Cockayne綜合征患兒臨床特征及基因突變研究一例報告

潘璐，劉艷秋

(江西省婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心，南昌 330006)

科凱恩綜合征（Cockayne syndrome，CS）是一種罕見的常染色體隱性遺傳疾病，于1936年由英國兒科醫(yī)生Cockayne[1]首次對該疾病進(jìn)行報道。在美國及歐洲國家該病的發(fā)病率大約是2.7/1000000[2]，國內(nèi)偶見散發(fā)個例報道。Coakayne綜合征是一種以身材矮小、早衰外觀為特征，該病特點(diǎn)包括體重不增、不能正常生長、頭圍異常小和神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育受損?；純簩鈽O度敏感，少量陽光照射就能引起曬傷，其他癥狀包括聽力喪失、眼部異常、蛀蟲嚴(yán)重、骨質(zhì)異常并有腦部特征性變化[3，4]。目前已知的主要致病基因有 ERCC6、ERCC8，ERCC8位于人類第5號染色體 （5q12.1），ERCC6位于人類第10 號染色體（10q11.13）[5]，另外少見的 XPB、XPD、XPG基因亦可導(dǎo)致Cockayne綜合征[6]。本研究中，我們對1例Cockayne綜合征患兒應(yīng)用芯片捕獲高通量測序及其父母采用Sanger測序法對ERCC6、ERCC8進(jìn)行突變測序，明確其突變類型及突變形式，并根據(jù)遺傳學(xué)規(guī)律指導(dǎo)該夫婦避免再次生育Cockayne綜合征患兒。

1 對象與方法

1.1 對象 江西省婦幼保健院就診患兒，男，5歲，足月分娩，分娩時無窒息、缺氧等，1歲內(nèi)生長發(fā)育基本正常，2歲開始生長發(fā)育增長緩慢，并出現(xiàn)運(yùn)動、智力發(fā)育遲緩，少量陽光照射即可出現(xiàn)曬傷、脫皮、色素沉著，3歲時能獨(dú)立行走，步態(tài)不穩(wěn)，并出現(xiàn)睪丸萎縮，眼球凹陷，間斷出現(xiàn)腹瀉，5歲時睪丸消失，現(xiàn)只會說簡單的詞句。該患兒為第二胎第二產(chǎn)，足月順產(chǎn)，出生體重2.6kg，身長50cm，Apar評分9分，生后母乳喂養(yǎng)。?？茩z查：身高85cm，體重10kg，顏面部皮膚增厚、粗糙、脫屑，有色素沉著，眼球凹陷，頭發(fā)稀疏，神志清楚，表情淡漠，心肺未聞及明顯異常，肝脾稍偏大，睪丸消失。實(shí)驗(yàn)室檢查：染色體 G 顯帶：46，XY；血常規(guī)、血凝、生化、自身免疫、血?dú)夥治?、病原體及病毒檢測等未見明顯異常。頭顱CT提示：顱內(nèi)廣泛性鈣化。患兒父母非近親婚配，無遺傳家族病史。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 用含枸櫞酸鈉抗凝劑的真空采血管，分別采集患兒及其父母外周靜脈血5ml，應(yīng)用試劑盒 (采用美國OMIGA公司E.Z.N.A Blood DNA試劑盒)提取DNA，提取步驟參照試劑盒說明；取適量DNA用紫外分光光度進(jìn)行定量和純度檢測，其余保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 基因芯片捕獲高通量測序 應(yīng)用基因芯片（華大基因有限公司）對靶基因進(jìn)行捕獲，對捕獲的富集靶基因采用高通量測序(在Hiseq2000測序平臺進(jìn)行測序--美國 Illumina公司)對 ERCC6、ERCC8基因進(jìn)行突變檢測，采用Illumina配套軟件進(jìn)行信息處理和數(shù)據(jù)分析。

1.2.3 Sanger驗(yàn)證 利用Primer軟件對目標(biāo)位點(diǎn)進(jìn)行特異引物設(shè)計(jì)（正向引物序列5，-GAGACTCCCA CTTCTCATACTCATAAAGGGGTGT-3’反向引物序列 5’ -GTCTTTGTCCTCTTTTTCGGCTTTTTC-3’）（引物由華大基因股份有限公司合成），對該患兒基因組DNA進(jìn)行目標(biāo)位點(diǎn)及上下游區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增；擴(kuò)增產(chǎn)物采用天根通用DNA純化試劑盒進(jìn)行純化；純化產(chǎn)物用Beckman 8000型DNA測序儀進(jìn)行測序；測序結(jié)果與基因庫的ERCC6基因參考序列 (NC-000010.10)進(jìn)行比對，進(jìn)一步確認(rèn)核苷酸變異信息。

1.2.4 突變分析 測序結(jié)果用Chromas軟件分析，并與NCBI中的正常序列進(jìn)行BLAST比對，分析采用在線軟件分析蛋白的結(jié)構(gòu)，檢測保守區(qū)、功能區(qū)及多序列比對。在線分析軟件為：0nline Mendelian Inheritance in man (OMIM)、1000 Genomes、PolyPhen 一 2、SIFT、SWISS.Model repository、PROSITE。

2 結(jié)果

測序結(jié)果提示患兒存在ERCC6基因復(fù)合雜合突變（表 1），Sanger測序(表 2)：對父母進(jìn)行同片段序列分析結(jié)果顯示，該患兒分別遺傳了父親及母親的雜合突變，該患兒ERCC6復(fù)合雜合突變中核苷酸 變 化 c.116-1125delTGAGTATTTC、c.780-781insCC； 氨基酸變化：p.Ser372SerfsX30|p.S372SfsX30、p.ProfsX70|p.P260PfsX70； 基因亞區(qū)：EX5；CDS4，屬框移突變，該框移突變導(dǎo)致氨基酸編碼蛋白發(fā)生提前終止，產(chǎn)生截短蛋白，會對蛋白質(zhì)的結(jié)果和功能產(chǎn)生較大影響；該突變在文獻(xiàn)中未見報道；與CS發(fā)病有相關(guān)性。

3 討論

CS是一組進(jìn)行性加重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)遺傳變性疾病，其發(fā)病機(jī)制是ERCC6、ERCC8基因發(fā)生突變，細(xì)胞內(nèi)DNA受到損傷后，由ERCC6基因編碼的CSB不能將損傷的DNA進(jìn)行修復(fù)，并且以損傷的DNA作為模板進(jìn)行mRNA轉(zhuǎn)錄并進(jìn)行蛋白質(zhì)翻譯；ERCC8基因編碼的CSA蛋白亦不能修復(fù)損傷的DNA，并且導(dǎo)致?lián)p傷的DNA累積，后續(xù)的轉(zhuǎn)錄及翻譯過程終止，因此CS的臨床表現(xiàn)可能是修復(fù)缺陷與轉(zhuǎn)錄缺陷共同作用的結(jié)果[7，8]。

表1 患兒ERCC6基因突變位點(diǎn)信息

表2 患兒父母Sanger驗(yàn)證位點(diǎn)信息

圖1 （圖1a為該患兒c.780-781insCC突變位置、圖1b為該患兒c.116-1125delTGAGTATTTC突變位置）

該患兒出現(xiàn)的臨床癥狀與報道的CS綜合征患者的臨床表現(xiàn)相同，但該患者還出現(xiàn)了腹瀉，患兒還有一哥哥，其哥哥與該患兒的癥狀一致，亦出現(xiàn)腹瀉，并且有肝衰竭（11歲時已死亡）。Cockayne綜合征有三種臨床分型[9]：1 型(OMIM：133540)為經(jīng)典型，累及腦、眼、皮膚、骨骼等多個系統(tǒng)，出生時多正常，嬰兒期或兒童早期發(fā)病，逐漸進(jìn)展；2型(OMIM：216400)為先天型，表現(xiàn)更嚴(yán)重，出生早期就可能死亡；3 型（OMIM：216411）為溫和型，特點(diǎn)是晚發(fā)病，病程進(jìn)展緩慢，可以存活至成年，通過該患兒的臨床表現(xiàn)提示為Cockayne綜合征1型。目前國內(nèi)外還未見Cockayne綜合征1型生育后代報道[10]。

圖2 （圖2a該患兒母親c.116-1125delTGAGTATTTC突變位置；圖2b為該患兒父親c.780-781insCC突變位置）

Cockayne綜合征頭部影像學(xué)檢查最具特征性[11]，表現(xiàn)為雙側(cè)側(cè)腦室擴(kuò)大、腦萎縮和鈣化、腦白質(zhì)髓鞘形成不良等，該患兒頭顱CT提示顱內(nèi)廣泛性鈣化，符合其影像學(xué)改變。Cockayne綜合征沒有血生化以及代謝產(chǎn)物的特征性改變，因此主要通過臨床表現(xiàn)及影像學(xué)的特征性進(jìn)行臨床診斷，再通過基因檢測進(jìn)行分子遺傳學(xué)確診[12]。

本研究中，我們對該患兒進(jìn)行了ERCC6、ERCC8基因進(jìn)行檢測，患兒檢測出了ERCC6基因的 c.116-1125delTGAGTATTTC（p.Ser372SerfsX30）及 c.780-781insCC（p.ProfsX70）突變，屬于復(fù)合雜合突變。根據(jù)Sanger測序，c.116-1125delTGAGTA TTTC雜合突變來源于父親，c.780-781insCC雜合突變來源于母親，目前該突變國際上未見報道，屬于新發(fā)突變?；純杭捌涓绺缇鶠镃ockayne綜合征患者，其父母表型正常，但為致病基因攜帶者。Cockayne綜合征是一種嚴(yán)重致殘致死性遺傳疾病，目前沒有有效的治療辦法，只能采取物理及支持治療提高患者的生活質(zhì)量，因此患該病兒給社會及家庭帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)及精神負(fù)擔(dān)，及時的診斷及產(chǎn)前診斷是非常有必要的。該夫婦再次妊娠后患病風(fēng)險1/4，致病基因攜帶者1/2，鑒于該夫婦已生育2個該病患兒，因此在妊娠11-14周采用胎兒絨毛膜絨毛取樣（CVS）方法或18-24周采用羊膜腔穿刺術(shù)進(jìn)行產(chǎn)前診斷，或者針對該檢出的致病基因位點(diǎn)直接行胚胎遺傳前診斷（PGD），以阻止此病在該家庭中繼續(xù)蔓延。