基于簇毛麥No.1026轉(zhuǎn)錄組的SSR序列分析及其PCR標(biāo)記開發(fā)

陳竟男，馬曉蘭，王振，李仕金，謝皓，葉興國，林志珊

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基于簇毛麥No.1026轉(zhuǎn)錄組的SSR序列分析及其PCR標(biāo)記開發(fā)

陳竟男1，2，馬曉蘭1，王振3，李仕金1，謝皓2，葉興國1，林志珊1

（1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所/農(nóng)作物基因資源與基因改良國家重大科學(xué)工程/農(nóng)業(yè)部麥類生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081；2北京農(nóng)學(xué)院植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206；3北方民族大學(xué)生物工程與科學(xué)學(xué)院，銀川 750021）

【目的】探究從前蘇聯(lián)引進(jìn)的簇毛麥No.1026（Dv#4）的EST-SSR序列特征及其在染色體的分布，分析它們在不同簇毛麥間及與小麥間的多態(tài)性，為其進(jìn)一步的研究與利用提供依據(jù)?！痉椒ā客ㄟ^Illumina HiSeq測序獲得No.1026植株的轉(zhuǎn)錄組序列，利用MISA軟件分析轉(zhuǎn)錄組SSR序列及特征，采用Primer 3設(shè)計(jì)SSR引物，隨機(jī)合成238對引物，對小麥中國春與簇毛麥Dv#4和引自英國劍橋的簇毛麥Dv#2的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，在瓊脂糖凝膠上分離評價(jià)擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性，并利用一套小麥-簇毛麥異染色體系進(jìn)行擴(kuò)增分析?！窘Y(jié)果】檢測了No.1026總長62.76 Mb的轉(zhuǎn)錄組序列，發(fā)現(xiàn)10 497個(gè)SSR位點(diǎn)，它們分布于8 735條Unigene上。在1—6個(gè)核苷酸的重復(fù)單元中，單、雙、三堿基的重復(fù)占95.85%，其中三核苷酸串聯(lián)重復(fù)數(shù)量最多，占SSR總數(shù)的50.33%，而CCG/CGG基序的重復(fù)占三核苷酸串聯(lián)重復(fù)的41.66%；單核苷酸重復(fù)是第二大類型，出現(xiàn)頻率為27.13%，其中A/T重復(fù)占單核苷酸重復(fù)的74.58%。二核苷酸重復(fù)類型的數(shù)量位列第三，占SSR總數(shù)的18.39%。在238對EST-SSR引物中，88對在中國春與簇毛麥（包括Dv#2和Dv#4）之間的擴(kuò)增產(chǎn)物顯示多態(tài)性；8對只在簇毛麥和單一異染色體系擴(kuò)增；4對可在簇毛麥和多個(gè)異染色體系中特異擴(kuò)增；但多數(shù)可在簇毛麥中清晰擴(kuò)增的引物不能在任何異染色體系中擴(kuò)增，推測可能與簇毛麥基因組及染色體導(dǎo)入小麥過程中的變異有關(guān)；47對（19.74%）在2份不同來源的簇毛麥Dv#2和Dv#4之間的擴(kuò)增產(chǎn)物呈現(xiàn)多態(tài)性。利用1對EST-SSR引物和1個(gè)EST-PCR標(biāo)記檢測48個(gè)簇毛麥植株，證明多態(tài)性的SSR引物可有效用于檢測簇毛麥的異質(zhì)性?！窘Y(jié)論】簇毛麥No.1026（Dv#4）的轉(zhuǎn)錄組中存在豐富的SSR序列，其中CCG/CGG、A/T和AG/CT等三核苷酸、單核苷酸和二核苷酸是其最主要的串聯(lián)重復(fù)基序。部分EST-SSR的側(cè)翼保守序列與單一或若干外源染色體特異相關(guān)聯(lián)，據(jù)此開發(fā)特異的分子標(biāo)記，可用于跟蹤檢測小麥背景中特異的簇毛麥染色體或染色體片段。Dv#4與Dv#2間的部分EST-SSR具有多態(tài)性，提示2份不同來源簇毛麥的表達(dá)序列間存在一定程度的遺傳差異，因此，簇毛麥Dv#4值得進(jìn)一步的發(fā)掘研究。

簇毛麥；轉(zhuǎn)錄組；EST-SSR；異染色體系；染色體定位；遺傳多樣性

0 引言

【研究意義】簇毛麥（(L.) P. Candargy, syn.Schur）是小麥的二倍體近源種屬（2n=2x=14，VV），為一年生異花授粉植物，主要分布于地中海的東北部和高加索地區(qū)[1]。由于簇毛麥表現(xiàn)出許多生物脅迫的抗性（如抗條銹、稈銹、白粉、梭條花葉病毒病、癭螨等多種小麥主要病蟲害）和非生物脅迫抗性（如耐寒、耐鹽、抗旱），同時(shí)擁有分蘗力強(qiáng)、生長繁茂、多小花、籽粒蛋白質(zhì)含量高等重要農(nóng)藝性狀[1-3]，因此，受到廣泛關(guān)注，并被認(rèn)為是小麥改良的潛在優(yōu)異基因源。【前人研究進(jìn)展】前人利用不同來源的簇毛麥開展了有益基因?qū)胄←湹难芯?，培育了硬粒小?簇毛麥雙二倍體[4-6]、普通小麥-簇毛麥異附加系、異代換系和易位系[6-10]，鑒定了位于6V#2S和6#4S上的白粉病抗性基因[7-10]，并克隆了主效抗病基因[11-12]。Zhang等[13]培育了抗小麥梭條花葉病毒病的T4VS.4DL易位系，將抗梭條花葉病毒病基因定位在4VS上。Zhao等[14]進(jìn)一步利用CSph1b誘導(dǎo)獲得4VS小片段易位，將定位在4VS染色體臂近端部FL為0.78—1.00區(qū)間。研究還表明，簇毛麥所特有的護(hù)穎穎脊剛毛的形態(tài)特征由2V染色體短臂上的基因所控制[15]，而1V、5V染色體分別攜帶高分子量麥谷蛋白亞基（HMW-GS）基因和籽粒軟質(zhì)基因。此外，5V還具有成株期的白粉病抗性，它們已被導(dǎo)入普通小麥，分別育成T1DL·1VS、T1DS·1VL和T5VS·5DL易位系[16-18]。Qi等[19]利用一套源于簇毛麥Dv#3，并由Lukaszewski培育的小麥-簇毛麥二體異附加系進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)DA6V#3對銹病小種Ug99表現(xiàn)出較好的抗性，開發(fā)了7對6V#3特異的EST–STS標(biāo)記用于從6D和6V#3染色體雙單體的F2群體中篩選易位系，并在F3世代獲得生長和育性正常的純合易位系T6AS.6V#3L和T6AL.6V#3S，隨之將抗銹病相關(guān)的基因定位于染色體長臂6V#3L，命名為。是一個(gè)溫敏型基因，其作用在16℃最有效，而28℃失效。【本研究切入點(diǎn)】上述研究所涉及的簇毛麥大多來源于Dv#2以及Dv#3，而從前蘇聯(lián)引進(jìn)的簇毛麥No.1026（Dv#4）除了6V#4染色體代換系及6V#4S.6DL易位系外，涉及其他染色體性狀的研究鮮見報(bào)道。而且，盡管先前的研究表明，6V#4與6V#2間在病蟲抗性[20]、染色體結(jié)構(gòu)[21]、基因序列[22-26]間均存在多態(tài)性，但不同來源的簇毛麥基因組間的多態(tài)性還缺少深入研究。據(jù)報(bào)道，SSR標(biāo)記的多態(tài)性明顯高于其他類型的分子標(biāo)記[27-28]，但傳統(tǒng)開發(fā)SSR標(biāo)記引物過程繁瑣，需要構(gòu)建文庫、篩選重復(fù)序列、測序等環(huán)節(jié)，成本高，時(shí)間長[29]。近年來，隨著測序技術(shù)的發(fā)展及成本的下降，利用EST或轉(zhuǎn)錄組序列開發(fā)SSR標(biāo)記變得更為簡便快速[30-31]。因此，EST-SSR標(biāo)記目前已被廣泛應(yīng)用于植物的遺傳連鎖圖譜構(gòu)建[32]、種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析[33-34]等研究。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究利用簇毛麥No.1026轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)分析表達(dá)序列中的SSR序列及特征；基于側(cè)翼保守區(qū)序列設(shè)計(jì)引物，分析EST-SSR序列在不同簇毛麥間的多態(tài)性；利用一套小麥-簇毛麥附加系或代換系對這些標(biāo)記進(jìn)行染色體定位；篩選在小麥中國春與簇毛麥間具有多態(tài)性的標(biāo)記，為No.1026的進(jìn)一步研究和利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

材料包括2份不同來源的簇毛麥：英國劍橋引進(jìn)的簇毛麥和前蘇聯(lián)引進(jìn)的簇毛麥No.1026，按照對不同來源簇毛麥的區(qū)分方法[35,10]，分別用Dv#2和Dv#4表示。2份簇毛麥的種子均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所陳孝研究員保存并提供，其中，源于英國劍橋的簇毛麥Dv#2原由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)陳佩度教授惠贈(zèng)；小麥-簇毛麥異附加系DA2V#2、DA3V#2、DA4V#2、DA5V#2、DA6V#2和DA7V#2由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)王秀娥教授惠贈(zèng)；江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所別同德博士提供了小麥-簇毛麥異代換系1V#2（1D）的DNA。為方便描述，本文將上述異附加系與異代換系統(tǒng)稱為異染色體系，用于EST-SSR的染色體定位分析。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所小麥抗逆分子育種課題組收集保存的小麥品種中國春為對照。

1.2 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)獲得及EST-SSR引物設(shè)計(jì)

轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來源于筆者所在實(shí)驗(yàn)室2016年對前蘇聯(lián)簇毛麥No.1026（Dv#4）進(jìn)行高通量測序的結(jié)果[25-26]：取溫室盆栽的植株成株期葉片，利用Trizol法提取RNA，委托北京諾禾致源生物信息科技有限公司完成cDNA文庫構(gòu)建和HiSeq測序。使用軟件MISA（27/09/2010）http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html進(jìn)行SSR分析：設(shè)定各個(gè)重復(fù)單元的最少重復(fù)次數(shù)分別為1—10、2—6、3—5、4—5、5—5和6—5，即：以單核苷酸為重復(fù)單元時(shí)，其重復(fù)數(shù)至少為10次才可被檢測到；以雙核苷酸為重復(fù)單元時(shí)，其最少重復(fù)數(shù)為6次；以三、四、五、六核苷酸為重復(fù)單元的重復(fù)次數(shù)均需達(dá)到5次以上。找出SSR序列之后，采用Primer3進(jìn)行SSR引物設(shè)計(jì)。

1.3 DNA提取及其引物擴(kuò)增條件

采用DNA提取試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）按說明書提取每份材料新鮮葉片的基因組DNA，并稀釋成100 ng·μL-1，4℃保存?zhèn)溆谩?38對隨機(jī)選取的EST-SSR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。先用中國春、DV#2、DV#4的DNA進(jìn)行引物初篩選；對小麥與簇毛麥擴(kuò)增產(chǎn)物間具有多態(tài)性的引物進(jìn)一步用一套DV#2異附加系進(jìn)行擴(kuò)增，分析RST-SSR位點(diǎn)的染色體分布。PCR擴(kuò)增體系為MIX 7.5 μL、上下游引物各0.5 μL、模板1 μL和dd H2O 5.5 μL，混合均勻后置于PCR儀（T100-Thermal Cycler, BIO-RAD）中擴(kuò)增。擴(kuò)增程序?yàn)?5℃5 min；94℃30 s，54—60℃30 s（退火溫度因不同引物而異），72℃1 min，34個(gè)循環(huán)；72℃8 min，4℃保存。

2 結(jié)果

2.1 源于簇毛麥Dv#4轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的SSR序列構(gòu)成特性分析

在總長62.76 Mb的轉(zhuǎn)錄組47 384條序列中，共檢測到10 497個(gè)SSR位點(diǎn)，平均每5.98 kb有1個(gè)位點(diǎn)，它們分布于8 735條Unigene上。其中含有1個(gè)以上SSR位點(diǎn)的Unigene有1 442條。SSR有單一型和混合型2種類型，單一型重復(fù)基序的SSR位點(diǎn)數(shù)9 979個(gè)，混合型重復(fù)基序的位點(diǎn)數(shù)為518個(gè)。SSR包括單堿基重復(fù)2 848個(gè)、雙堿基重復(fù)1 930個(gè)、三堿基重復(fù)5 283個(gè)、四堿基重復(fù)394個(gè)、五堿基重復(fù)36個(gè)和六堿基重復(fù)6個(gè)（表1）?？梢姡?—3個(gè)堿基重復(fù)是No.1026轉(zhuǎn)錄序列中主要的SSR重復(fù)類型，而三核苷酸串聯(lián)重復(fù)數(shù)量最多，占SSR總數(shù)的50.33%，其構(gòu)成基序主要有CCG/CGG、AGG/CCT、AGC/CTG、ACC/GGT、AAG/CTT、ACG/CGT等10種，其中CCG/CGG基序占三核苷酸串聯(lián)重復(fù)的41.66%。單核苷酸重復(fù)類型排列第二位，其出現(xiàn)頻率為27.13%，其中A/T重復(fù)明顯多于G/C重復(fù)，占單核苷酸重復(fù)的74.58%。二核苷酸重復(fù)類型排列第三位，其出現(xiàn)頻率為18.39%，以AG為主的重復(fù)基序占二核苷酸重復(fù)類型的54.61%，而且在擬南芥EST-SSR中極為罕見的GC基序在No.1026中擁有二核苷酸重復(fù)的8.13%。4—6核苷酸的重復(fù)基序僅為SSR總數(shù)的4.15%。

表1 Dv#4的EST-SSR構(gòu)成

2.2 SSR引物在小麥與簇毛麥間擴(kuò)增的多態(tài)性及在簇毛麥染色體的分布

隨機(jī)合成238對引物，對包括單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸4種主要重復(fù)單元的SSR位點(diǎn)進(jìn)行引物有效性驗(yàn)證，對CS、簇毛麥Dv#2和Dv#4進(jìn)行擴(kuò)增分析。結(jié)果顯示，88對引物在CS與簇毛麥之間具有擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性。圖1顯示了部分引物的擴(kuò)增結(jié)果。圖中可見，多態(tài)性類型分為2種：類型1在簇毛麥中清晰擴(kuò)增的引物在小麥中沒有明顯的擴(kuò)增帶，如圖1中的5、6、8、24、44、51、54和65，表現(xiàn)為有、無的多態(tài)性；類型2則表現(xiàn)為在簇毛麥與小麥間擴(kuò)增產(chǎn)物的長度多態(tài)性。將這些與小麥具有多態(tài)性的引物進(jìn)一步對1V#2（1D）異代換系以及DA2V#2-7V#2異附加系進(jìn)行擴(kuò)增，8對引物只在簇毛麥和單一異染色體系中擴(kuò)增出相同的目的條帶（圖2），表明這些引物位于簇毛麥單一染色體上，可作為這些染色體特異的EST-SSR標(biāo)記。

本研究對每一個(gè)SSR位點(diǎn)都分別設(shè)計(jì)了3組引物，8584.0的3組引物p1、p2和p3都可在簇毛麥和4V異附加系擴(kuò)增出特異帶（圖2），說明該SSR位點(diǎn)確實(shí)位于4V染色體上。引物3155.0p3和13764.0p1可在簇毛麥和二體異附加系DA2V#2特異擴(kuò)增，而引物18808F3可在簇毛麥和二體異附加系DA5V#2特異擴(kuò)增。引物1211F2和12613.0F3除了在簇毛麥擴(kuò)增外，還分別在二體異附加系3V和6V擴(kuò)增。此外，有4對引物可同時(shí)在簇毛麥和多個(gè)異染色體系中特異擴(kuò)增（圖3），表明這些SSR位點(diǎn)分布在簇毛麥多條染色體上。其中，引物18131.3751可在簇毛麥DV#2不同的異染色體系上擴(kuò)增出分子量大小明顯不同的產(chǎn)物。

M：Marker 2000的部分區(qū)段，條帶對應(yīng)于100、250和500 bp；1—65表示65對不同引物，其擴(kuò)增產(chǎn)物顯示小麥與簇毛麥或簇毛麥間的多態(tài)性M: Parts of Marker 2000, the bands are corresponding to 100 bp, 250 bp and 500 bp in size, respectively. 1-65 indicate 65 pairs of EST-SSR primers, the amplified products showing the PCR polymorphic fragments between wheat and D. villosum or betweentwo D. villosum accessions

2.3 特異SSR擴(kuò)增產(chǎn)物在不同簇毛麥間的多態(tài)性

在238對SSR引物中，有47對引物（19.74%）在Dv#2和Dv#4之間顯示出多態(tài)性。從圖1可以看出，部分引物如2、3、4、32和44在Dv#4中具有預(yù)期擴(kuò)增條帶，而在Dv#2則沒有明顯的擴(kuò)增帶。而引物11、14、15、31、42、45、61、63、64及65則在2份簇毛麥間顯示擴(kuò)增片段長度多態(tài)性。由于這些SSR引物來自簇毛麥的轉(zhuǎn)錄組，說明這兩份不同來源簇毛麥的表達(dá)序列存在著差異。

2.4 新開發(fā)分子標(biāo)記對簇毛麥異質(zhì)性的鑒定

曾經(jīng)將簇毛麥Dv#2與簇毛麥Dv#4近距離種植，用開發(fā)的EST-SSR引物225（225F：5’-ACCAGTTGTT AAGGTGGGCC-3’，225R：5’-ACCGTTGTTACGCCG TACAA-3’）和1個(gè)定位于6VS（6V-12[26]）的EST-PCR標(biāo)記檢測從簇毛麥Dv#2衍生的部分后代植株。6V-12可在原始的2個(gè)簇毛麥Dv#2和Dv#4擴(kuò)增出多態(tài)性片段，對48個(gè)簇毛麥Dv#2衍生的植株無一例外都穩(wěn)定擴(kuò)增出來自6V#2S的特異帶，沒有6V#4S的特異帶。但EST-SSR引物225則擴(kuò)增出3種類型，不同植株在該SSR位點(diǎn)顯示了分離（圖4）。說明2份近距離種植的簇毛麥間可能曾經(jīng)發(fā)生過天然的異交，也表明了SSR引物可有效用于簇毛麥異質(zhì)性的鑒定。

3 討論

3.1 EST-SSR序列在簇毛麥基因組的構(gòu)成及其染色體的分布

本研究對來自前蘇聯(lián)簇毛麥No.1026轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析結(jié)果表明，No.1026的表達(dá)序列中存在豐富的SSR序列。根據(jù)對擬南芥的研究[36-37]，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄區(qū)的SSR分布呈現(xiàn)從5’端到3’端遞減的特性，5’UTR的SSR分布頻率顯著高于其他轉(zhuǎn)錄區(qū)，且以二核苷酸AG和三核苷酸AAG重復(fù)為主，二核苷酸GC重復(fù)基序極其罕見。而基因編碼區(qū)的SSR序列中，92.6%為三核苷酸及六核苷酸的串聯(lián)重復(fù)序列，認(rèn)為可能與三聯(lián)體密碼子所受的選擇壓有關(guān)。三核苷酸重復(fù)基序又以AAG的頻率最高，CCG的基序最少。本研究的結(jié)果明顯不同于擬南芥，整體上，簇毛麥No.1026轉(zhuǎn)錄組中三核苷酸的串聯(lián)重復(fù)序列占SSR總數(shù)的50.33%。這與前人對水稻、小麥、大豆、玉米等作物[38]以及杉木[39]的研究結(jié)果相類似。而且，CCG/CGG是三核苷酸重復(fù)的主要基序，其出現(xiàn)頻率占三核苷酸重復(fù)的41.66%，這一結(jié)果與水稻很相似。根據(jù)Gao等[38]的研究，水稻的EST中，平均每100 kb就有23.6個(gè)CCG基序的SSR重復(fù)，而小麥、玉米和大豆分別為10.3、3.5和0.9。Gao等[38]認(rèn)為許多三核苷酸可能與重要的基因功能相關(guān)，如CCG重復(fù)可能涉及脅迫抗性、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、代謝酶的合成、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等基因功能。另外，單核苷酸作為簇毛麥轉(zhuǎn)錄組SSR的第二大主要的串聯(lián)重復(fù)單元，A/T出現(xiàn)的頻率遠(yuǎn)高于C/G，這一特征與小麥、水稻、玉米、大豆及擬南芥都是相同的[38,36]。

M：Marker 2000，左側(cè)為引物名稱，右側(cè)箭頭顯示引物擴(kuò)增的特異條帶及片段大小。下同

圖3 4對引物對1V—7V異染色體系和Dv#4的擴(kuò)增圖譜

M：Marker 5000；1—16：曾經(jīng)與簇毛麥Dv#4近距離種植的Dv#2衍生的部分植株，簇毛麥Dv#2和Dv#4為原始親本

基于SSR開發(fā)的PCR標(biāo)記具有操作簡易的特點(diǎn)，尤其是，來自轉(zhuǎn)錄組的SSR直接與功能基因的表達(dá)相關(guān)，鑒定SSR位點(diǎn)與特定染色體的相關(guān)性，開發(fā)外源染色體特異的SSR分子標(biāo)記，對于充分利用轉(zhuǎn)錄組的SSR序列資源，輔助篩選和鑒定向小麥基因組轉(zhuǎn)移的簇毛麥染色體及其性狀具有十分重要的意義。No.1026迄今還沒有整套的附加或代換系，所以，本研究借助了來自英國劍橋的簇毛麥Dv#2的一套異染色體系（附加或代換系）對No.1026的SSR在染色體上的分布進(jìn)行了調(diào)查。雖然結(jié)果不能完全代表No.1026，但依然具有一定的參考價(jià)值，因?yàn)樽鳛榛虻囊徊糠?，轉(zhuǎn)錄序列在種間相對保守，而且本研究選擇用于染色體定位的引物都可在2份簇毛麥Dv#2和Dv#4中擴(kuò)增出大小相似清晰的特異片段。

隨機(jī)合成的238對引物擴(kuò)增結(jié)果顯示：簇毛麥基因組中SSR可能位于單條染色體，也可能分布于多條染色體。但是本研究有許多在簇毛麥可清晰擴(kuò)增出目的條帶的引物在任何一個(gè)異染色體系上都無擴(kuò)增，這可能是由于：源于Dv#2的附加系中，外源染色體并沒有完全保持簇毛麥原始親本中染色體的完整性。因?yàn)閺拇孛湹礁郊酉档呐嘤^程中，經(jīng)歷過異源多倍體化（如硬-簇雙二倍體的合成）及多次的回交和自交，在異源多倍體化過程中，基因組的重新整合可能出現(xiàn)基因的缺失、刪除或突變[40]。事實(shí)上，SSR引物是基于SSR序列側(cè)翼的保守序列設(shè)計(jì)的，這些保守序列的缺失或變異都可能造成擴(kuò)增的失敗。另外，這些來自轉(zhuǎn)錄組的SSR引物在基因組擴(kuò)增時(shí)，可能由于內(nèi)含子或其他插入序列的存在而比預(yù)期片段大。

3.2 不同簇毛麥間的遺傳多樣性

簇毛麥攜帶許多改良小麥潛在的優(yōu)良性狀，但對不同來源簇毛麥的遺傳多樣性的研究迄今為止多局限于6V，如研究表明，6V#2和6V#4染色體都攜帶白粉病抗性基因，而6V#1和6V#3的異染色體系則對白粉菌敏感。此外，不同來源的6VS對癭螨及其所傳播的病毒抗性也存在差異[20]。最近的研究中，至少有10個(gè)分子標(biāo)記顯示出6V#2和6V#4間的多態(tài)性[22-26]。然而，涉及其他染色體的此類研究還很缺乏。另外，除了白粉病抗性，簇毛麥中控制重要農(nóng)藝性狀的很多基因尚未鑒定和利用。本研究利用來自轉(zhuǎn)錄組的SSR序列，對2份不同簇毛麥進(jìn)行擴(kuò)增分析，揭示了它們之間存在豐富的多態(tài)性。而且，本研究是基于瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)區(qū)分樣品的多態(tài)性的，其分辨率較低，一些原本存在的差異不足以在瓊脂糖凝膠上區(qū)分。所以，推測實(shí)際上簇毛麥間的多態(tài)性可能更高。而遺傳多樣性是研究與利用種質(zhì)資源的基礎(chǔ)。因此，將不同來源簇毛麥導(dǎo)入普通小麥，培育附加、代換或易位系，對其有益基因的發(fā)掘、鑒定及在小麥改良中的利用具有重要的意義，而基于基因序列的差異開發(fā)的EST-SSR標(biāo)記在上述過程中也可作為重要的輔助選擇的工具。

4 結(jié)論

簇毛麥No.1026（Dv#4）的轉(zhuǎn)錄組存在大量的SSR序列，其中CCG/CGG、A/T和AG/CT等三核苷酸、單核苷酸和二核苷酸是其最主要的串聯(lián)重復(fù)基序。部分EST-SSR側(cè)翼保守序列與單一或多條外源染色體相關(guān)聯(lián)，據(jù)此開發(fā)特異的分子標(biāo)記，可用于跟蹤檢測小麥背景中特異的簇毛麥染色體或染色體片段。簇毛麥Dv#4與Dv#2間的部分EST-SSR具有多態(tài)性，提示2份不同來源的簇毛麥其表達(dá)序列間存在一定程度的遺傳差異，因此，Dv#4值得進(jìn)一步的發(fā)掘研究。

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SSR sequences and development of PCR markers based on transcriptomeNo.1026

CHEN JingNan1,2, Ma XiaoLan1, WANG Zhen3, LI ShiJin1, Xie Hao2, YE XingGuo1, LIN ZhiShan1

(1Institute of Crop Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences/National Key Facility of Crop Gene Resources and Genetic Improvement/Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Triticeae Crops, Ministry of Agriculture, Beijing 100081;2School of Plant Science and Technology, Beijing university of agriculture, Beijing 102206;3College of bioscience & bioengineering, North Minzu university, Yinchuan 750021)

【Objective】The aim of this study is to explore the characteristics of the EST-SSR sequences of aaccession No.1026 (Dv#4) introduced from the former Soviet Union, and their distributions on chromosomes and polymorphism in differentaccessions and between Dv#4 and common wheat. 【Method】Transcriptome sequences of Dv#4 plants were obtained by Illumina HiSeq sequencing and used to search and analyze the SSR sequences using MISA software and design primers by Primer 3. In total, 238 pairs of primers were selected randomly for synthesis and used to amplify the genomic DNAs of wheat Chinese Spring (CS) and the two differentaccessions. The polymorphisms of the PCR products on agarose gel were evaluated. Further, the features of their chromosome distributions in Dv#4 were studied by using a set of wheat-alien chromosome lines (including disomic addition lines and disomic substitution lines). 【Result】 A total sequence length of 62.76 Mb was detected and 10 497 SSR loci were found in the transcriptome data. They are involved in 8 735 unigenes. Repeated unit of mono-, di-, tri- nucleotides are the main type, holding 95.85% of all loci among 1-6 nucleotides repeats, among which tri-nucleotide is the richest component that makes up of 50.33% and contains CCG/CGG motif by 41.66%. The next component is mono-nucleotide tandem repeat, and its occurrence frequency is 18.39%, and A/T repeats occupy 74.58% in this type. Di-nucleotide ranks the 3rd, and it holds 18.39% in the total SSR loci. Among 238 pairs of randomly synthetized EST-SSR primers, 88 pairs amplified polymorphic fragments between CS and(including Dv#2 and Dv#4); 8 pairs only had amplifications inand some single alien chromosome lines; 4 pairs could specifically amplify bands inand multiple alien chromosome lines. But, many primers which had amplification in bothaccessions had no amplification in any alien chromosome lines. Therefore, it can be inferred that variations on the flanking conserved sequences of SSR might occur during the transferring of the exogenous genome or chromosomes into wheat. Additionally, 47 pairs of primers (19.74%) showed polymorphisms between Dv#2 and Dv#4. By using a pair of EST-SSR primer and a PCR marker, respectively, polymorphic amplicons were detected in 48plants, indicating that polymorphic SSR primer can be used to detect the heterogeneity ofeffectively.【Conclusion】Dv#4 has abundant SSR sequences in its transcriptome, of which, CCG/CGG, A/T, AG/CT and other tri-, mono-, and di-nucleotide are the main tandem repeats.The flanking conserved sequences of partial EST-SSR in Dv#4 are associated with a single or several chromosomes specifically, which provides an ideal sequence resource for the development of specific molecular markers to track and detectchromosomes or chromosome fragments in wheat background. Some of the EST-SSR polymorphism between Dv#4 and Dv#2 indicates that there is a certain degree of genetic diversity in some of the expressed sequences between the two different originaccessions. Therefore, Dv#4 is valuable to be further investigated.

; transcriptome; EST-SSR; alien chromosome lines; chromosome localization; genetic diversity

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.01.001

2018-07-01；

2018-09-19

國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2016YFD0102002，2016YFD0102001）、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程（2060302-2-17年）

陳竟男，E-mail：1293498949@qq.com。 通信作者謝皓，E-mail：xiehao126@126.com。通信作者林志珊，E-mail：linzhishan@caas.cn

（責(zé)任編輯 李莉）