微衛(wèi)星標(biāo)記方法在大型貓科動(dòng)物保護(hù)群遺傳學(xué)研究中的應(yīng)用與挑戰(zhàn)

王 萌 朱思雨 薛茂盛 劉 霖 任迎豐 李立新 許 青 姜廣順*

(1.東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物資源學(xué)院，哈爾濱，150040；2.中國(guó)野生動(dòng)物保護(hù)協(xié)會(huì)，北京，100029；3.國(guó)有濟(jì)源市愚公林場(chǎng)，濟(jì)源，454650)

貓科(Felidae)動(dòng)物通常位于食物鏈的頂端，隸屬于脊索動(dòng)物門(Chordata)哺乳綱(Mammalia)食肉目(Carnivora)貓型亞目(Feliformia)。目前貓科動(dòng)物分類尚存爭(zhēng)議，《中國(guó)動(dòng)物志》中將貓科動(dòng)物分為28種，我國(guó)有6屬13種[1]。貓科動(dòng)物分布廣泛，除澳洲和南極洲以外，世界大部分地區(qū)都有分布[2]。通常貓科動(dòng)物分為大型和小型兩類，代表了貓科動(dòng)物早期的兩個(gè)分支[3]。大型貓科具有不完全骨化的舌骨，舌骨中部具有彈性軟骨；小型貓科動(dòng)物具有完全固化的舌骨，所以它們能發(fā)出嗚嗚的貓叫聲但不能發(fā)出大型貓科動(dòng)物那樣的怒吼聲，熟知種類為家貓(Feliscatus)[1]。大型貓科動(dòng)物通常指非洲獅(Pantheraleo)、虎(Pantheratigris)、豹(Pantherapardus)、美洲豹(Pantheraonca)和雪豹(Unciauncia)。同時(shí)，美洲獅(Pumaconcolor)和獵豹(Acinonyxjubatus)體型也較大，也被視為大型貓科動(dòng)物[4]。作為頂級(jí)捕食者，大型貓科動(dòng)物的存在基于整個(gè)自然界：通過改變草食動(dòng)物對(duì)植物的影響，頂級(jí)捕食者可以對(duì)植物產(chǎn)生強(qiáng)烈的間接影響，而植被依賴于復(fù)雜的土壤結(jié)構(gòu)以及構(gòu)成生態(tài)系統(tǒng)的所有相互關(guān)聯(lián)的生物[4-5]。頂級(jí)捕食者的存在可以調(diào)節(jié)該地區(qū)的生態(tài)系統(tǒng)，增加其穩(wěn)定性[6]。

保護(hù)遺傳學(xué)研究是野生動(dòng)物保護(hù)工作中的重要組成部分。由于人類社會(huì)的盲目開采，資源匱乏嚴(yán)重威脅著野生動(dòng)物的生存，許多野生動(dòng)物僅殘存于破碎的生境中。由于生境破碎化，種群隔離、基因交流中斷、近親繁殖等問題日益嚴(yán)重。由于以上原因保護(hù)生物學(xué)應(yīng)運(yùn)而生[7]。保護(hù)遺傳學(xué)主要包括種群遺傳學(xué)，分子生態(tài)學(xué)，分子生物學(xué)，進(jìn)化生物學(xué)等學(xué)科[8]。隨著分子遺傳學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，野生動(dòng)物保護(hù)遺傳學(xué)的方法日益增加。目前應(yīng)用較廣的方法主要有生物芯片標(biāo)記技術(shù)[9-11]、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性(RAPD)標(biāo)記[12]、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)(AFLP)標(biāo)記[13]、微衛(wèi)星標(biāo)記方法[14-16]等。取得樣品時(shí)，多采用非損傷性取樣方法[17-18]。野生動(dòng)物保護(hù)遺傳學(xué)的研究?jī)?nèi)容，目前主要集中于遺傳多樣性[19-20]、種群結(jié)構(gòu)[21]、個(gè)體識(shí)別[22-23]等方面。微衛(wèi)星標(biāo)記作為保護(hù)遺傳學(xué)中應(yīng)用極其廣泛的方法，具有多態(tài)性高，穩(wěn)定性高等諸多優(yōu)點(diǎn)，并且由于發(fā)生變異較頻繁，尤其適用于較短時(shí)間內(nèi)發(fā)生的遺傳分化以及遺傳多樣性分析，在越來越多的研究中都有使用。

對(duì)于大型貓科動(dòng)物的研究目前主要分野生種群和圈養(yǎng)種群的研究。野生大型貓科動(dòng)物通常為獨(dú)居動(dòng)物，極少群居，并且具有易躲避人類的習(xí)性，野生種群的研究通常具有極度的偶然性。對(duì)于野生動(dòng)物的研究通常集中于生態(tài)研究、保護(hù)遺傳學(xué)、種群監(jiān)測(cè)等方面。隨著保護(hù)遺傳學(xué)的發(fā)展，越來越多的遺傳學(xué)方法可以應(yīng)用于野生大型貓科動(dòng)物的監(jiān)測(cè)保護(hù)中。

1 微衛(wèi)星方法的研究進(jìn)展

衛(wèi)星DNA由長(zhǎng)串聯(lián)重復(fù)序列組成，根據(jù)重復(fù)單位的大小，可分為衛(wèi)星DNA、小衛(wèi)星DNA、微衛(wèi)星DNA 3種[24]。微衛(wèi)星標(biāo)記，具有高穩(wěn)定性、高多態(tài)性、引物通用性、位點(diǎn)特異性、檢測(cè)方便和呈共顯性遺傳等特點(diǎn)，是廣泛應(yīng)用于動(dòng)物遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建、雌核發(fā)育、基因定位及克隆、親權(quán)鑒定等的理想分子標(biāo)記[25]。

1.1 微衛(wèi)星標(biāo)記的開發(fā)

傳統(tǒng)方法中，微衛(wèi)星位點(diǎn)已從目標(biāo)物種的部分基因組文庫中分離出來。微衛(wèi)星從目標(biāo)物種基因文庫分離出來后，根據(jù)DNA片段的長(zhǎng)度、待發(fā)現(xiàn)的微衛(wèi)星重復(fù)單元以及片段末端的類型選擇限制酶，通過探針雜交將目的克隆片段從數(shù)千個(gè)菌落中分離出來[26]。這種方法雖然操作簡(jiǎn)單，但是對(duì)于微衛(wèi)星頻率低的物種，該方法效率極低[27]。另一些人提出利用RAPD引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增未知微衛(wèi)星位點(diǎn)后利用微衛(wèi)星探針進(jìn)行Southern雜交[28-29]。目前，常用于大型貓科動(dòng)物種群遺傳學(xué)的位點(diǎn)多為應(yīng)用此種方法開發(fā)的[30-31]。FIASCO法是另一種開發(fā)微衛(wèi)星標(biāo)記的方法，相較于之前的方法，F(xiàn)IASCO方法利用AFLP方法標(biāo)記，效率大為提高[27]。Zhang等曾利用此種方法開發(fā)11個(gè)應(yīng)用于華南虎(Pantheratigrisamoyensis)的微衛(wèi)星位點(diǎn)引物，在57個(gè)個(gè)體中進(jìn)行擴(kuò)增，除一個(gè)位點(diǎn)無多態(tài)性，其余位點(diǎn)含有4—9個(gè)等位基因[32]。

目前，高通量測(cè)序方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用，許多微衛(wèi)星標(biāo)記的開發(fā)，也使用到了高通量測(cè)序的方法。利用高通量測(cè)序方法進(jìn)行微衛(wèi)星標(biāo)記開發(fā)，具有高效、便捷、準(zhǔn)確的特點(diǎn)[33]。萬冬梅等利用高通量測(cè)序開發(fā)沼澤山雀(Poecilepalustris)微衛(wèi)星位點(diǎn)，最終成功搜索出2 471個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)[34]。

1.2 微衛(wèi)星標(biāo)記研究概況

微衛(wèi)星標(biāo)記在眾多領(lǐng)域都有許多應(yīng)用，在對(duì)于野生動(dòng)物的種群數(shù)量、遺傳多樣性、遺傳結(jié)構(gòu)的研究中越來越多地依賴微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)。除此之外，在育種、醫(yī)療、法醫(yī)等領(lǐng)域微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)也有廣泛的應(yīng)用。在對(duì)于大熊貓的研究中，目前以論文形式公開發(fā)表的大熊貓(Ailuropodamelanoleuca)微衛(wèi)星標(biāo)記已有109個(gè)，利用這些微衛(wèi)星標(biāo)記，大熊貓的種群數(shù)量、遺傳多樣性、種群結(jié)構(gòu)等諸多方面進(jìn)行了深入的研究[35]。對(duì)于棲息于芬蘭的棕熊(Ursusarctos)的研究中，通過基因流研究并與俄羅斯、瑞典和挪威種群的遺傳組成進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)俄羅斯的棕熊大量遷入東部種群，加速了東部種群的恢復(fù)[36]。

育種方面，微衛(wèi)星標(biāo)記常用于監(jiān)測(cè)種群結(jié)構(gòu)以及遺傳潛力[37]。醫(yī)學(xué)方面，微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI)與癌癥易感基因以及預(yù)后的關(guān)系為近年來的研究熱點(diǎn)[38-39]。法醫(yī)方面，通過對(duì)現(xiàn)場(chǎng)被害人或罪犯遺留的血痕、精斑、毛發(fā)、骨骼等人體材料做出個(gè)人識(shí)別或同一性鑒定[40]。

2 利用微衛(wèi)星方法對(duì)于大型貓科動(dòng)物進(jìn)行遺傳學(xué)研究

野生大型貓科動(dòng)物難以捕捉，通常將非損傷性取樣方法與微衛(wèi)星標(biāo)記方法相結(jié)合，以便在不傷害野生動(dòng)物的情況下獲得其遺傳樣本，并監(jiān)測(cè)其種群遺傳多樣性，種群結(jié)構(gòu)等相關(guān)遺傳參數(shù)。

2.1 非損傷性取樣方法

采用非損傷性取樣方法，可以從脫落的毛發(fā)及羽毛中，糞便、尿液中，甚至蛋殼中提取到DNA[41]。糞便樣品相較于其他非損傷性樣品具有較多優(yōu)點(diǎn)。糞便樣品具有可獲得性高，可識(shí)別度高，不干擾動(dòng)物正?；顒?dòng)，安全，DNA含量較大，可獲得多元遺傳信息等優(yōu)點(diǎn)[42]。采集后可以對(duì)其進(jìn)行物種分布、食性、性別、個(gè)體以及數(shù)量、種群密度進(jìn)行鑒別及估算[43]。

目前糞便中DNA提取相較于肌肉DNA、肝臟DNA來說質(zhì)量較差，成分復(fù)雜，不僅含有目標(biāo)物種腸道脫落細(xì)胞，還含有大量的腸道微生物、食物殘?jiān)?、酶、脂類、蛋白質(zhì)、多糖等代謝物質(zhì)。未提取時(shí)容易被糞便中微生物降解，對(duì)于儲(chǔ)存有較高要求[44-46]。并且在基因分型時(shí)容易無PCR產(chǎn)物或獲得錯(cuò)誤基因分型[47-50]。但是研究野生動(dòng)物遺傳，尤其是瀕危野生動(dòng)物，如大熊貓、虎、熊等的遺傳學(xué)研究中，非損傷性取樣仍然是主要取樣方法[17-18，51-52]。通過嚴(yán)格的試驗(yàn)技術(shù)、適用于糞便DNA位點(diǎn)的篩選，糞便DAN樣品的弊端大為減少。Zhang等[53]收集黑龍江省東北虎林園的虎血液以及糞便樣品并提取DNA，血液DNA作為陽性對(duì)照進(jìn)行12個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)其中8個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)能穩(wěn)定擴(kuò)增，適合用作東北虎(Pantheratigrisaltaica)糞便DNA的研究。隨著非損傷性取樣法的局限性逐漸被打破，使用范圍不斷擴(kuò)大，結(jié)合微衛(wèi)星等標(biāo)記技術(shù)，通過分析非損傷性遺傳樣本中的核DNA，能夠進(jìn)行個(gè)體鑒定、親緣關(guān)系判定、譜系重建、性別鑒定和種群數(shù)量評(píng)估，這對(duì)野生動(dòng)物種群監(jiān)測(cè)具有重要意義[25，30，54]。

2.2 微衛(wèi)星標(biāo)記方法在大型貓科動(dòng)物研究中的應(yīng)用

2.2.1 微衛(wèi)星標(biāo)記

目前大型貓科動(dòng)物微衛(wèi)星標(biāo)記多借用家貓微衛(wèi)星標(biāo)記。這些標(biāo)記位點(diǎn)最初由Marilyn等[30]設(shè)計(jì)，后來逐步用于大型貓科動(dòng)物，尤其是虎的保護(hù)遺傳學(xué)，大多都選用了其中一些位點(diǎn)進(jìn)行研究。在對(duì)于Primorye Krai地區(qū)東北虎的研究中同樣選取這些引物中的10個(gè)在東北虎物種具有多態(tài)性的位點(diǎn)，識(shí)別出12只個(gè)體并估測(cè)2002—2003年有9—19只個(gè)體棲息于此[55]。對(duì)其中一些位點(diǎn)進(jìn)行修飾后可設(shè)計(jì)多重分型體系，應(yīng)用于大型貓科動(dòng)物的研究，減少工作量之余還可減少對(duì)模板DNA的消耗[56]。在選擇標(biāo)記位點(diǎn)時(shí)，選取這些位點(diǎn)與其他大型貓科動(dòng)物的微衛(wèi)星位點(diǎn)甚至線粒體位點(diǎn)共同使用也廣泛應(yīng)用對(duì)大型貓科動(dòng)物的研究[56]。

除此之外，還有為某些特定物種大型貓科動(dòng)物的引物也被證明在其他大型貓科動(dòng)物中同樣具有多態(tài)性得到了廣泛應(yīng)用，如蘇門答臘虎(Pantheratigrissumatrae)設(shè)計(jì)的微衛(wèi)星位點(diǎn)引物，被證明在東北虎、豹、獅子上同樣具有多態(tài)性[31，57]。為孟加拉虎(Pantheratigristigris)研究設(shè)計(jì)的微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)，在隨后的其他虎例如東北虎的研究中也有應(yīng)用[53，58]。

2.2.2 種群數(shù)量調(diào)查

通過個(gè)體識(shí)別可了解野外種群的大小，是保護(hù)工作的重點(diǎn)和基礎(chǔ)，只有了解種群大小，才能制定合理的保護(hù)計(jì)劃。利用糞便DNA使用微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)大型貓科動(dòng)物野生種群遺傳學(xué)監(jiān)測(cè)在世界各地的保護(hù)區(qū)以及國(guó)家公園都有應(yīng)用。在印度西高止山脈的虎豹種群數(shù)量研究中，通過糞便DNA識(shí)別出18只虎和39只豹[59]。尼日利亞Yankari Game 保護(hù)區(qū)和Kainji Lake國(guó)家公園內(nèi)自2008至2010年收集獅子的糞便樣本進(jìn)行個(gè)體識(shí)別以及遺傳多樣性監(jiān)測(cè)，在來自Yankari Game 保護(hù)區(qū)的樣品中識(shí)別出10只個(gè)體(7只雄性，3只雌性)，Kainji Lake國(guó)家公園的樣品中識(shí)別出8只個(gè)體(2只雄性，3只雌性，2只未知)[60]。Rozhnov 等[61]利用保護(hù)遺傳學(xué)方法分析了Primori西南部東北豹(Pantherapardusorientalis)的種群結(jié)構(gòu)，2010—2012年收集的樣品中鑒別出23只個(gè)體，并分析了其種群遺傳結(jié)構(gòu)。Wang等[43]在琿春國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)收集55份東北虎糞便樣品以及一份毛發(fā)樣品，從中鑒定出7只個(gè)體(2只雄性，4只雌性，1只性別未知個(gè)體)，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)中國(guó)東北虎種群遺傳多樣性低于俄羅斯東北虎種群遺傳多樣性，可能是中國(guó)東北虎種群較小而導(dǎo)致的。通過個(gè)體識(shí)別了解種群大小、性別比例等，可以結(jié)合種群遺傳多樣性參數(shù)對(duì)種群未來發(fā)展進(jìn)行一定的預(yù)測(cè)。

2.2.3 遺傳多樣性檢測(cè)

遺傳多樣性是指種內(nèi)基因的變化，亦稱為基因多樣性。種內(nèi)的多樣性是物種以上各水平多樣性的重要來源[62]。種群遺傳多樣性是遺傳多樣性的重要體現(xiàn)，表現(xiàn)了一個(gè)物種的進(jìn)化潛力和抵御不良環(huán)境的能力。遺傳多樣性越高，該群體對(duì)于環(huán)境的適應(yīng)能力就越強(qiáng)，更容易在變化的環(huán)境中生存[63]。Wu 等[64]利用16個(gè)家貓微衛(wèi)星引物以及4個(gè)蘇門答臘虎微衛(wèi)星引物對(duì)20只動(dòng)物園繁殖東北虎進(jìn)行遺傳多樣性以及親緣關(guān)系檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)這些東北虎雜合度高，并且遺傳多態(tài)性高。津巴布韋Savé Valley保護(hù)區(qū)收集樣品進(jìn)行種群遺傳學(xué)監(jiān)測(cè)，該保護(hù)區(qū)種群2005年曾減少到5—10只個(gè)體，重新引入10只個(gè)體后2016年已經(jīng)恢復(fù)到200只以上。利用11個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)識(shí)別出42個(gè)個(gè)體，雖然個(gè)體數(shù)量較多，但遺傳多樣性較低，出現(xiàn)了近交現(xiàn)象，需要再次引入個(gè)體[65]。通過種群遺傳多樣性的研究可對(duì)種群遺傳的基本情況有所了解，對(duì)于制訂保護(hù)計(jì)劃也十分重要。

2.2.4 種群遺傳結(jié)構(gòu)分析

目前，大多數(shù)貓科動(dòng)物都面臨著棲息地破碎化這一嚴(yán)峻的生態(tài)問題，棲息地破碎化是許多保護(hù)問題的根源所在。棲息地破碎華對(duì)于其居于其中的動(dòng)物影響最嚴(yán)重的就是破碎的棲息地阻止了基因交流，遺傳豐富度降低，廊道和景觀連通可以改善這種情況[66]。Sorokin 等[58]使用分損傷性取樣方法進(jìn)行分子遺傳分析在Ussuriskii國(guó)家保護(hù)區(qū)、Udegeyskaya Legenda國(guó)家公園和Khabarovskii Krai收集樣品，利用9個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)從256份糞便樣品、7份毛發(fā)樣品、11份血液樣品中識(shí)別出63只東北虎個(gè)體，并進(jìn)行種群遺傳結(jié)構(gòu)分析。來自Khabarovskii Krai的樣品和Udegeyskaya Legenda國(guó)家公園的樣品屬于同一種群，而來自Ussuriskii國(guó)家保護(hù)區(qū)的樣品屬于另一種群。對(duì)于獵豹進(jìn)行種群遺傳學(xué)調(diào)查中，利用14個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)博茨瓦納不同地區(qū)的獵豹之間存在著一定的遺傳分化，并且雄性比例高于預(yù)期[67]。Wultsch等[68]選取5個(gè)取樣點(diǎn)采集美洲豹、美洲獅和豹貓(Prionailurusbengalensis)樣品共計(jì)1 053份利用14個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)擴(kuò)增進(jìn)行遺傳監(jiān)測(cè)，觀察到3個(gè)物種均顯示出遺傳分化，表明棲息地破碎化已對(duì)這3種動(dòng)物的基因交流產(chǎn)生了影響。Terai 景觀弧跨越印度與尼泊爾兩國(guó)，兩國(guó)均對(duì)本國(guó)境內(nèi)景觀弧區(qū)域孟加拉虎種群進(jìn)行了遺傳結(jié)構(gòu)分析。印度區(qū)域內(nèi)收集孟加拉虎遺傳樣品71份，利用13個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)該區(qū)域內(nèi)兩個(gè)保護(hù)區(qū)中孟加拉虎種群基因流受阻，已經(jīng)產(chǎn)生分化，需采取措施減少人為干擾[69]。尼泊爾區(qū)域內(nèi)的孟加拉虎進(jìn)行種群遺傳分析，收集該區(qū)域內(nèi)5個(gè)保護(hù)區(qū)以及6個(gè)可能的廊道中412份孟加拉虎遺傳樣品，利用8個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記識(shí)別出78只個(gè)體，這些個(gè)體中有3—7只具有移動(dòng)性，形成了3個(gè)遺傳種群并具有中度分化，基因流同樣受阻，需進(jìn)一步規(guī)劃對(duì)Terai 景觀弧進(jìn)行保護(hù)以加強(qiáng)基因流動(dòng)[70]。由以上文獻(xiàn)可以發(fā)現(xiàn)由于棲息地破碎化，幾乎所有大型貓科動(dòng)物的基因交流都受到了阻礙，產(chǎn)生了遺傳分化。加強(qiáng)廊道的保護(hù)，減少棲息地破碎化對(duì)于基因交流的影響對(duì)于大型貓科動(dòng)物保護(hù)十分重要。

3 未來應(yīng)用與挑戰(zhàn)

微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)在貓科動(dòng)物的保護(hù)工作中使用十分普遍，具有不可替代的地位。在監(jiān)測(cè)野生動(dòng)物種群遺傳多樣性、種群大小、種群結(jié)構(gòu)以及諸多其他方面均發(fā)揮有重要作用。微衛(wèi)星標(biāo)記的方法具有諸多優(yōu)點(diǎn)，但是應(yīng)用中仍有一些缺陷。首先，雖然微衛(wèi)星擴(kuò)增片段有許多短片段，但是在野生動(dòng)物的研究中分型成功率并不高[70]，主要是因?yàn)榧S便樣品DNA濃度低，并且在含有食物以及微生物的DNA以及其他雜質(zhì)。其次，微衛(wèi)星位點(diǎn)的選擇頗多，許多針對(duì)相同物種的研究選取的微衛(wèi)星位點(diǎn)僅有少量相同而不能進(jìn)行充分的結(jié)果比較[43，51，58-59]。目前大型貓科動(dòng)物使用的微衛(wèi)星標(biāo)記多為二堿基重復(fù)，在PCR過程中易發(fā)生滑動(dòng)而現(xiàn)錯(cuò)誤[71]，需要每批次分型時(shí)設(shè)置可以穩(wěn)定擴(kuò)增的樣品進(jìn)行矯正。即使選擇相同位點(diǎn)，沒有矯正樣品的數(shù)據(jù)也不能合并分析。并且，目前微衛(wèi)星分型沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，分型結(jié)果也不能如同DNA序列一樣上傳至數(shù)據(jù)庫共享數(shù)據(jù)。缺乏數(shù)據(jù)的可比性嚴(yán)重制約了微衛(wèi)星標(biāo)記的應(yīng)用。

目前已有許多針對(duì)糞便DNA提取與保存的研究[72-73]，隨著提取DNA方法的改進(jìn)，糞便樣品DNA擴(kuò)增成功率將大為提高。二代測(cè)序技術(shù)已經(jīng)趨于成熟，許多大型貓科動(dòng)物的基因組序列也已經(jīng)發(fā)表，位點(diǎn)篩選的工作量與傳統(tǒng)方法相比將大為減少[74-75]。設(shè)計(jì)擴(kuò)增目的片段更短的四堿基重復(fù)片段將大為減少滑動(dòng)而出現(xiàn)的錯(cuò)誤[76]。另外，進(jìn)一步統(tǒng)一分型標(biāo)準(zhǔn)也將增進(jìn)微衛(wèi)星分型數(shù)據(jù)的可比性。

現(xiàn)有的研究已有許多微衛(wèi)星標(biāo)記結(jié)合其他研究方法。結(jié)合線粒體DNA標(biāo)記進(jìn)行研究，相比于單純使用微衛(wèi)星標(biāo)記，具有更高的可信度，常用于種群遺傳監(jiān)測(cè)以及構(gòu)建進(jìn)化樹的研究中[57]，結(jié)合宏觀生態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)如空間地理坐標(biāo)可以研究如遺傳距離與地理距離的關(guān)系[77]。未來在大型貓科動(dòng)物的研究中，使用單一微衛(wèi)星標(biāo)記方法所提供的信息已不能滿足對(duì)于大型貓科動(dòng)物種群的研究，結(jié)合其他標(biāo)記方法將成為微衛(wèi)星標(biāo)記研究的主要方向，如結(jié)合對(duì)糞便進(jìn)行食性研究可監(jiān)測(cè)個(gè)體取食情況，結(jié)合糞便中各項(xiàng)生化指標(biāo)監(jiān)測(cè)個(gè)體的激素水平等。針對(duì)不同的目的選擇合適的方法與微衛(wèi)星標(biāo)記相結(jié)合，可以更好地監(jiān)測(cè)野生動(dòng)物種群動(dòng)態(tài)。