超高效液相-三重四級桿質(zhì)譜法測定健脾丸中展青霉素的含量

劉東升　劉婷婷　蘇蕊　徐繼軍　姚世霞　朱旭江

[摘要]目的 建立超高效液相-三重四級桿質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）測定健脾丸中展青霉素的含量。方法 樣品經(jīng)果膠酶酶解后，用乙酸乙酯提取展青霉素，提取液經(jīng)HLB固相萃取小柱凈化后，采用UPLC-MS/MS進(jìn)行測定。結(jié)果 展青霉素在0.020～2.010 μg/ml內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為Y=666 825X+27 524（r=0.9970），檢出限（LOD）為0.0101 μg/ml，定量限（LOQ）為0.0201 μg/ml。結(jié)論 本法靈敏、快速、準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)，可用于健脾丸中展青霉素的測定。

[關(guān)鍵詞]健脾丸;展青霉素;超高效液相-三重四級桿質(zhì)譜法

[中圖分類號] R917 ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A ? ? [文章編號] 1674-4721（2019）11（c）-0031-04

Determination of patulin in Jianpi Pills by ultra high performance liquid chromatography-tandem triple quadruple mass spectrometry

LIU Dong-sheng? ?LIU Ting-ting? ?SU Rui? ?XU Ji-jun? ?YAO Shi-xia? ?ZHU Xu-jiang

Gansu Institute for Drug Control， Lanzhou? ?730070， China

[Abstract] Objective To establish an ultra high performance liquid chromatography-tandem triple quadruple mass spectrometry （UPLC-MS/MS） method for the content determination of patulin in Jianpi Pills. Methods After being enzyme-hydrolyzed by pectinase， extracted by water， and purified by HLB solid-phase extraction column， patulin were analyzed by UPLC-MS/MS. Results The calibration curves of the patulin showed good linearities in the range of 0.020-2.010 μg/ml with the regression equation Y=666 825X+27 524 （r=0.9970）. The limit of detection （LOD） was 0.101 μg/ml， and the limit of quantification （LOQ） was 0.0201 μg/ml. Conclusion The method is sensitive， rapid， accurate and specific enough to determine patulin in Jianpi Pills.

[Key words] Jianpi Pills; Patulin; Ultra high performance liquid chromatography-tandem triple quadruple mass spectrometry

展青霉素（patulin），屬多聚乙酰內(nèi)酯，可以造成人體神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)和泌尿系統(tǒng)的嚴(yán)重?fù)p害，并具有一定的致癌性[1-3]。正是由于展青霉素對人體的嚴(yán)重危害性，許多國家都對食品中的展青霉素的含量進(jìn)行限定。WHO規(guī)定蘋果汁中展青霉素的量最高為50 μg/kg[4];我國也對蘋果及其山楂為原料制成品中展青霉素的量進(jìn)行了同樣的限定。研究相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)對于展青霉素在山楂等酸性果實及其食品制成品中檢驗檢測方法的報道最為常見[5-13]。但是含酸性果實類中藥以及中成藥中展青霉素的檢驗檢測方法的報道較少，且多為中藥材[14-18]。由于健脾丸為原粉入藥，所以筆者對處方中的山楂可能存在展青霉素污染的風(fēng)險進(jìn)行研究。并且針對中成藥基質(zhì)干擾以及樣品特點，結(jié)合前人的研究，建立了超高效液相-三重四級桿質(zhì)譜法（ultra high performance liquid chromatography-tandem triple quadruple mass spectrometry，UPLC-MS/MS）測定健脾丸中的展青霉素的含量。并采用Oasis HLB固相萃取柱對樣品進(jìn)行凈化處理，旨在為研究含山楂類的中成藥中展青霉素提供一定的參考依據(jù)。

1儀器與試藥

1.1儀器設(shè)備

LCMS-8045 UPLC-MS/MS聯(lián)用儀（島津）;METTLER TOLEDO ME204和MS205DU型分析天平（梅特勒-托利多公司）;KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;XK80-A快速混勻器（江蘇新康醫(yī)療器械有限公司）;SHY-2A多功能水浴恒溫振蕩器（金壇市大地自動化儀器廠）;5430R離心機(jī)（艾本德）;微孔濾膜（希波士）;HGC-24A氮氣吹干儀（天津市很高科技發(fā)展有限公司）。10 μl Eppendorf加樣槍和100 μl Eppendorf加樣槍（艾本德）。

1.2試藥

展青霉素標(biāo)準(zhǔn)品（TRC公司，批號：4-YMK-42-4）、果膠酶（麥克林公司，批號：C100083945）;Oasis HLB柱（美國Waters公司，3 ml/60 mg）;甲醇、乙腈、乙酸乙酯、冰乙酸均為色譜純;水為純凈水;其他試劑為分析純。

1.3樣品

健脾丸（2018年國抽），批號詳見下文表3。

2方法與結(jié)果

2.1液相色譜條件

色譜柱：CAPCELL CORE C18（2.1×150 mm，2.7 μm）;流速0.3 ml/min;流動相A為乙腈，B為水;柱溫：35℃;進(jìn)樣量：5 μl;洗脫方式：梯度洗脫，A相初始濃度為5%;時間程序：0～6 min，5%～10%;6～8 min，10%～90%;8～10 min，90%～5%（10 min時流動相A回到初始濃度5%）。

2.2質(zhì)譜條件

采用質(zhì)譜檢測器，離子源：電噴霧離子源（electronic spray ionization，ESI），負(fù)離子掃描，采用多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）;干燥氣溫度350℃;干燥氣流速10 L/min;霧化氣壓力30 psi;源電壓4000 V;保留時間：4.25 min，母離子152.8 m/z，子離子108.4 m/z，裂解電壓20.0 eV;子離子81.1 m/z，裂解電壓20.0 eV。

2.3溶液的制備

2.3.1對照溶液制備? 取展青霉素對照品適量，精密稱定（10.05 mg）于10 ml的棕色量瓶中，加乙酸乙酯溶解并定容至刻度（含展青霉素1 mg/ml），即得，將上述儲備液避光保存在-20℃冰柜中。使用前精密移取適量的上述標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液于棕色量瓶中，在溶劑充分揮干后換用0.2%乙酸制成含50 μg/ml展青霉素中間溶液，同樣避光并保存于4℃冰柜中。使用時，以實驗中的空白基質(zhì)溶液作為溶劑將中間溶液稀釋成為相應(yīng)的對照品溶液（對照溶液應(yīng)臨用新制）。

2.3.2供試品溶液制備? 取本品9丸（約45 g）精確稱定，剪碎，置于250 ml錐形瓶中，加入80 ml水，振搖，離心，取上清液，低溫減壓濃縮至20 ml，加入果膠酶溶液200 μl，于40℃恒溫水浴箱中避光2 h進(jìn)行酶解。在酶解后的溶液中加入乙酸乙酯20 ml，渦旋20 min后，離心3 min（6000 r/min），分層。將下層液用乙酸乙酯分兩次提取，每次20 ml，最后收集兩次的乙酸乙酯提取液，40℃揮發(fā)干溶劑后，用1%乙酸溶液溶解，轉(zhuǎn)移至5 ml棕色容量瓶中并定容，然后將上述樣品溶液全部轉(zhuǎn)移于活化過的HLB柱內(nèi)（Oasis HLB柱用6 ml色譜甲醇和6 ml水活化使之以3 ml/min的速度流過HLB柱），然后用乙酸乙酯進(jìn)行洗脫，將洗脫液收集并回收溶劑，最后用0.2%乙酸溶液溶解殘渣于2 ml的棕色量瓶中并定容至刻線。

2.3.3陰性樣品溶液制備? 取健脾丸陰性樣品（按處方及工藝，制備不含山楂的健脾丸陰性樣品）9丸（約45 g）精確稱定，按供試品溶液的制備方法制備，離子色譜圖見圖1。

2.4方法學(xué)考察

2.4.1線性關(guān)系? 取上述儲備溶液加空白基質(zhì)溶液分別制的含0.020、0.201、0.603、1.005、2.010 μg/ml展青霉素的系列對照品溶液，按2.1和2.2項下條件，注入液相色譜儀，測得峰面積。測定峰面積積分值，以展青霉素對照品溶液的濃度（μg/ml）為縱坐標(biāo)（X），峰面積積分值為橫坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到近過原點的一條直線。計算回歸方程：Y=666 825X+27 524（r=0.9970）。結(jié)果表明，展青霉素對照品在0.020～2.010 μg/ml濃度內(nèi)有良好的線性關(guān)系，具體見表1。

2.4.2檢出限（LOD）和定量限（LOQ）? 取2.4.1項下不同濃度的展青霉素對照品溶液，精密吸取5 μl注入液質(zhì)聯(lián)用儀，記錄色譜圖。計算信噪比為3∶1時，該濃度為儀器LOD為0.0101 μg/ml;計算信噪比為10∶1時，該濃度為儀器LOQ為0.0201 μg/ml。

2.4.3精密度和準(zhǔn)確度? 精密量取完全不含展青霉素的供試品溶液（H廠，批號：20180301）各6份，每份約23.0 g，精密稱定，分別精密加入展青霉素對照品溶液（50.23 μg/ml）10 ml，按供試品溶液的制備方法處理，在上述色譜條件下測定。結(jié)果顯示，回收率在87.52%～92.09%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）<3.0%（n=6），滿足實驗要求，具體見表2。

2.5含量測定

按本方法對所有樣品進(jìn)行測定，結(jié)果詳見表3。

3討論

本研究在樣品溶液凈化處理的基礎(chǔ)上采用UPLC-MS/MS法對健脾丸中展青霉素進(jìn)行測定，與傳統(tǒng)的液相色譜法比較消除了5-羥甲基糠對測定結(jié)果的干擾以及中成藥中多藥味對檢測影響[12]。結(jié)合文獻(xiàn)報道對不同提取液、淋洗液和洗脫液進(jìn)行分析比較和優(yōu)化[7]。由于展青霉素易溶于水，在酸性條件下穩(wěn)定，故選用1%乙酸溶液對乙酸乙酯提取后的殘渣進(jìn)行溶解，轉(zhuǎn)移并定容至5 ml的量瓶，后轉(zhuǎn)移于活化過的HLB固相萃取柱（Oasis HLB）內(nèi)，分別用甲醇和水各6 ml淋洗。并使之以一定的速度流過固相萃取柱，后用乙酸乙酯進(jìn)行洗脫，將洗脫液收集并回收溶劑至干，最后用0.2%乙酸溶液溶解殘渣。對凈化處理后的樣品通過建立的UPLC-MS/MS測定其展青霉素的含量。并且對質(zhì)譜和高效液相測定方法結(jié)合文獻(xiàn)進(jìn)行優(yōu)化，使之符合實驗要求[14-18]。本研究結(jié)果顯示，12個廠家的27批健脾丸樣品中，有8個廠家11批樣品檢出展青霉素，檢出率為40.7%。但其含量均低于LOQ。

綜上所述，該方法具有靈敏度高、快速、準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)的特點，可應(yīng)用于健脾丸中展青霉素的測定并且該方法的建立為含山楂類中成藥中展青霉素的檢測方法的建立提供了實驗參考依據(jù)。

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（收稿日期：2019-05-14? 本文編輯：任秀蘭）