個(gè)體化腫瘤疫苗用于黑色素瘤治療的研究進(jìn)展

秦嵐群，鄒征云

1.南京醫(yī)科大學(xué)鼓樓臨床醫(yī)學(xué)院腫瘤中心，江蘇 南京 210008；2.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院腫瘤中心，江蘇 南京 210008

1 概述

惡性黑色素瘤（malignant melanoma，MM）是惡性程度極高的實(shí)體腫瘤，易發(fā)生早期轉(zhuǎn)移，預(yù)后極差。近年來(lái)，MM的發(fā)病率直線上升并呈年輕化趨勢(shì)。據(jù)報(bào)道，全球每年新發(fā)病例數(shù)約20萬(wàn)例，而中國(guó)每年新發(fā)病例數(shù)達(dá)2萬(wàn)例［1］。晚期黑色素瘤的一線治療為靶向和免疫治療，在諸多治療方法中，以新抗原（neoantigen）為基礎(chǔ)的個(gè)體化腫瘤疫苗是一種前景廣闊的治療方法。目前在美國(guó)臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站上注冊(cè)的有關(guān)MM疫苗的研究就有300多項(xiàng)，有關(guān)新抗原與疫苗聯(lián)合的研究有39項(xiàng)，可見(jiàn)其火熱程度。

何為腫瘤疫苗？疫苗療法屬主動(dòng)免疫，將腫瘤抗原以多種形式導(dǎo)入患者體內(nèi)，激活患者自身免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生特異性的抗腫瘤免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)或擴(kuò)增體內(nèi)預(yù)存的針對(duì)靶抗原的細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)，并能形成長(zhǎng)期的免疫記憶反應(yīng)，從而達(dá)到控制或清除腫瘤的目的。

何為新抗原？2014年5月，Tran等［2］利用體外培養(yǎng)擴(kuò)增的、能特異性識(shí)別癌細(xì)胞基因突變產(chǎn)生的突變蛋白的淋巴細(xì)胞治療了1例ERBB2IP基因點(diǎn)突變的晚期膽管癌患者，使疾病獲得持久的緩解，明顯延長(zhǎng)了患者的生存期，這些突變蛋白即新抗原。自此提出新抗原的概念，即突變蛋白產(chǎn)生的或致瘤病毒整合進(jìn)基因組產(chǎn)生的抗原，屬于腫瘤特異性抗原范疇，因未經(jīng)胸腺陰性篩選，與T細(xì)胞受體（T cell receptor，TCR）親和力高，免疫原性強(qiáng)；相較于腫瘤相關(guān)抗原，不在正常組織中表達(dá)，因而不會(huì)引起中樞免疫耐受，也不會(huì)引起自身免疫性疾病，具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。

腫瘤細(xì)胞的突變?cè)诓煌[瘤中的頻率存在差異，在黑色素瘤組織中突變水平較高［3］，其腫瘤突變負(fù)荷（tumor mutation burden，TMB）＞10/1 Mb，且新一代測(cè)序技術(shù)（next-generation sequencing，NGS）的發(fā)展，能夠快速鑒定出腫瘤突變產(chǎn)生的新抗原表位，因而新抗原在黑色素瘤領(lǐng)域中具有廣闊的應(yīng)用前景。

2 個(gè)體化腫瘤疫苗

個(gè)體化疫苗可以有長(zhǎng)肽、RNA、DNA質(zhì)粒、病毒載體、工程減毒細(xì)菌載體及抗原負(fù)載樹(shù)突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）等形式［4］。通過(guò)誘發(fā)和增強(qiáng)體內(nèi)針對(duì)這類特異性抗原的免疫反應(yīng)，殺傷表達(dá)這類抗原的靶細(xì)胞，以DC疫苗、肽疫苗和RNA疫苗最為常見(jiàn)。

2.1 DC疫苗

DC是體內(nèi)抗原遞呈能力最強(qiáng)的專職抗原提呈細(xì)胞（antigen presenting cell，APC），其抗原提呈能力為其他細(xì)胞的數(shù)百倍，外源性抗原被DC攝取處理或內(nèi)源性抗原在細(xì)胞內(nèi)被加工處理后成為抗原表位肽，并裝載至主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）I或Ⅱ類分子，提呈于DC表面，可激活幼稚CD4+輔助T細(xì)胞和未接觸過(guò)抗原的CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）。

DC腫瘤疫苗根據(jù)其制備方式及效應(yīng)機(jī)制的不同，可大致分為3類：非靶向性DC疫苗、體內(nèi)靶向的DC疫苗、體外負(fù)載腫瘤抗原的DC疫苗。且大部分腫瘤抗原肽負(fù)載DC疫苗的臨床轉(zhuǎn)化研究是針對(duì)MM的。早在2005年，巴西ANVISA批準(zhǔn)異體DC腫瘤疫苗Hybricell用于晚期黑色素瘤的治療［5］。一項(xiàng)針對(duì)MM患者的Ⅲ期臨床試驗(yàn)表明，應(yīng)用DC腫瘤疫苗可顯著延長(zhǎng)患者的3年總生存率［6］。

2015年，在Science雜志上報(bào)道負(fù)載新抗原的DC疫苗在黑色素瘤中的研究：對(duì)3例存在腫瘤編碼的氨基酸替換的皮膚黑色素瘤患者，通過(guò)質(zhì)譜分析鑒定出分型為人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）-0201的新抗原表位，接種自體功能成熟的白細(xì)胞介素2（interleukin 2，IL2）-12p70生產(chǎn)的DC疫苗后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)新抗原DC疫苗增強(qiáng)了機(jī)體自發(fā)及新發(fā)的HLAI類分子限制性的抗腫瘤免疫反應(yīng)，增加了新抗原特異性T細(xì)胞的TCR的多樣性和克隆多樣性，從而增強(qiáng)抗腫瘤免疫［7］。

然而，DC疫苗作為單一療法抗腫瘤效果不甚理想，其療效不可避免地受腫瘤免疫抑制微環(huán)境的影響。為了改善DC疫苗的療效，一方面可通過(guò)紫外線照射、氧化處理及熱激處理等方式增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的免疫原性［8］；還有研究指出，靶向線粒體抗原［9］或細(xì)胞穿膜肽結(jié)合抗原的DC疫苗［10］能增強(qiáng)免疫治療效果；另外，還可將其與放療、化療、免疫檢查點(diǎn)抑制劑等聯(lián)合，以解除免疫抑制微環(huán)境，提高DC疫苗的抗腫瘤效應(yīng)。

2.2 肽疫苗

肽疫苗由于肽段短，便于合成，是目前研究的一大熱點(diǎn)。目前肽疫苗的應(yīng)用形式有單短肽疫苗、多短肽疫苗、長(zhǎng)肽疫苗、串聯(lián)多表位肽疫苗和個(gè)體化肽疫苗等［11］。個(gè)體化肽疫苗是指根據(jù)患者的遺傳基因結(jié)構(gòu)和功能差異，檢測(cè)患者的HLA分型及已經(jīng)存在的體液免疫反應(yīng)，從一系列候選多肽中選出至多4種多肽，制成疫苗，皮下注射于腫瘤患者。因?yàn)槭歉鶕?jù)患者自身的免疫學(xué)特征選取的疫苗，實(shí)現(xiàn)了個(gè)體化免疫治療的設(shè)想。

常規(guī)非個(gè)體化肽疫苗在黑色素瘤領(lǐng)域的研究并不多，治療效果也一般。I期臨床試驗(yàn)招募10例轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者，使用針對(duì)吲哚胺2，3-雙加氧酶（indoleamine 2,3-dioxygenase，IDO）的肽疫苗，且與PD1單抗聯(lián)合顯示，3例患者可檢測(cè)到疫苗特異性免疫應(yīng)答，5例患者評(píng)價(jià)為疾病穩(wěn)定［12］。

雖然總體而言，個(gè)體化肽疫苗療效優(yōu)于非個(gè)體化肽疫苗，但還是主要在去勢(shì)抵抗性前列腺癌中效果良好，在MM中未見(jiàn)部分緩解的病例［13-14］。直到2017年，Patrick等［15］從20例晚期MM患者中找到了97個(gè)新抗原，制備成個(gè)體化肽疫苗。在接受疫苗注射的6例患者中，4例患者在疫苗注射25個(gè)月后未復(fù)發(fā)；另外2例復(fù)發(fā)患者在接受PD-1單抗治療后，實(shí)現(xiàn)了腫瘤的完全緩解，并且在他們體內(nèi)檢測(cè)到了新抗原的特異性免疫細(xì)胞。

從目前統(tǒng)計(jì)結(jié)果看，個(gè)體化肽疫苗療效要優(yōu)于常規(guī)非個(gè)體化疫苗，但是，總體上個(gè)體化肽疫苗的臨床客觀反應(yīng)率仍較低。首先，腫瘤屏障及其微環(huán)境基質(zhì)成分限制了CTL在瘤內(nèi)的滲透；其次，部分腫瘤細(xì)胞MHCI類分子表達(dá)缺失，肽疫苗誘導(dǎo)的特異性CTL不能識(shí)別腫瘤細(xì)胞，從而限制了疫苗的療效。為解決這些問(wèn)題，可以將肽疫苗與放化療、PD-1單抗等聯(lián)用。放療除了直接引起腫瘤細(xì)胞死亡之外，還可以通過(guò)改變細(xì)胞表面表型、調(diào)節(jié)抗凋亡基因或免疫反應(yīng)性基因、調(diào)節(jié)抗原提呈系統(tǒng)和鈣網(wǎng)蛋白在腫瘤細(xì)胞上的轉(zhuǎn)位等機(jī)制引起腫瘤細(xì)胞的免疫原性修飾，從而對(duì)抗原特異性CTL的殺傷更加敏感［16］。還有研究顯示，肽疫苗聯(lián)合PD-1單抗可以增加肽特異性CTL在腫瘤組織內(nèi)的滲透，降低TIL表面抑制性分子的表達(dá)水平，從而提高肽疫苗的治療效果［17］。當(dāng)然，最重要的還是進(jìn)一步豐富和優(yōu)化肽庫(kù)，設(shè)計(jì)出分病種的肽疫苗庫(kù)，并增加HLA Ⅱ類分子結(jié)合的肽疫苗。來(lái)自德國(guó)古騰堡大學(xué)醫(yī)學(xué)中心在不同動(dòng)物模型上的研究揭示，MHC Ⅱ類分子限制性的RNA疫苗及多肽疫苗能有效地增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)，改善腫瘤微環(huán)境，控制腫瘤生長(zhǎng)和肺轉(zhuǎn)移［18］。

2.3 RNA疫苗

Nature雜志2017年同一天發(fā)布了兩項(xiàng)基于新抗原的個(gè)性化腫瘤疫苗治療MM的成功案例，其中一篇即上文所述Patrick等［15］有關(guān)新抗原肽疫苗的研究，另外一篇即來(lái)自德國(guó)的Sahin等［19］有關(guān)RNA疫苗的研究。他們利用新抗原所對(duì)應(yīng)的RNA制備腫瘤疫苗，治療了13例晚期MM患者。8例在治療前無(wú)影像學(xué)可測(cè)量病灶的患者在接受疫苗注射后顯示出強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答，并且在之后的12～23個(gè)月的隨訪中疾病無(wú)復(fù)發(fā)；另外5例在治療前就存在影像學(xué)可測(cè)量病灶的患者，在納入不久后就復(fù)發(fā)，并且在開(kāi)始接種新抗原疫苗時(shí)就出現(xiàn)了進(jìn)展性轉(zhuǎn)移，在復(fù)發(fā)的患者中，2例在接受疫苗注射后腫瘤明顯縮小，1例在接受抗PD-1單抗的聯(lián)合治療后，達(dá)到完全緩解［19］。

將RNA疫苗與納米技術(shù)結(jié)合也能收獲良好的治療效果。Kranz等［20］用脂質(zhì)體和編碼腫瘤抗原的RNA按特定比例制備納米顆粒，通過(guò)靜脈注射，納米顆?？梢园邢虻竭_(dá)脾臟和淋巴結(jié)的DC中，進(jìn)而使DC表達(dá)腫瘤相關(guān)抗原，此策略在小鼠腫瘤模型和3例黑色素瘤患者中顯示出顯著療效。

2.4 病毒載體疫苗

還有一種疫苗形式為病毒載體，目前最廣為人知的即溶瘤病毒，通常被定義為非致病性的病毒毒株（包括天然或經(jīng)人工基因改造的病毒株），能夠選擇性地感染并殺死腫瘤，而對(duì)正常組織和細(xì)胞無(wú)害［21］。T-VEC（talimogene laherparepvec）作為首個(gè)由美國(guó)美國(guó)食品藥品管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）及歐洲批準(zhǔn)上市用于治療黑色素瘤的溶瘤單純皰疹病毒，敲除了ICP34.5及ICP47，并在ICP34.5位點(diǎn)插入粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（granulocytemacrophage colony-stimulating factor，GM-CSF）基因，從而提高抗腫瘤免疫療效［22］。此外，除了T-VEC，也有少數(shù)病毒株在個(gè)案報(bào)道中顯示對(duì)黑色素瘤有顯著療效，如?？刹《局闑CHO-7（Rigvir）［23］。

當(dāng)然，單純使用溶瘤病毒效果并不理想，例如T-VEC在MM的Ⅲ期臨床試驗(yàn)中盡管縮小了腫瘤體積，但卻并未顯著改變總生存期（overall survival，OS），因此在目前階段溶瘤病毒療法只能作為輔助治療手段。并且，有關(guān)溶瘤病毒仍然有許多問(wèn)題需要解決，如何設(shè)計(jì)更好的病毒載體以克服宿主抗病毒免疫反應(yīng)？如何確保更好地實(shí)現(xiàn)全身給藥且不會(huì)增加風(fēng)險(xiǎn)？這需要更加深入的基礎(chǔ)研究和更大人群的臨床試驗(yàn)來(lái)探索得出。近兩年有研究顯示，T-VEC和MEK抑制劑曲馬替尼聯(lián)合使用可增加黑色素瘤細(xì)胞的體外死亡，還導(dǎo)致小鼠模型的腫瘤生長(zhǎng)延遲和存活率提高，此外這種治療效果還可以通過(guò)PD-1單抗進(jìn)一步改善［24］；還有研究回顧了10例接受T-VEC和免疫檢查點(diǎn)抑制劑聯(lián)合治療的不可切除的ⅢB或Ⅳ期黑色素瘤患者，90%的患者在注射部位出現(xiàn)應(yīng)答，60%的患者在注射部位達(dá)到完全緩解，有2例肺轉(zhuǎn)移的患者在非注射部位也達(dá)到完全緩解，顯示出聯(lián)合治療的協(xié)同作用［25］。這些臨床前及臨床的研究提示溶瘤病毒與化療、免疫檢查點(diǎn)抑制劑、靶向藥物等聯(lián)合不失為一種可行的嘗試。

3 展望

腫瘤免疫抑制微環(huán)境限制了疫苗的治療效果，而與放化療、靶向、免疫檢查點(diǎn)抑制劑等治療聯(lián)合，能發(fā)揮出更強(qiáng)的抗腫瘤效果。精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)時(shí)代的到來(lái)，為患者提供個(gè)體化的治療方案成為一大趨勢(shì)，腫瘤疫苗已經(jīng)成為一個(gè)發(fā)展迅速的研究領(lǐng)域。但是目前有關(guān)疫苗的研究仍處于起步階段，沒(méi)有多中心大樣本的臨床試驗(yàn)，且報(bào)道的疫苗的有效率參差不齊，遠(yuǎn)期并發(fā)癥未知，所以目前認(rèn)為，疫苗僅能作為一項(xiàng)輔助治療。但不可否認(rèn)的是，隨著新抗原概念的提出，腫瘤疫苗作為免疫治療的新方法，已經(jīng)引起各界的廣泛關(guān)注。相信在不久的將來(lái)，個(gè)體化腫瘤疫苗將成為黑色素瘤治療和臨床轉(zhuǎn)化的重要措施。