔ)上，觀察IUGR的發(fā)生率與CYP1A1表達(dá)變化的關(guān)系，從而為探討被動吸煙導(dǎo)致IUGR的機(jī)理提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料與方法

一、材料

1.實(shí)驗(yàn)動物：未經(jīng)產(chǎn)的SPF級雌性金黃地鼠60只和雄性20只，體重(100±10) g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司(SCXK(京)2012-0001)。

2.實(shí)驗(yàn)動物分組：80只金黃地鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，常規(guī)飲水，于每晚8：00～9：00將雌鼠和雄鼠1：1合籠，每晚大約合籠5對，次日早8:00陰道涂片，檢查到精子者定為受精后的第1天(E 1d)。將孕鼠隨機(jī)分為被動吸煙組和對照組，每組30只。

二、方法

1.香煙煙霧暴露處理：被動吸煙組所有孕鼠從受精后的第1天開始在自制被動吸煙箱(60 cm×60 cm×100 cm)中進(jìn)行香煙煙霧暴露，使用上海煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司生產(chǎn)的X牌香煙(焦油量：8 mg；煙氣煙堿量：0.6 mg；煙氣一氧化碳量：9 mg)進(jìn)行煙熏，每天2次，每次10支香煙，每次熏煙持續(xù)時間15分鐘。對照組除箱內(nèi)無煙熏外，其余條件與被動吸煙組同。

2.動物標(biāo)本獲?。罕粍游鼰熃M和對照組的所有孕鼠于受精后的第11天(E 11d)麻醉后，剖腹，取出子宮，在體視顯微鏡下剖開子宮，取出胚胎和胎盤。觀察胚胎的發(fā)育情況，記錄胚胎數(shù)及吸收胚胎數(shù)，測量胎盤重量、活胎的體重和體長。IUGR判斷標(biāo)準(zhǔn)：將低于對照組活胎平均體重2個標(biāo)準(zhǔn)差診斷為IUGR[7]。

3. 免疫組織化學(xué)染色：分別從每窩的胚胎和胎盤中隨機(jī)取5只胚胎和胎盤，進(jìn)行常規(guī)固定、石蠟包埋和切片(厚度4 μm)，石蠟切片脫蠟后，經(jīng)雙氧水甲醇封閉內(nèi)源性過氧化物酶，滴加山羊血清封閉液，之后分別滴加CYP1A1、Bcl2和BAX抗體，4℃孵育過夜，復(fù)溫后滴加抗兔辣根過氧化物酶標(biāo)記聚合物，DAB顯色，蘇木精復(fù)染后常規(guī)脫水、透明、封片。光鏡下觀察、拍照。在染色過程中，設(shè)陰性對照(用PBS代替一抗，其余步驟同上)，以排除假陽性結(jié)果。利用Image Pro Plus 6.0(IPP)圖像分軟件測量所有免疫組織化學(xué)染色標(biāo)本的平均光密度值(Optical Density，OD)，同一只金黃地鼠的胎盤組織切片的染色結(jié)果求均值，以表示其蛋白的表達(dá)量。

結(jié) 果

一、被動吸煙導(dǎo)致胎鼠宮內(nèi)發(fā)育遲緩:被動吸煙組孕11天的每胎仔數(shù)為(15±4)，對照組為(12±4)，兩組相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。胚胎的體重為(81.6±2.3)mg，低于對照組胚胎體重(105.5±0.7)mg，兩組的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。相對應(yīng)的被動吸煙組胚胎的體長(7.2±0.4 mm)低于對照組(7.8±0.3 mm)，兩組的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。被動吸煙組IUGR的發(fā)生率為27.4%(20/73)，明顯高于對照組的2.3%(2/88)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

表1 被動吸煙對胚胎體重、體長及胎盤重量的影響

Note:Compared with control group，*P<0.001

表2被動吸煙致胚胎宮內(nèi)發(fā)育遲緩情況

Table2Embryonic intrauterine growth retardation caused by passive smoking

GroupsNumber ofembryosNumber ofIUGR embryosIncidence ofIUGR(%)Control group8822.3Smoking group732027.4*

Note:Compared with control group，*P<0.001

二、被動吸煙對胎盤中CYP1A1表達(dá)量的影響:被動吸煙組胎盤組織中的CYP1A1的表達(dá)量高于對照組(P<0.001)(圖1)。

三、被動吸煙對胎盤中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)量的影響：被動吸煙組胎盤組織中抑制凋亡蛋白Bcl2的表達(dá)量低于對照組(P<0.001)，促凋亡蛋白BAX表達(dá)量高于對照組(P<0.001)(圖2)，提示香煙煙霧可以促進(jìn)胎盤細(xì)胞凋亡。

圖1 香煙煙霧影響胎盤組織中CYP1A1蛋白的表達(dá)Figure 1 Effect of cigarette smoking on CYP1A1 protein expression in the placenta of the golden hamsters between the smoking group and control group.A. CYP1A1 expression in the control group was significantly lower than that of the smoking group after immunohistochemical staining, bar:200 μm. B. Detection of CYP1A1 expression in the placenta of two groups by using IPP image analysis software. OD value was used to indicate the level of protein expression, ***P<0.001.

討 論

2010年我國15歲以上婦女的被動吸煙率高達(dá)71.6%，農(nóng)村高于城市[8]，由被動吸煙引起的胚胎毒性作用備受關(guān)注。本研究利用金黃地鼠制備被動吸煙模型，觀察香煙煙霧暴露對胚胎發(fā)育的影響。金黃地鼠的繁殖力強(qiáng)，每胎產(chǎn)仔數(shù)為4～17只，正常情況下，胎鼠在宮內(nèi)的發(fā)育可有不均衡現(xiàn)象。本研究結(jié)果顯示香煙煙霧暴露組孕11天的每胎仔數(shù)低于對照組，胚胎體重明顯低于對照組，胚胎體長也短于對照組，且被動吸煙組IUGR的發(fā)生率明顯高于對照組，表明香煙煙霧對胎鼠在宮內(nèi)發(fā)育有顯著的毒性作用。香煙燃燒可使煙霧中產(chǎn)生大量的活性氧自由基，此外煙霧中多環(huán)芳烴、雜環(huán)化合物、醌類等進(jìn)入機(jī)體后在許多代謝酶參與下產(chǎn)生更大量的超氧陰離子。這些毒性物質(zhì)被母體吸收后，或通過損傷胎盤的正常結(jié)構(gòu)影響胚胎發(fā)育，或透過胎盤屏障直接影響胚胎的發(fā)育過程。

胎盤是胚胎從母體獲得營養(yǎng)來源的器官，胎盤的結(jié)構(gòu)和功能狀態(tài)會直接影響胚胎的發(fā)育。本研究觀察到被動吸煙可降低胎盤的重量，提示被動吸煙影響胎盤的發(fā)育。細(xì)胞色素P450(CYP)是一系列體內(nèi)代謝的重要的Ⅰ相代謝酶，其中CYP1A1廣泛分布于肺、腦和胎盤等肝外組織中[6]，在生理狀態(tài)下，它在胎盤中的表達(dá)較低[9-10]，CYP1A1的底物以多環(huán)芳烴類等環(huán)境致癌物為主[11]。外源性芳香烴類化合物可通過芳烴受體激活CYP1A1基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，并增強(qiáng)酶的活性[11]。本研究結(jié)果顯示，被動吸煙組胎盤組織中的CYP1A1的表達(dá)量高于對照組，提示香煙煙霧的暴露可誘導(dǎo)CYP1A1蛋白表達(dá)，增加香煙煙霧的毒性作用，影響胎盤的發(fā)育，導(dǎo)致胎盤的重量降低。

在胎盤的發(fā)育過程中，胎盤組織的細(xì)胞凋亡和細(xì)胞增殖處于一個動態(tài)平衡狀態(tài)，這一動態(tài)平衡的存在有利于妊娠狀態(tài)的維持[12-13]。有研究表明，Bcl2和BAX的表達(dá)異常與胎盤細(xì)胞凋亡的發(fā)生具有一致性，提示凋亡因子可通過降低絨毛膜和蛻膜組織中Bcl2的表達(dá)、增高BAX的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而影響胎盤的發(fā)育，引起胚胎發(fā)育異常[14]。本研究結(jié)果顯示，被動吸煙組胎盤組織中抑制凋亡蛋白Bcl2的表達(dá)量低于對照組，促凋亡蛋白BAX的表達(dá)量高于對照組，提示香煙煙霧可以促進(jìn)胎盤細(xì)胞凋亡，使胎盤的重量減輕，影響胚胎發(fā)育，導(dǎo)致胎鼠宮內(nèi)發(fā)育遲緩。