槐耳清膏對(duì)胃癌細(xì)胞NCI-N87自噬的影響＊

廖傳文 ，李潔蘭 ，殷俊翔 ，胡淑琴 ，饒雪峰

(1.江西省人民醫(yī)院普外科，南昌 330006；2.江西省吉水縣人民醫(yī)院，吉水 331600)

中藥在抗腫瘤方面扮演著非常重要的作用[1]，槐耳提取物在中國(guó)有1600年的使用歷史[2]，研究表明槐耳提取物在體外可抑制多種腫瘤細(xì)胞活性及增殖作用[3]。自噬是一個(gè)保守的依賴溶酶體的降解途徑，可降解長(zhǎng)壽命蛋白質(zhì)、細(xì)胞器和部分細(xì)胞質(zhì)，并已被證明參與包括能量代謝、細(xì)胞器周轉(zhuǎn)、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)和衰老等生理病理過(guò)程[4，5]。近年來(lái)研究表明，自噬在腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和抵抗藥物治療等方面扮演重要角色[6]?；倍欠衲芡ㄟ^(guò)影響胃癌細(xì)胞自噬進(jìn)而影響胃癌的發(fā)生發(fā)展，尚鮮有報(bào)道。本研究以胃癌細(xì)胞NCI-N87為研究對(duì)象，探討槐耳清膏對(duì)NCI-N87細(xì)胞自噬影響及可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 槐耳清膏 (江蘇啟東蓋天力公司)，DMEM溶解后，0.22um濾膜過(guò)濾，加入10%PBS，使其終濃度分別為 4、8、16、32mg/ml。 胃癌細(xì)胞株NCI-N87購(gòu)于中國(guó)生命科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。啶橙購(gòu) 自 Sigma 公 司 ，Beclin 1、PTEN、LC3-II 和GAPDH抗體購(gòu)于Santa cruz公司；TRIzol試劑購(gòu)于invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒為Promega公司產(chǎn)品；Real-Time PCR試劑盒為fermentas公司產(chǎn)品；Real-Time PCR擴(kuò)增儀為美國(guó)ABI公司產(chǎn)品；流式細(xì)胞儀為美國(guó)BD公司產(chǎn)品；引物由上海生工生物技術(shù)公司合成。半干轉(zhuǎn)印系統(tǒng)轉(zhuǎn)印槽為Bio.Rad公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) NCI-N87細(xì)胞株常規(guī)在含10%胎牛血清的0.1%DMSO培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2的孵箱中培養(yǎng)，用0.25%胰蛋白酶消化，在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿至80%融合度時(shí)，以1：3比例進(jìn)行傳代。使活細(xì)胞數(shù)＞95%，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞抑制率 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期NCI-N87細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔細(xì)胞接種數(shù)目為2000個(gè)，同時(shí)每孔加入培養(yǎng)液100μl，另設(shè)不加細(xì)胞的培養(yǎng)液為本底，24h后實(shí)驗(yàn)組分別加入槐耳清膏10μl，使其最終濃度分別為4、8、16、32mg/ml?？瞻讓?duì)照組為未加藥物的細(xì)胞，加入等量培養(yǎng)液。每個(gè)濃度設(shè)有6個(gè)復(fù)孔，然后在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24、48和72h，每日相同時(shí)間點(diǎn)將不同濃度組的細(xì)胞放置于倒置顯微鏡下觀察其細(xì)胞形態(tài)改變，并于時(shí)間點(diǎn)向各個(gè)孔培養(yǎng)液中分別加入CCK-8試劑各10μl，然后于5%CO2、37℃環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)4h后，使用酶標(biāo)儀測(cè)試吸光度，測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)為490nm的的吸光度波長(zhǎng)，記錄所有孔的吸光度（OD）的數(shù)值，計(jì)算細(xì)胞抑制率(%)。細(xì)胞抑制率 (%)=[1-(實(shí)驗(yàn)組OD值一空白組OD值)/(對(duì)照組OD值一空白組OD值)]×100%。

1.2.3 AnnexinV/PI流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NCI-N87細(xì)胞制成懸液，按5×103個(gè)/ml接種于6孔板中，共設(shè)6組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，向各實(shí)驗(yàn)組分別加入含濃度為4、8、16、32mg/ml槐耳培養(yǎng)液，處理24h。對(duì)照組加入含0.1%DMSO培養(yǎng)基。檢測(cè)前用PBS洗滌細(xì)胞2次，按照說(shuō)明書進(jìn)行以下操作：每管加入5μl的AnnexinV和PI復(fù)合染液和500μl結(jié)合緩沖液，避光染色20min后，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，分析槐耳處理后的細(xì)胞凋亡百分比變化。

1.2.4 細(xì)胞自噬小體的定量檢測(cè) 不同濃度槐耳清膏（4、8、16、32mg/ml）作用 NCI-N87 細(xì)胞 24h 后，收集細(xì)胞，用濃度為1μg/ml吖啶橙室溫條件下避光染色20min，離心之后棄染液，用1×PBS清洗3次后，PBS重懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，F(xiàn)L3通道檢測(cè)紅色熒光，F(xiàn)L1通道檢測(cè)綠色熒光，紅色熒光增強(qiáng)說(shuō)明細(xì)胞內(nèi)酸性自噬小體增多。

1.2.5 RT-PCR 檢測(cè) Beclin-1、LC3-II、PTENmRNA表達(dá) 分別檢測(cè)不同濃度的槐耳作用NCI-N87細(xì)胞24h后，按照說(shuō)明書操作，用Trizol試劑提取各組細(xì)胞總RNA，紫外分光光度儀測(cè)定RNA濃度，并行純度驗(yàn)證、電泳鑒定，然后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，以cDNA為模板進(jìn)行Real-Time PCR反應(yīng)。PCR產(chǎn)物以瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，凝膠成像分析系統(tǒng)行密度分析。GAPDH作為內(nèi)參照。目的基因mRNA表達(dá)量以各目的基因片段密度值／內(nèi)參照密度值的比值表示。Beclinl基因上游引物5’-ATCCTGGACCGTGTCACCATCCAGG-3’， 下游引物 5’-GTTGAGCTGAGTGTCCAGCTGG-3’。LC3-II上游引物 5’-ACCATGCCGTCGGAGAAG3’； 下游引 物 5’ -ATCGTTCTATTATCACCGGGATTT-3’。PTEN上游引物 5’-TCACCAACTGAAGTGCCTAA AGA-3’；下游引物 5’-CTCCATTCCCCTAACCCGA-3’。 GAPDH 上游引物 5’-GTAAAGACCTCTATG CCATCA-3’；下游引物 5’-GGACTCATCGTACTC CTGCT-3’。

1.2.6 Westernblot檢測(cè) Beclin-1、LC3-II、PTEN 蛋白表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NCI-N87細(xì)胞，并用不同濃度槐耳清膏(8、16、32mg/ml)處理細(xì)胞 24h；實(shí)驗(yàn)前2h用含有2%胎牛血清的RPMI-1640預(yù)處理細(xì)胞，收集處理后的細(xì)胞，加入裂解液，冰上裂解30min后，超聲破碎，4℃、離心10min，轉(zhuǎn)速15000r/min，取上清，采用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，SDSPAGE凝膠電泳，低溫轉(zhuǎn)移至PVDF膜，封閉，分別加入 Beclin-1、LC3-II、PTEN 一抗 4℃過(guò)夜、山羊抗兔二抗30℃溫育1h后顯色，用數(shù)字成像儀對(duì)圖像進(jìn)行拍照和分析。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 槐耳清膏對(duì)NCI-N87細(xì)胞增殖影響 槐耳清膏（4、8、16、32mg/ml）作用 NCI-N87 細(xì)胞 24、48、72h后， 與對(duì)照組相比，8、16、32mg/ml對(duì)胃癌細(xì)胞有抑制增殖作用，并以濃度和時(shí)間依賴的方式抑制細(xì)胞增殖（P＜0.05），而低濃度組 4mg/ml未顯現(xiàn)明顯抑制作用。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同濃度槐耳清膏作用不同時(shí)間后對(duì)胃癌細(xì)胞NCI-N87存活的影響（）

表1 不同濃度槐耳清膏作用不同時(shí)間后對(duì)胃癌細(xì)胞NCI-N87存活的影響（）

注：與對(duì)照組比較，★P＜0.05；與同組 24h 比較，◆P＜0.05；與同組 48h比較，#P＜0.05。

1.02±0.19 0.88±0.18 0.51±0.08★◆#0.42±0.06★◆#0.32±0.02★◆#組別對(duì)照組4mg/ml 8mg/ml 16mg/ml 32mg/ml 24h 1.06±0.23 0.95±0.18 0.78±0.17★0.63±0.19★0.42±0.04★48h 72h 1.04±0.41 0.89±0.19 0.64±0.17★◆0.51±0.17★◆0.39±0.09★◆

2.2 槐耳清膏對(duì)NCI-N87細(xì)胞凋亡率及自噬小體的影響 槐耳清膏（8、16、32mg/ml）作用 NCI-N87細(xì)胞24h后，流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，8、16、32mg/ml濃度能促進(jìn) NCI-N87 細(xì)胞凋亡，自噬小體形比例增加。（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 槐耳清膏對(duì)胃癌細(xì)胞NCI-N87凋亡率及自噬小體的影響（，%）

表2 槐耳清膏對(duì)胃癌細(xì)胞NCI-N87凋亡率及自噬小體的影響（，%）

注：與對(duì)照組比較，★P＜0.05。

自噬小體/%4.89±0.67 9.84±1.87 12.47±2.87 17.45±3.81組別對(duì)照組8mg/ml 16mg/ml 32mg/ml細(xì)胞凋亡率/%3.23±0.45 8.78±1.78 11.65±2.48 16.28±3.58

2.3 槐耳清膏對(duì)NCI-N87細(xì)胞相關(guān)自噬蛋白表達(dá)的影響 通過(guò)RT-PCR和Western blot對(duì)自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、LC3-II、PTEN mRNA和蛋白水平進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，槐耳清膏作用 NCI-N87 細(xì)胞 24h 后，Beclin-1、LC3-II、PTEN mRNA水平和蛋白表達(dá)水平逐漸升高，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。 結(jié)果見(jiàn)圖 1、圖 2、圖 3 及圖 4。

3 討論

圖1 不同濃度槐耳清膏對(duì)NCI-N87細(xì)胞Beclin-1mRNA表達(dá)水平影響

圖2 不同濃度槐耳清膏對(duì)NCI-N87細(xì)胞LC3-II mRNA表達(dá)水平影響

圖3 不同濃度槐耳清膏對(duì)NCI-N87細(xì)胞PTEN mRNA表達(dá)水平影響

圖4 槐耳清膏對(duì)NCI-N87細(xì)胞Beclin-1、LC3-II、PTEN蛋白表達(dá)影響

胃癌是消化道最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在因腫瘤而死亡的患者中，胃癌占第二位[7，8]。HER2在胃癌中的陽(yáng)性表達(dá)率為3.9%-51.1%，HER2的過(guò)表達(dá)與胃癌的Bormann分型、Lauren分型、腫瘤的分化程度、淋巴結(jié)的狀態(tài)、靜脈清潤(rùn)等有關(guān)，而與腫瘤的大小、清潤(rùn)的深度及腫瘤的分期無(wú)關(guān)[9]。

自噬不僅參與了正常細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育、同時(shí)也參與了細(xì)胞的成熟分化及死亡的調(diào)控，自噬活性的改變經(jīng)?？梢?jiàn)于一些腫瘤細(xì)胞，影響了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[4，6]。

大量研究表明，槐耳具有抗腫瘤活性，可以抑制血管及腫瘤形成、抗腫瘤耐藥、抑制癌轉(zhuǎn)移、激活免疫系統(tǒng)以及誘導(dǎo)凋亡等[10，11]。最近也有研究報(bào)告，槐耳清膏能誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生自噬及凋亡，其機(jī)制可能是通過(guò)抑制MTOR/S6K通路有關(guān)[12]，另有研究結(jié)果表明，槐耳清膏對(duì)胃癌MKN-45細(xì)胞增值及凋亡均有影響[13]，但能否影響her-2陽(yáng)性胃癌細(xì)胞自噬尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

在本研究中，我們以高表達(dá)her-2的NCI-N87胃癌細(xì)胞株為研究對(duì)象，通過(guò)研究不同濃度的槐耳清膏在處理細(xì)胞不同時(shí)間后，對(duì)NCI-N87細(xì)胞增殖、凋亡及相關(guān)自噬蛋白表達(dá)的影響。

研究中我們首先觀察到，大于4mg/ml濃度的槐耳清膏對(duì)于細(xì)胞的增殖具有明顯的影響，在我們觀察的24、48、72h內(nèi)，隨著時(shí)間延長(zhǎng)其抑制作用增加，呈現(xiàn)質(zhì)量濃度和時(shí)間的依賴關(guān)系。胞質(zhì)內(nèi)大量的酸性自噬小體形成是自噬的重要特征，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)自噬小體和細(xì)胞凋亡率均增加，且與濃度相關(guān)。上述的研究結(jié)果表明，槐耳清膏能影響NCI-N87增殖、凋亡及自噬，從而能在體外影響NCI-N87細(xì)胞，發(fā)揮抑癌作用。

有研究表明，細(xì)胞自噬受到自噬基因的調(diào)控，如 Beclin-1、LC3-II、PTEN。

有研究報(bào)道自噬相關(guān)蛋白Beclin-1在胃癌組織和正常組織中出現(xiàn)表達(dá)差異，正常組織陽(yáng)性表達(dá)高于胃癌組織，是與自噬相關(guān)的抑癌基因，它作為激活自噬信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白之一，可以調(diào)控凋亡信號(hào)通路，從而誘導(dǎo)癌細(xì)胞的凋亡[14]。并且進(jìn)一步的研究表明Beclin-1的蛋白表達(dá)水平也與胃癌組織的分化程度相關(guān)[15，16]。另外，自噬體的形成需要多種蛋白質(zhì)復(fù)合體和小分子的參與，其標(biāo)志性蛋白是LC3，LC3介導(dǎo)的自噬作用在胃癌中至關(guān)重要[17]。LC3共分為 LC3-I和 LC3-II兩型，其LC3-I和LC3-II的含量和比值變化能夠反映細(xì)胞的自噬活性[18]。在惡性程度高的胃癌患者中，Beclin-1表達(dá)呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)，而LC3-II的蛋白表達(dá)則呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)，兩者均與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[19]。而PTEN基因作為一個(gè)具有脂性磷酸酯酶活性的抑癌基因，可通過(guò)PI3KAKT-mTOR通路和PI3K/AKT通路抑制脂性磷酸酶活性，從而促進(jìn)細(xì)胞的自噬過(guò)程。因此，PTEN蛋白被認(rèn)為是誘導(dǎo)自噬發(fā)生的正向調(diào)節(jié)分子，這也提示了PTEN通過(guò)自噬對(duì)抑制胃癌的發(fā)生發(fā)展具有重大意義[20，21]。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)大于4mg/ml濃度的槐耳清膏作用 NCI-N87 24h 后，Beclin-1、LC3-II、PTEN在mRNA水平及蛋白水平均明顯升高，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且與濃度呈現(xiàn)正相關(guān)性。從上述結(jié)果我們推測(cè)，槐耳清膏可能影響自噬基因Beclin-1表達(dá)，同時(shí)增加PTEN表達(dá)，導(dǎo)致自噬發(fā)生，較高濃度的槐耳清膏效果明顯，但超過(guò)32mg/ml是否自噬效應(yīng)增加尚沒(méi)有試驗(yàn)結(jié)果證明。

綜上所述，槐耳清膏能夠在體外促進(jìn)NCIN87自噬和凋亡，同時(shí)能夠抑制NCI-N87細(xì)胞增殖，在一定的濃度及作用時(shí)間范圍內(nèi)兩者呈正相關(guān)關(guān)系。其可能的機(jī)制是槐耳清膏可能影響自噬基因Beclin-1表達(dá)，同時(shí)增加PTEN表達(dá)，導(dǎo)致自噬發(fā)生。由于自噬的機(jī)制甚為復(fù)雜，在本研究中槐耳清膏是否影響自噬相關(guān)信號(hào)通路改變，尚不清楚，能否在體內(nèi)發(fā)生抑瘤作用也是我們進(jìn)一步研究的方向。