兩型骨骼肌纖維在體外培養(yǎng)過程中的相互轉換

陳穎

（商洛學院 健康管理學院，陜西商洛 726000）

骨骼肌纖維類型最常用的劃分方法,是根據(jù)肌纖維具有不同的收縮特性將其劃分為快肌纖維和慢肌纖維[1]。有研究認為，肌球蛋白重鏈異構體決定著骨骼肌纖維類型，并將肌纖維劃分為：MHCI型和MHCⅡ型（包括Ⅱa型、Ⅱb型、Ⅱx型）[2]。肌球蛋白重鏈（MHC）同功型成為區(qū)分肌纖維類型的分子標志[3]。慢肌纖維主要表達MHCI型，快肌纖維主要表達MHCⅡ型。快肌纖維與慢肌纖維的主要區(qū)別在于它們的代謝方式，慢肌纖維以有氧氧化為主要代謝形式，而快肌纖維以糖酵解為主要代謝形式[4]。Azad等研究證明外界環(huán)境發(fā)生改變，慢肌纖維與快肌纖維之間可以相互轉換[5]。肌纖維中的MHC的表達會受外界刺激等因素的影響。當外界環(huán)境發(fā)生改變時肌纖維中的一些特定基因的表達會發(fā)生變化，以適應其能量代謝方式的變化[6]。有研究證明耐力訓練可以使肌纖維能量代謝方式由糖酵解型向氧化型轉換[7]。在人類通過耐力訓練之后Ⅰ型纖維和Ⅱ型纖維同時存在于人類骨骼肌纖維中，專業(yè)運動員能經(jīng)過訓練提高Ⅰ型肌纖維的含量[8]。對于肌纖維類型的轉化有人認為是肌纖維上的特異性基因的表達發(fā)生變化，從而導致信號通路的改變，引起肌纖維類型發(fā)生改變[9]。通過對所獲取的骨骼肌組織以及在不同糖濃度下培養(yǎng)的兩型肌纖維，進行MHC同功型的檢測。觀察兩型肌纖維相互轉化的現(xiàn)象及其特征。為研究肌纖維類型轉變提供基礎支持。

1 材料與方法

1.1 材料

家兔、胰酶、PBS、Gibico胎牛血清、DMEM 高糖/低糖培養(yǎng)基、Fast Quant cDNA第一鏈合成試劑盒、細胞總RNA提取試劑盒。

1.2 方法

實驗分組：取家兔固有半膜肌和副半膜肌背側亞部，將實驗分為組織組、胰酶消化組、肌纖維高糖培養(yǎng)組以及肌纖維低糖培養(yǎng)組。所培養(yǎng)的兩型肌纖維在1、3、7 d取材，將所分的四組進行RT-PCR實驗，檢測MHC的表達。

1.2.1 總 RNA 的提取

組織RNA提取：取50 g組織，加入200 μL的Trizol溶液進行碾磨，碾磨成粉末狀后加入800 μL的Trizol溶液。將樣品在室溫中靜置5 min。隨后在4℃下12 000 r·min-1離心10 min，取上清。按每毫升Trizol液中加入0.2mL氯仿，混勻后靜置3 min。靜置后4℃下12 000 r·min-1離心15 min，離心后取上層水相至新的EP管，加入等體積的異丙醇，混勻后靜置25 min，靜置后4℃下12 000 r·min-1離心10 min棄上清。加入與Trizol溶液等體積的75%乙醇DEPC，4℃，5 000 r·min-1離心3 min，倒出液體，重復上述步驟2次。在室溫下干燥3 min,將RNA溶于25 μL的RNase-Free ddH2O，-80℃下保存。

細胞RNA提取：棄掉細胞培養(yǎng)基，用1mLTrizol溶液反復吹打細胞，將吹打下來的細胞轉入EP管中，室溫靜置5 min。隨后的操作步驟同組織RNA提取。

1.2.2 cDNA 制備

取提取好的 RNA 3.1 mL，加入 5×gDNA Buffer溶液 2 μL，RNase-Free ddH2O 溶液 4.9 μL，將其混勻后短暫離心，在42℃下加熱3 min。隨后加入 10×Fast RT Buffer溶液 2 μL，RT 酶混合物1 μL，F(xiàn)Q-RT-Primer Mix 溶液 2 μL，無酶 DEPC水5 μL。將其混勻在42℃下加熱15 min，95℃下加熱3 min，將制得的模板DNA放于-20℃保存。

1.2.3 PCR 的擴增

PCR擴增的反應體系為：DreamTaq Green PCR Master Mix溶液為 12.5 μL，上游引物 0.5 μL，下游引物 0.5 μL，模板 DNA 1 uL，無酶 DEPC 水10.5 μL。將該溶液短暫離心混勻后，在PCR儀上90℃，15 min預變性，90℃，15 s；55℃ 30 s；72℃，30 s，共36個循環(huán)。

2 結果與分析

2.1 組織組MHC同功型mRNA檢測

由圖1中（a）和（b）可知，固有半膜肌亞部表達MHCⅠ，不表達Ⅱa、Ⅱb、Ⅱx。由圖2中（a）和（b）可知副半膜肌背側亞部只表達Ⅱa、Ⅱb、Ⅱx。進一步證實副半膜肌為Ⅱ型肌纖維，固有半膜肌為Ⅰ型肌纖維。在組織離體過程中固有半膜肌和副半膜肌的能量代謝方式未發(fā)生改變。

圖1 兔固有半膜肌組MHC同功型mRNA檢測

2.2 兔固有半膜肌和副半膜肌背側亞部消化組MHC同功型檢測

由圖3中（a）和（b）可知，固有半膜肌亞部消化后只表達MHCⅠ，不表達Ⅱa、Ⅱb、Ⅱx。由圖4中（a）和（b）可知，副半膜肌背側亞部消化后只表達Ⅱa、Ⅱb、Ⅱx不表達MHCⅠ。組織在離體后其組織的代謝方式并未發(fā)生變化，所以其纖維特性并未發(fā)生改變。

圖2 兔副半膜肌組MHC同功型mRNA檢測

圖3 兔固有半膜肌消化組MHC同功型mRNA檢測組

圖4 兔副半膜肌消化組MHC同功型mRNA檢測

2.3 Ⅰ型纖維和II型纖維高糖培養(yǎng)組MHC同功型的檢測

由圖5 中（a）（b）（c）和（d）可知，Ⅰ型纖維高糖培養(yǎng)第1天時Ⅰ型纖維主要表達MHCⅠ型，少量表達Ⅱa，Ⅱb，Ⅱx；第3天時MHCⅠ表達量降低，Ⅱa、Ⅱb及Ⅱx表達量增加；第7天MHCⅠ表達量進一步降低，Ⅱa、Ⅱb及Ⅱx表達量進一步增加。分析其原因主要為固有半膜肌亞部為Ⅰ型纖維，其能量代謝方式以有氧氧化為主，在高糖環(huán)境下，其代謝方式開始逐漸向糖酵解轉化，因此其肌纖維類型也開始向Ⅱ型纖維轉化，其中Ⅱa、Ⅱb以及Ⅱx表達量增加，MHCⅠ表達量逐漸減少。

圖5 Ⅰ型纖維高糖培養(yǎng)組MHC同功型mRNA檢測

由圖6中（a）（b）（c）和（d）可知，Ⅱ型纖維在高糖培養(yǎng)時，第 1、3、7 天均只表達Ⅱa，Ⅱb，Ⅱx，不表達MHCⅠ。分析其原因可能為副半膜肌的能量代謝方式以糖酵解為主，在高糖環(huán)境中其能量代謝方式并未發(fā)生改變，所以Ⅱ型纖維的MHC的表達并未發(fā)生改變。

圖6 Ⅱ型纖維高糖培養(yǎng)組MHC同功型mRNA檢測

2.4 Ⅰ型纖維和II型纖維低糖培養(yǎng)組MHC同功型的檢測

由圖7中（a）（b）（c）和（d）可知，Ⅰ型纖維在低糖培養(yǎng)第1天時不僅表達MHCⅠ，同時還少量表達Ⅱa，Ⅱb，Ⅱx。第3天仍表達MHCⅠ但其表達量較第1天有所減少，Ⅱa，Ⅱb，Ⅱx表達量有所增加。第7天時MHCⅠ表達量無明顯變化，Ⅱa，Ⅱb，Ⅱx表達量較第3天無明顯變化，但仍比第1天有明顯增加。其原因主要為固有半膜肌亞部在體外培養(yǎng)過程中能量代謝方式發(fā)生變化由以前的有氧氧化變?yōu)樘墙徒?，導致其纖維類型開始表現(xiàn)出Ⅱ型肌纖維的特性。

圖7 Ⅰ型纖維低糖培養(yǎng)組MHC同功型mRNA檢測

由圖8中（a）（b）（c）和（d）可知，Ⅱ型肌纖維在低糖培養(yǎng)第1天時只表達Ⅱa、Ⅱb、Ⅱx。第3天仍表達Ⅱa、Ⅱb、Ⅱx，但同時開始表達MHCⅠ。第7天同樣表達Ⅱa、Ⅱb、Ⅱx，進一步表達MHCⅠ，其表達量進一步增加。其原因為Ⅱ型肌纖維在離體后其能量代謝方式未發(fā)生改變，所以仍維持其Ⅱ型肌纖維的特性，但由于糖含量的減少，為了能適應低糖環(huán)境，同時也會表達出MHCⅠ型標志蛋白，來提供充足的ATP。

3 結論與討論

本研究結果顯示，當糖濃度出現(xiàn)改變時Ⅰ型纖維都會向Ⅱ型纖維轉換，骨骼肌纖維類型的轉變是為了適應糖含量的不同而導致的能量代謝方式的轉變。葡萄糖轉運體在Ⅰ型纖維中的含量最高，Ⅱ型纖維中含量相對較少。但近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，葡萄糖轉運體的表達主要是與肌肉的代謝性質有關，似乎與肌纖維類型沒有直接關聯(lián)。不同部位的肌肉即使是同一類型肌纖維，其葡萄糖轉運體的量可能也有很大的差別。

肌纖維類型的轉化不僅與糖濃度有關而且可能與培養(yǎng)基中的氧濃度有關，同時還認為與信號通路有關，楊瑾等[10]研究發(fā)現(xiàn)PGC-1α就可以通過降低Mstn基因表達量來調節(jié)豬體內肌纖維類型轉換。但其轉換過程中究竟涉及哪些通路、各通路的基因及蛋白表達水平的差異的機制尚需進一步研究。中等強度運動可以激活CaN活性，引起NFATc1蛋白表達增加;誘導骨骼肌纖維由慢向快轉化。伴隨著運動引起的骨骼肌快型MHC向慢型MHC轉化過程中，CaN同樣發(fā)生了相應的變化，CaN信號途徑與運動誘導的骨骼肌纖維類型轉化確實存在一定的關聯(lián)。慢肌纖維以有氧氧化為主要的能量代謝方式，肌質中含有豐富的肌紅蛋白、線粒體、脂質和毛細血管，具有相對低的肌球蛋白ATP酶活性和較少的糖原，而含有豐富的高活性有氧氧化關鍵酶。因此慢肌纖維收縮速度慢但較持久，并且有很好的耐疲勞性?？旒±w維其肌質含有相對高的肌球蛋白ATP酶活性和較多的糖原，但脂質和線粒體較少，有氧氧化關鍵酶活性低而磷酸化酶活性較高，其收縮特性為快速易疲勞不能持久，所以快肌纖維以糖酵解為其主要的供能方式。因此，慢肌纖維和快肌纖維在能量代謝方面存在明顯差異。通過研究骨骼肌纖維的相互轉換，能夠為運動員的選拔以及運動員的訓練項目的安排提供科學依據(jù)。同時還可以為與肌纖維有關的疾病例如肌萎縮等相關疾病的治療，提供理論基礎。

圖8 Ⅱ型纖維低糖培養(yǎng)組MHC同功型mRNA檢測