云南三種野生食用菌多糖提取工藝優(yōu)化及其對(duì)比分析

魏曉梅 王 瑞 吳麗芳 柏旭 阮小娟 蔡清林

（1曲靖師范學(xué)院生物資源與食品工程學(xué)院，云南曲靖655011；2曲靖師范學(xué)院云南高原生物資源保護(hù)與利用研究中心，云南曲靖655011）

雞油菌（Cantharelles cibarius）屬真菌界擔(dān)子菌門(mén)擔(dān)子菌綱雞油菌目雞油菌科雞油菌屬（Cantharellus）的模式種[1]，含多種礦物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)[2]，在日本被稱(chēng)為“植物食品的頂峰”，其多糖有美容及其抗衰老的功效[3]。雞菌Termitornyces albuminosus（蟻巢傘），是一類(lèi)特異性的與白蟻共生的食用菌，王思蘆等發(fā)現(xiàn)雞菌多糖對(duì)小鼠細(xì)胞免疫功能有顯著的增強(qiáng)作用[4]，且能夠明顯提高脾淋巴細(xì)胞增殖能力及免疫抑制小鼠體液及細(xì)胞免疫功能，這種能力優(yōu)于黃芪多糖的效果[5]。青頭菌（Russula virescens）屬擔(dān)子菌綱（Basidiomycetes）紅菇科（Russulacese）紅菇屬（Russula）[6，7]，因其獨(dú)特濃郁的鮮香味及其豐富的礦質(zhì)元素[8]和氨基酸含量[9]深受人們的歡迎。

真菌多糖是一大類(lèi)生物活性物質(zhì)，主要從真菌子實(shí)體或菌絲體及發(fā)酵液中分離出，由10個(gè)以上β-1，3糖苷鍵和β-1，6糖苷鍵連接而成，在國(guó)際上被稱(chēng)為“生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑”[10]，對(duì)醫(yī)藥科學(xué)、生命科學(xué)的研究有重要意義。研究表明，真菌多糖具有抗菌，抗病毒，幫助心血管系統(tǒng)、降血糖等功效[11，12]。我國(guó)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有重要價(jià)值的真菌多糖就有近30種[13]，許多研究人員已從藥用真菌中用各種方法分離提取到了有生物學(xué)活性的多糖[14]，其中熱水浸提法為常用的真菌多糖提取方法。常昕等發(fā)現(xiàn)最佳提取博湖蘑菇多糖的水提醇沉提取工藝為：100℃提取3.5 h，液固比35∶1，多糖提取得率高達(dá)20.02%[15]。

研究以采集自云南省不同地方的三種野生食用菌子實(shí)體為原材料，研究其多糖提取的最佳工藝，并在此基礎(chǔ)上比較其粗多糖提取率，為野生食用菌的基礎(chǔ)研究提供一定的數(shù)據(jù)支持，為食用菌生物活性物質(zhì)的功能研究及其相關(guān)產(chǎn)品的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)提供一些可參考的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.2 試劑與設(shè)備

無(wú)水乙醇（天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司生產(chǎn)，分析純），三氯甲烷（南陽(yáng)市科龍化工試劑廠生產(chǎn)，分析純），正丁醇（天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司生產(chǎn)，分析純），丙酮（天津市化學(xué)試劑三廠生產(chǎn)，分析純），離心機(jī)（大地自動(dòng)化儀器廠制造，80-1離心機(jī)），高速組織搗碎機(jī)（上海標(biāo)本模型廠制造，DS-1），電子天平 CP114（奧豪斯儀器（上海）有限公司制造，精確度等級(jí)Ⅰ），數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠制造，GZX-9070 MBE），微波爐（格蘭仕微波爐電器有限公司效率值58%），DK-S26電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司制造）。

1.3 試驗(yàn)方法

精確稱(chēng)取粉末2 g，按照正交設(shè)計(jì)組合（表1）的條件，4000 r/min離心10 min，取上清，離心2次，合并上清液，沉淀中分別加入20、30、40倍蒸餾水，重復(fù)上述過(guò)程2次，合并上清液。用Sevag（氯仿∶正丁醇=4∶1）法除蛋白質(zhì)。按1∶3的量加入Sevag試劑充分混勻蛋白質(zhì)，置于具塞試管中，充分振搖20 min后放入錐形瓶中靜置30 min，4000 r/min離心10 min。重復(fù)上述過(guò)程3次，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至原體積的1/3，待濃縮液冷卻后往濃縮液中分別加入無(wú)水乙醇，使?jié)饪s液中乙醇濃度達(dá)到預(yù)先設(shè)計(jì)的量，4℃低溫靜置12 h醇沉，4000 r/min離心10 min，分離乙醇與沉淀旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至原體積的1/3，待濃縮液冷卻后往濃縮液中分別加入無(wú)水乙醇，使?jié)饪s液中乙醇濃度達(dá)到預(yù)先設(shè)計(jì)的量，4℃低溫靜置12 h醇沉，4000 r/min離心10 min，分離乙醇與沉淀。醇沉結(jié)束后往水層中加入乙醇，使乙醇的量達(dá)到75%進(jìn)行沉淀，去除水層并用丙酮進(jìn)行洗滌。沉淀物在80℃的鼓風(fēng)干燥箱中進(jìn)行干燥，待干燥后稱(chēng)量所得的粗多糖。

以真菌多糖的提取含量為指標(biāo)，研究浸提時(shí)間、浸提溫度、料液比這三個(gè)因素在不同水平上對(duì)多糖提取結(jié)果的影響進(jìn)行探討，以確定提取真菌多糖的最佳條件。

1.4 多糖得率計(jì)算方法

多糖得率（%）=提取得到的粗多糖質(zhì)量（g）/子實(shí)體原料質(zhì)量（g）×100

表1 正交設(shè)計(jì)因素與水平（楚雄青頭菌和雞油菌）

表2 正交因素與水平（馬龍雞菌）

表2 正交因素與水平（馬龍雞菌）

水平1 2 3 A浸提時(shí)間/h 2 2.5 3 B浸提溫度/℃60 70 80 C料液比1∶20 1∶30 1∶40

2 結(jié)果與分析

2.1 楚雄青頭菌子實(shí)體粗多糖提取結(jié)果

提取結(jié)果見(jiàn)表3。不同條件下粗多糖得率存在差異，提取因素水平組合為A3B2C1時(shí)，粗多糖得率最高為6.18%；A1B1C1時(shí)，多糖得率最少，粗多糖得率僅為5.72%。根據(jù)各因素在相同水平下每克子實(shí)體材料提取粗多糖得量的和計(jì)算出K1、K2和K3，并得出相應(yīng)的極差RⅠ值。分析RⅠ值發(fā)現(xiàn)對(duì)提取率影響B(tài)＞A＞C，即浸提溫度＞浸提時(shí)間＞料液比，其中因素B（浸提溫度）RⅠ值為0.0059，對(duì)楚雄青頭菌子實(shí)體粗多糖提取率影響最大。其次是因素A（浸提時(shí)間），其RⅠ值為0.00515，且在浸提時(shí)間為3 h時(shí)，粗多糖得率最高。因素C（料液比）RⅠ值為0.00115，對(duì)多糖得率的影響最小。分別分析A、B、C 的K1、K2和K3，發(fā)現(xiàn)AK3，BK2，CK3最大，因此當(dāng)浸提溫度為75℃，浸提3 h（即A3B2C3）時(shí)，楚雄青頭菌粗多糖的提取率最高，即最佳提取方案A3B2C3即料液比1∶40，75℃條件下浸提3 h。

表3 野生楚雄青頭菌提取粗多糖正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果

2.2 楚雄雞油菌子實(shí)體粗多糖提取結(jié)果

結(jié)果見(jiàn)表4。因素水平為A3B2C1時(shí)，粗多糖得率最高為6.085%；A1B1C1時(shí)，多糖得率最低，粗多糖提取率為4.89%。根據(jù)各因素在相同水平下的粗多糖得量的和計(jì)算K-1、K-2和K-3及其對(duì)應(yīng)的RⅡ。分析RⅡ，各因素對(duì)提取結(jié)果的影響程度為B＞A=C（浸提溫度＞浸提時(shí)間=料液比），因素B（浸提溫度）RⅡ?yàn)?.0184，對(duì)提取率的影響最大。分別分析A、B、C的K-1、K-2和K-3，發(fā)現(xiàn) AK-2，BK-2，CK-1最大，因此最佳提取楚雄雞油菌子實(shí)體粗多糖的組合為A2B2C1即75℃浸提2.5 h，料液比1∶20。

2.3 馬龍雞菌子實(shí)體多糖提取結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。在9個(gè)試驗(yàn)組合中，最佳的組合為A1B3C3，多糖得率最高，為4.08%。將各因素在相同水平下的粗多糖得量加和計(jì)算K1、K2和K3及其對(duì)應(yīng)的Rj，各個(gè)因素對(duì)馬龍雞菌子實(shí)體粗多糖提取率影響的大小順序?yàn)锽＞C＞A，即浸提溫度影響最大，浸提時(shí)間的影響次之，料液比影響最小。根據(jù)每個(gè)因素提取結(jié)果進(jìn)行詳細(xì)對(duì)比，發(fā)現(xiàn)最佳提取馬龍雞菌子實(shí)體粗多糖組合為A1B3C1，即80℃浸提2 h，料液比1∶20。

表4 野生楚雄雞油菌提取粗多糖正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果

表5 野生馬龍雞菌提取粗多糖正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果

表5 野生馬龍雞菌提取粗多糖正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)號(hào)123456789K1K2K3K1 A 111222333 B 123123123 C 123231312每克子實(shí)體提取粗多糖/g 0.0270 0.0269 0.0408 0.0221 0.0195 0.0393 0.0153 0.0283 0.0335粗多糖提取率/%2.70 2.69 4.08 2.21 1.95 3.93 1.53 2.83 3.35 K2∑=0.2527 K3優(yōu)水平Rj 0.0947 0.0809 0.0771 0.0316 0.0270 0.0257 A1 0.0059 0.0664 0.0747 0.1136 0.0221 0.0249 0.0379 B3 0.0158 0.0946 0.0825 0.0756 0.0315 0.0275 0.0252 C1 0.0063主次順序B＞C＞A

2.4 三種野生菌子實(shí)體粗多糖提取最佳方案及其粗多糖提取率比較

對(duì)比楚雄青頭菌和雞油菌，通過(guò)正交分析表，二者粗多糖最佳提取因素上對(duì)于溫度的要求類(lèi)似，75℃為最佳提取溫度；浸提時(shí)間和料液比則有所差異：楚雄青頭菌子實(shí)體粗多糖最佳提取工藝為75℃浸提3 h，料液比1∶40，楚雄雞油菌子實(shí)體粗多糖最佳提取方案為75℃浸提2.5 h，料液比1∶20。馬龍雞菌最佳提取工藝為80℃浸提2 h，料液比1∶20。因此對(duì)比浸提溫度，楚雄青頭菌及其雞油菌子實(shí)體粗多糖提取最佳溫度為75℃，而馬龍雞菌子實(shí)體粗多糖提取所需的最佳溫度較高，為80℃。

在正交試驗(yàn)中，楚雄青頭菌粗多糖提取率最高為6.18%，楚雄雞油菌子實(shí)體粗多糖提取率最高為6.085%，馬龍雞菌子實(shí)體粗多糖提取率最高為4.08%，馬龍雞菌粗多糖提取率低于供試其它兩種野生菌。由此推測(cè)，馬龍雞菌粗多糖含量可能較低于楚雄青頭菌、楚雄雞油菌，楚雄青頭菌粗多糖含量在這供試三種野生食用菌中最高，可能與這三種野生食用菌本身的遺傳特性相關(guān)，該推測(cè)還需進(jìn)一步的試驗(yàn)分析和驗(yàn)證。

3 討論

目前，野生食用菌子實(shí)體多糖相關(guān)研究越來(lái)越受到重視，其人工培養(yǎng)技術(shù)也在不斷研究探索，若在人工培養(yǎng)過(guò)程中考慮到其生存環(huán)境與多糖積累之間的關(guān)系，并進(jìn)一步分析確定其多糖結(jié)構(gòu)[16]，據(jù)此開(kāi)發(fā)出食品添加劑、抗腫瘤藥物，將具有極高的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。試驗(yàn)結(jié)果將為這些野生菌開(kāi)發(fā)研究提供一定參考[17]。