線粒體調(diào)控先天性免疫機制研究進展

毛旭明，孫英杰，武 瑋，謝 軍，丁 鏟，吳艷濤

（1.揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，揚州 225009；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；3. 西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州 730030）

線粒體是真核細胞中一種重要的具有雙層膜結(jié)構(gòu)的細胞器，除了成熟的哺乳動物紅細胞和某些單細胞生物之外，線粒體幾乎存在于所有真核生物細胞中。線粒體最先被發(fā)現(xiàn)也是最重要的功能是通過呼吸鏈產(chǎn)生能量，即三磷酸腺苷（ATP）。ATP產(chǎn)生最重要的通路是三羧酸循環(huán)，線粒體內(nèi)膜上的大量蛋白質(zhì)參與了這一過程，因此線粒體被認為是細胞的動力工廠。線粒體另一個重要的功能是儲存細胞中的鈣離子，線粒體能夠迅速攝取鈣，并稍后釋放，線粒體的這種瞬時儲存鈣的功能有利于維持細胞內(nèi)的鈣穩(wěn)態(tài)[1]。細胞中游離鈣的濃度可調(diào)節(jié)一系列反應(yīng)，對細胞中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至關(guān)重要，由線粒體膜電位驅(qū)動的鈣釋放可以激活一系列第二信使，協(xié)調(diào)神經(jīng)細胞中的神經(jīng)遞質(zhì)釋放和內(nèi)分泌細胞中激素釋放的過程[2]。除此之外，線粒體還在其他一些細胞代謝中發(fā)揮重要作用，例如：線粒體活性氧介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞凋亡、激素信號傳導(dǎo)等。近年來，隨著線粒體抗病毒蛋白（mitochondrial antiviral-signaling protein, MAVS，又稱IPS-1, VISA,CARDIF）的發(fā)現(xiàn)[3-6]，越來越多的證據(jù)顯示線粒體在先天性免疫中發(fā)揮重要的作用，本文就線粒體如何參與抗病毒先天性免疫進行了綜述。

1 線粒體動力學(xué)和抗病毒免疫

病毒感染細胞時，先天免疫系統(tǒng)通過幾種類型的模式識別受體（pattern recognition receptor，PRR）快速識別病毒，這些識別病毒的PRR主要包括Toll樣受體（Toll-like receptors，TLR）和RIG-I（retinoic acid-inducible gene I）樣受體（RIG-I like receptors，RLR）。TLRs（例如TLR7和TLR3）位于細胞膜或細胞內(nèi)體的膜上，識別病毒的病原相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMP）后招募接頭蛋白（例如MyD88和TRIF），導(dǎo)致下游信號通路的激活，產(chǎn)生I型干擾素（IFNs）和趨化因子[7]。RLR（例如RIG-I和MDA5）是細胞質(zhì)中識別病毒的模式識別受體[8-9]。這些胞質(zhì)解旋酶含有兩個N端串聯(lián)的半胱天冬酶招募結(jié)構(gòu)域（caspase recruitment domain，CARD）[8,10]，RLR識別病毒后會發(fā)生構(gòu)象變化導(dǎo)致CARD域的暴露，與下游線粒體接頭蛋白MAVS的CARD結(jié)構(gòu)域產(chǎn)生互作，隨后激活下游的兩種細胞質(zhì)蛋白激酶復(fù)合物，一種包括“非經(jīng)典”IKK-相關(guān)激酶TBK1或IKK-i/ε和一系列接頭蛋白例如TANK、NAP1和NEMO。這種TBK1復(fù)合物負責(zé)激活轉(zhuǎn)錄因子IRF3的磷酸化和二聚化，IRF3轉(zhuǎn)位至細胞核中，誘導(dǎo)I型IFN基因的表達。另一種激酶復(fù)合物包括IKKα、IKKβ和NEMO，這種IKK復(fù)合物激活NF-κB，促進下游促炎性細胞因子的表達，參與先天性抗病毒反應(yīng)[5,8]。

用Poly（I: C）刺激MAVS缺陷小鼠無法引起IFN產(chǎn)量上升，RNA病毒感染MAVS缺陷小鼠后導(dǎo)致免疫反應(yīng)嚴重受損[11-12]，這些結(jié)果說明MAVS在抗病毒先天免疫中發(fā)揮關(guān)鍵作用。MAVS如何參與介導(dǎo)抗病毒先天免疫信號傳導(dǎo)的具體機制尚不清楚，但重要的是，MAVS必須定位于線粒體才能發(fā)揮其功能[5]，說明MAVS的信號傳導(dǎo)依賴于線粒體的狀態(tài)。與之相對應(yīng)的是，MFN1作為一種線粒體融合蛋白，能夠正調(diào)控MAVS介導(dǎo)的天然抗病毒反應(yīng)[13-15]。進一步研究結(jié)果顯示，MAVS能與MFN1發(fā)生相互作用，RLR激活后，MFN1-MAVS復(fù)合物調(diào)控線粒體上MAVS的重新分配以及線粒體的管網(wǎng)狀延伸[14-15]。盡管MAVS再分配的功能尚不明確，但線粒體的管網(wǎng)狀延伸能夠增強MAVS與STING的互作，促進細胞抗病毒反應(yīng)[14]。STING是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的抗病毒信號接頭蛋白，在DNA病毒誘導(dǎo)的先天性免疫中發(fā)揮重要作用[16]。與MFN1相反，其同源蛋白MFN2卻能夠抑制MAVS功能，這可能與線粒體動力學(xué)無關(guān)[17]?？梢姡M管MFN1和MFN2在線粒體融合方面具有相似的功能，但它們在抗病毒先天免疫方面似乎起著相反的作用[13]。MFN1和MFN2除了對線粒體融合的調(diào)控外，還能夠與各自的伴侶分子在線粒體外膜上進行同型和異型互作，以確保對MAVS介導(dǎo)信號傳導(dǎo)的精細調(diào)控。

MAVS介導(dǎo)的抗病毒信號傳導(dǎo)不僅受線粒體動力學(xué)的調(diào)控，同時，NLRX1[18]和gC1qR[19]兩種線粒體蛋白被證實通過抑制MAVS阻斷RIG-I和MDA5介導(dǎo)的抗病毒反應(yīng)。有趣的是，最近一項研究報道顯示線粒體膜電位（ΔΨm）也能調(diào)控RLR介導(dǎo)的先天性免疫通路[20]。用質(zhì)子載體CCCP處理或在MFN1和MFN2缺失的細胞中ΔΨm喪失，明顯阻斷了RLR介導(dǎo)的抗病毒先天免疫應(yīng)答，但對TLR3的激活沒有影響。ΔΨm在MAVS介導(dǎo)的信號傳遞中的具體作用還不明確，有報道認為ΔΨm的喪失可能會阻止MAVS復(fù)合體的重組，而MAVS復(fù)合體的重組能為病毒感染提供更迅速的反應(yīng)[20]。此外，ΔΨm的喪失還有可能阻止MAVS與STING的互作[14,16]。這些證據(jù)證明線粒體動力學(xué)和ΔΨm似乎都參與了MAVS介導(dǎo)的先天性免疫，但是將線粒體最重要的功能ATG合成抑制卻并不阻斷MAVS介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)，說明MAVS的功能不依賴于線粒體的能量供應(yīng)。

除了直接調(diào)控之外，線粒體還能夠通過活性氧（reactive oxygen species，ROS）間接調(diào)控先天免疫信號通路，例如NF-κB和JNK途徑，以及caspase 1炎性小體[21]。細胞內(nèi)活性氧的兩個主要來源是線粒體和膜相關(guān)的NADPH氧化酶（NOX）與雙重氧化酶（DUOX）復(fù)合物。NOX2和ROS對MAVS介導(dǎo)的抗病毒信號傳導(dǎo)至關(guān)重要。研究結(jié)果證實NOX2下調(diào)能降低MAVS的mRNA表達水平，而不影響其線粒體定位[22]。

2 線粒體作為先天免疫的平臺

MAVS作為RLR通路的樞紐接頭蛋白定位于線粒體外膜，且MAVS發(fā)揮功能依賴其線粒體定位，首次證實了線粒體在先天免疫信號通路中發(fā)揮重要作用。越來越多的證據(jù)證明許多宿主抗病毒免疫反應(yīng)都依賴于線粒體，許多參與細胞免疫反應(yīng)的分子均與線粒體關(guān)系密切，例如NLRP3、TLR等。

2.1 NLRP3 NLRP3是一種重要的NLR（NOD樣受體），在病原相關(guān)分子模式（PAMP）和損傷相關(guān)分子模式（damage associated molecular patterns，DAMP）誘導(dǎo)caspase 1炎性小體過程中發(fā)揮重要作用

[23]。NLRP3上游激活物的多樣性導(dǎo)致了NLRP3能識別由PAMP和DAMP觸發(fā)的信號，而不是直接識別單獨的分子（蛋白質(zhì)或核酸等）。這一點依然存在爭論，因為證據(jù)表明溶酶體損傷或者ROS可以直接作為NLRP3的激動劑。最初發(fā)現(xiàn)由NADPH復(fù)合體產(chǎn)生吞噬體相關(guān)ROS能激活NLRP3[24]。另有報道顯示，細胞中NADPH氧化酶依賴的ROS產(chǎn)生通路受阻能夠?qū)е翹LRP3通路激活[25]。有研究認為線粒體可能是激活NLRP3的ROS的主要來源，為這些相互矛盾的結(jié)果提供了可能的解釋[26]。他們發(fā)現(xiàn)魚藤酮和抗霉素這兩種藥物能夠阻斷線粒體呼吸鏈，導(dǎo)致線粒體ROS的生成，從而有效激活NLRP3。類似地，抑制自噬能導(dǎo)致產(chǎn)生ROS的缺陷線粒體積累，而該線粒體又能增強NLRP3依賴炎癥小體的激活。線粒體作為一種分子平臺，在NLRP3激動劑處理后能招募NLRP3中的幾個炎性小體成員，包括NLRP3本身和接頭蛋白ASC[26]。但是產(chǎn)生ROS的線粒體如何招募NLRP3炎性小體的機制目前仍然未知，對線粒體錨定相關(guān)復(fù)合物如何參與NLRP3炎癥小體形成還有待進一步研究。

2.2 TLRs 吞噬細胞吞噬細菌后導(dǎo)致多種先天免疫信號通路的激活并殺死微生物。ROS的產(chǎn)生是消滅微生物的一種最古老而有效的手段，它通過上調(diào)位于吞噬體表面的NADPH氧化酶復(fù)合物，從而實現(xiàn)與吞噬作用的功能互聯(lián)。TLR信號能增強NADPH氧化酶活性，而由該復(fù)合物產(chǎn)生的ROS能增強TLR介導(dǎo)的炎癥途徑[27]。最近一項研究表明線粒體也可能在吞噬相關(guān)的ROS生成和TLR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面起著關(guān)鍵作用。細胞表面TLRs包括TLR1、TLR2和TLR4的配體，能激活鼠巨噬細胞產(chǎn)生線粒體衍生的ROS，而內(nèi)體上的TLRs包括TLR3、TLR7、TLR8和TLR9的配體則不能激活鼠巨噬細胞產(chǎn)生ROS[28]。有趣的是，當(dāng)細胞吞噬了包被Pam3CSK4（TLR2配體）或LPS（TLR4配體）的乳膠微球后，細胞中線粒體聚集在含有乳膠微球的吞噬體附近，而當(dāng)乳膠微球包被CpG DNA（TLR9配體）時，則沒有觀察到類似的現(xiàn)象。由此可以推斷微生物的吞噬和TLR識別導(dǎo)致吞噬體周圍線粒體的聚集和局部ROS產(chǎn)生，這有助于消除被吞噬的微生物。進一步研究結(jié)果表明，TRAF6是TLR信號通路中至關(guān)重要的E3連接酶，在TLR1/2/4配體（而非TLR3/9配體）處理細胞后轉(zhuǎn)運至線粒體，而線粒體ECSIT蛋白被鑒定為TRAF6的泛素化靶標(biāo)蛋白，而該泛素化由TLR1/2/4配體特異性激活。線粒體中TRAF6-ECSIT通路的激活對線粒體在吞噬體附近的特異性定位以及線粒體ROS的誘導(dǎo)至關(guān)重要。這些研究顯示了線粒體ROS在吞噬微生物方面的重要性，TRAF6-ECSIT通路的例子說明線粒體在先天性免疫中發(fā)揮著樞紐作用[28]。

2.3 NLRX1 NLRX1是NLR家族成員中唯一一個具有N末端線粒體定位序列的蛋白，該區(qū)域被命名為字母“X”[18,29]。生化分析結(jié)果顯示NLRX1定位于線粒體基質(zhì)[30]。值得注意的是，NLRX1是目前已知的唯一的靶向線粒體的PRR家族成員，暗示了NLRX1可能是連接線粒體和先天免疫之間的重要“橋梁”。然而NLRX1的線粒體定位特征表明其似乎并不能直接識別微生物來源的分子標(biāo)記。因此，NLRX1的確切功能尚不明確。NLRX1的過表達能誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生[29]，可能原因是NLRX1與UQCRC2發(fā)生互作，而UQCRC2是線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅲ的重要組分，在ROS生成中具有關(guān)鍵作用[30]。有趣的是，NLRX1被證明也能與MAVS互作，抑制MAVS依賴性的抗病毒反應(yīng)[18]。但是，NLRX1具體如何與MAVS互作仍不清楚，因為這兩種蛋白質(zhì)定位于不同的由雙層膜隔離開的線粒體亞結(jié)構(gòu)域。有研究認為NLRX1進入線粒體依賴一定程度的內(nèi)膜ΔΨm[30]，ΔΨm的損耗將導(dǎo)致NLRX1在細胞質(zhì)中滯留，滯留在細胞質(zhì)中的NLRX1與MAVS互作并抑制其介導(dǎo)的信號通路，這一假設(shè)還有待進一步證實。首先需要確定病毒感染能否誘導(dǎo)NLRX1在胞質(zhì)中的滯留。另一種可能性是NLRX1通過產(chǎn)生ROS影響RLR信號傳導(dǎo)，而ROS已經(jīng)被證明能調(diào)控MAVS依賴的信號通路[22]。

2.4 IRGM IRGM是一種細胞中廣泛存在的人類鳥苷三磷酸酶，在先天免疫抵抗細胞內(nèi)病原方面發(fā)揮作用[31]。許多鼠源IRG基因由干擾素調(diào)節(jié)，而人源只存在兩種直系同源基因IRGM和IRGC。IRGM最初被認為是一個假基因，后來被發(fā)現(xiàn)在人類巨噬細胞清除結(jié)核分枝桿菌過程中發(fā)揮作用[32]。已經(jīng)證明IRGM在雷帕霉素、饑餓和IFNγ誘導(dǎo)的細胞自噬限制結(jié)核分枝桿菌方面至關(guān)重要[32]。IRGM介導(dǎo)自噬的機制尚不清楚，但最近來自Deretic團隊的一項研究顯示線粒體在這個過程中發(fā)揮重要作用。IRGM聚集于線粒體并調(diào)節(jié)線粒體分裂，這一機制在自噬泡調(diào)控細胞內(nèi)病原過程中發(fā)揮作用[33]。 IRGM對線粒體的定位取決于IRGM與心磷脂的相互作用，心磷脂是主要在線粒體內(nèi)膜中被發(fā)現(xiàn)的一種線粒體脂質(zhì)。另外，對IRGM mRNA剪接突變體的研究結(jié)果表明，IRGM異構(gòu)體的過表達能誘導(dǎo)線粒體分裂，線粒體去極化和自噬依賴細胞死亡，導(dǎo)致主要的促炎激動劑HMGB1的釋放[33]?？傊€粒體的動態(tài)調(diào)節(jié)似乎是決定IRGM在先天免疫中介導(dǎo)自噬（細胞存活）和凋亡或壞死（細胞死亡）這種雙重功能的重要因素。

3 線粒體DNA對先天性免疫的調(diào)節(jié)

有觀點認為，線粒體可能是從一種能與宿主細胞共生的古細菌進化而來，因此，線粒體DAMP（mDAMP）可以被認為是介于DAMP和PAMP之間的分子模式。線粒體作為細胞中特殊的細胞器，有自身的組成元件，如細胞色素c、甲酰肽和線粒體DNA（mtDNA）。在長期的進化過程中，細胞利用這些元件作為mDAMP來防止線粒體損傷。其中細胞色素c從線粒體內(nèi)膜釋放到細胞質(zhì)中后，能夠與APAF1相互作用，誘導(dǎo)caspase-9依賴的細胞凋亡[34]。

mtDNA是另一種重要的mDAMP，在細胞經(jīng)歷非正常死亡（例如病理學(xué)損傷）后釋放并激活一系列先天性免疫通路，最近有報道顯示線粒體中釋放的mtDNA能夠激活TLR9、NLRP3和STING等一系列先天性免疫信號通路[35-37]（圖1）。

在細胞損傷和應(yīng)激（例如陽離子載體）后，線粒體釋放的mtDNA能夠激活內(nèi)含體中的TLR9，導(dǎo)致促炎性細胞因子基因的轉(zhuǎn)錄和促炎細胞因子的釋放，包括MMP-8、TNF-α、IL-6和IL-1β[35,38]。此外，mtDNA在皰疹病毒感染后釋放至細胞質(zhì)中，隨后被cGAS-cGAMP-STING通路識別，導(dǎo)致TBK1-IRF3依賴的I型IFN通路激活并抑制病毒復(fù)制[37,39]。有趣的是，登革熱病毒作為一種RNA病毒，同樣能夠誘導(dǎo)mtDNA的釋放和cGAS-cGAMPSTING通路的激活，說明RNA病毒似乎也能間接激活DNA受體cGAS介導(dǎo)的信號通路[40]。但也有研究顯示，登革熱病毒的NS2B蛋白能夠靶向降解cGAS，抑制mtDNA介導(dǎo)的cGAS通路的激活[41]。因此，RNA病毒通過誘導(dǎo)mtDNA釋放激活cGAS通路還有待進一步研究證實。此外，ATP的刺激能夠誘導(dǎo)線粒體功能障礙，mtDNA釋放到細胞質(zhì)中結(jié)合并激活NLRP3炎癥小體，而NLRP3炎癥小體募集和激活caspase-1，可將IL-1β和IL-18前體切割成生物活性形式。另一方面，微管相關(guān)蛋白1輕鏈3B（LC3B）/ Beclin 1介導(dǎo)的細胞自噬參與了mtDNA的清除，從而負調(diào)控NLRP3炎性小體的活化[36,42]。

4 展望

越來越多的證據(jù)表明，線粒體除了在細胞代謝過程和細胞死亡中發(fā)揮重要作用，還是先天免疫信號激活的關(guān)鍵平臺。目前仍有很多問題尚待解決：為什么細胞中有眾多細胞器，唯獨線粒體與先天性免疫關(guān)系如此密切？其中一種解釋是線粒體上存在多種先天免疫途徑分子；另一個可能的原因為線粒體是細胞內(nèi)ROS的主要來源，在許多方面有助于宿主防御病原體。另外，為何是mtDNA，而不是基因組DNA能夠被宿主cGAS通路識別？cGAS通路如何分辨mtDNA和基因組DNA？目前針對病毒的防控主要停留在分子水平，通過對線粒體與抗病毒先天性免疫的研究，能夠為我們從細胞器水平進行病毒防控提供新策略。