小鼠痤瘡模型研究進(jìn)展

陳爾凈，劉曉偉，盧 丹，黃敏敏，葉陳庚，黃學(xué)嶸，陳永欣，周艷平

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)賽恩斯新醫(yī)藥學(xué)院，南寧 530200； 2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，南寧 530200)

痤瘡(acne)是一種由毛囊皮脂腺異常引起的慢性炎癥性疾病，青少年對(duì)其應(yīng)答率為80%[1-2]。嚴(yán)重的痤瘡與社交障礙、生活質(zhì)量下降、抑郁和自尊心下降有關(guān)[3]。痤瘡是一種常見的疾病，其發(fā)病機(jī)制具有多因素、多態(tài)性的特點(diǎn)。目前，大部分研究認(rèn)為痤瘡的發(fā)病與角化細(xì)胞增生、神經(jīng)肽P物質(zhì)(substance P， SP)表達(dá)異常、雄激素水平升高、皮脂腺功能亢進(jìn)、丙酸桿菌 (propionibacteriumacnes，P.acnes) 菌群異常誘導(dǎo)機(jī)體免疫反應(yīng)和局部炎癥的發(fā)生有關(guān)[4]。有研究表明，痤瘡患者皮脂成分變化主要包括白細(xì)胞介素-1(interleukin-1，IL-1)、CD3+和CD4+T細(xì)胞水平升高，早期亞臨床痤瘡病灶(微球蛋白)，脂肪酸比例升高[5-8]。小鼠痤瘡模型是目前研究痤瘡發(fā)病機(jī)制、臨床抗痤藥物的主要痤瘡模型之一，與其他的動(dòng)物相比，小鼠具有易飼養(yǎng)、實(shí)驗(yàn)成本低、容易獲得等優(yōu)點(diǎn)。本文旨在通過對(duì)近幾年國(guó)內(nèi)外的小鼠痤瘡模型的建模方法、適用范圍及優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行簡(jiǎn)要?dú)w納，以利于在痤瘡發(fā)病機(jī)制、抗痤藥物等相關(guān)研究中選擇適合的小鼠模型。

1 P.acnes誘導(dǎo)模型

1.1 小鼠炎性痤瘡模型

P.acnes是革蘭陽性厭氧菌，是痤瘡的主要病原菌。小鼠耳廓皮內(nèi)注射P.acnes菌懸液造成小鼠耳部感染，可模擬P.acnes菌群異常而引起的痤瘡?fù)獠勘憩F(xiàn)及炎性反應(yīng)，但痤瘡丙酸桿菌滅活后則無類似反應(yīng)[9]。小鼠體內(nèi)有低濃度的甘油三酯(triglyceride，TG)，TG可被P.acnes脂肪酶分裂成甘油和脂肪酸，從而促進(jìn)P.acnes生長(zhǎng)[10]。Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)蛋白家族的模式識(shí)別受體已被鑒定為P.acnes應(yīng)答受體，TLR2在P.acnes感染的角質(zhì)形成細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中的表達(dá)升高。TLR激活促進(jìn)了促炎細(xì)胞因子、趨化因子、前列腺素和白三烯的產(chǎn)生[11-12]。P.acnes通過依賴于TLR2的途徑誘導(dǎo)單核細(xì)胞因子的產(chǎn)生，還通過TRL2誘導(dǎo)白細(xì)胞介素-12(interleukin-12， IL-12)P40啟動(dòng)子活性的激活，誘導(dǎo)原代人單核細(xì)胞產(chǎn)生IL-12和白細(xì)胞介素-8(interleukin-8，IL-8)。此外P.acnes還可通過生成多種酶類物質(zhì)分泌大量活性產(chǎn)物，導(dǎo)致毛囊壁被破壞引起炎癥反應(yīng)[13]。因此，小鼠耳內(nèi)注射P.acnes的模型可代表毛囊破裂后的肉芽腫型痤瘡炎癥。

用PBS緩沖液配置濃度為6×107cfu/μL的P.acnes菌懸液，并皮內(nèi)注射到8周齡的雄性ICR小鼠的右耳，以誘導(dǎo)小鼠急性耳水腫，建立小鼠炎性痤瘡模型[14]。該模型表觀可見小鼠的耳部腫脹、發(fā)紅和紅斑，鏡下病理表現(xiàn)為巨噬細(xì)胞、CD45+白細(xì)胞和Ly6G+中性粒細(xì)胞等浸潤(rùn)性炎癥細(xì)胞的數(shù)量顯著增加[15]。該模型可導(dǎo)致小鼠耳內(nèi)局部細(xì)菌定植和炎癥，這與人類痤瘡病變相似，且因其簡(jiǎn)單方便、造模成功率高，常用于P.acnes導(dǎo)致痤瘡的機(jī)制及抗P.acnes藥物研究。然而小鼠鼠耳較小，建模過程容易貫穿鼠耳，這影響了對(duì)模型的表面觀察及鼠耳厚度檢測(cè)。另外有研究表明，小鼠耳朵炎癥反應(yīng)引起的繼發(fā)性改變是有限的，在小鼠背側(cè)注射P.acnes更容易觀察炎癥性痤瘡的初始過程[16]。

1.2 小鼠人造皮脂痤瘡模型

小鼠人造皮脂痤瘡模型是通過聯(lián)合應(yīng)用P.acnes接種和局部應(yīng)用與人皮脂成分極為相似的人造皮脂建立的小鼠痤瘡模型。人體皮膚的所有部位，除了手掌和足底部位外，都含有皮脂腺，并被皮脂膜覆蓋，且該皮脂膜主要由角鯊烯、蠟單酯、TG和脂肪酸組成。提前24 h剃除注射部位的鼠毛。實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，通過混合脂肪酸、TG、25%蠟單酯和角鯊烯制備人造皮脂，再向8周齡的CD-1雌性小鼠背部皮內(nèi)注射約50 μL濃度為1×107cfu/μL的P.acnes的菌液，注射后立即在小鼠注射部位涂抹20 μL新鮮人造皮脂，并每天重新涂抹，持續(xù)7 d[17-18]。人造皮脂可促進(jìn)皮內(nèi)注射P.acnes的痤瘡模型持續(xù)存在1周。此外，角鯊烯也大量存在于人皮脂中，且人類面部和背部的皮脂濃度最高，但不存在于小鼠皮脂中，并且角鯊烯在支持痤瘡生長(zhǎng)中的作用尚不清楚[19]。人造皮脂與P.acnes的聯(lián)合應(yīng)用可促進(jìn)痤瘡病理學(xué)的再現(xiàn)性和顯著性，但皮脂本身對(duì)皮膚病理學(xué)沒有影響[18]。然而，人造皮脂的不穩(wěn)定性及價(jià)格較貴，限制其在實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用。

1.3 生物工程人化痤瘡微環(huán)境模型

生物工程人化痤瘡微環(huán)境模型(bioengineering a humanized acne microenvironment model)是將真皮細(xì)胞捕獲系統(tǒng)(dermis-based cell-trapped system，DBCTS)作為支架與組織腔結(jié)合使用，利用P.acnes誘導(dǎo)小鼠發(fā)生免疫反應(yīng)的小鼠痤瘡模型。

利用DBCTS捕獲人皮脂細(xì)胞，并將捕獲的人皮脂細(xì)胞插入組織腔用以模擬皮脂腺。將含有人皮脂細(xì)胞的無菌組織腔皮下植入ICR小鼠腹部皮膚7 d后，以確保在皮下環(huán)境中完全被小鼠組織包裹；再將20 mL濃度為107cfu/mL 的P.acnes菌懸液注射到組織腔中誘導(dǎo)宿主免疫反應(yīng)，用于模擬體內(nèi)細(xì)菌感染[20-22]。人皮脂細(xì)胞包裹的DBCTS在小鼠體內(nèi)創(chuàng)造了一種人化痤瘡微環(huán)境模型，含有細(xì)胞釋放的蛋白質(zhì)的組織間充質(zhì)液可用于研究P.acnes、人皮脂細(xì)胞和小鼠免疫細(xì)胞之間的相互作用[23]。最重要的是，該模型可突破小鼠不能產(chǎn)生抗胸腺依賴性抗原的抗體的局限，用于篩選新的抗痤瘡藥物和疫苗[20]。然而人皮脂細(xì)胞的捕獲、組織腔植入等因素使造模重復(fù)性低、造模較慢，故其造模方法仍需加以改進(jìn)。

2 化學(xué)藥物刺激誘導(dǎo)模型

2.1 二甲苯誘導(dǎo)模型

二甲苯(xylene)是一種致敏劑和芳香刺激劑，在研究抗痤藥物的抗炎作用中被廣泛應(yīng)用。二甲苯的傷害作用主要是由瞬時(shí)受體電位香草酸亞型(transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1)受體激活介導(dǎo)的，但TRPV1不參與炎癥誘導(dǎo)作用，而是由SP通過激活血管內(nèi)皮細(xì)胞上的速激肽NK1受體誘導(dǎo)血漿蛋白外滲，而降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene-related peptide，CGRP)則誘發(fā)血管舒張，并增強(qiáng)SP在神經(jīng)支配區(qū)的促炎作用。此外，皮膚中的有機(jī)溶劑產(chǎn)生的活性氧和/或羰基物質(zhì)(carbonyl species)通過激活辣椒素敏感神經(jīng)末梢膜上的TRPV1通道參與炎癥反應(yīng)[24]。

將0.03 mL二甲苯注射入成年雄性BALB/C小鼠右耳前后葉，以誘導(dǎo)小鼠急性耳水腫，建立小鼠炎性痤瘡模型[25]。由于炎癥反應(yīng)激活引起的小鼠耳水腫使鼠耳重顯著增加，特征是疼痛、發(fā)熱、發(fā)紅和腫脹[26-27]。在組織病理學(xué)上，可檢測(cè)到嚴(yán)重的血管擴(kuò)張、皮膚水腫的改變和炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)、血漿蛋白外滲。二甲苯誘導(dǎo)小鼠炎性痤瘡模型建模快、重復(fù)性高，但只能反映急性炎癥早期階段的水腫化，因此該模型常通過評(píng)價(jià)血管通透性以研究抗痤藥物在體內(nèi)的抗炎作用。

2.2 巴豆油誘導(dǎo)模型

巴豆油中含有佛波酯(12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate，TPA)。TPA通過激活蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)，包括P38有絲分裂原激活蛋白激酶(P38 mitogen-activated protein kinase，P38MAPK)和核因子kB(nuclear factor-κB, NF-κB)，以及生成白細(xì)胞介素、角蛋白細(xì)胞衍生趨化因子等介質(zhì)，激活誘導(dǎo)磷脂酶A2酶促作用而發(fā)生炎癥，從而形成花生四烯酸代謝產(chǎn)物，如緩激肽、白三烯、前列腺素、IL-6、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)等促炎因子水平升高，以模擬痤瘡炎癥[28-30]。

通過在瑞士種雄性小鼠右耳涂抹20 μL 5%巴豆油，以誘導(dǎo)小鼠急性水腫，建立小鼠炎性痤瘡模型；通過每隔24 h在小鼠右耳涂抹20 μL 5%巴豆油誘導(dǎo)水腫，持續(xù)時(shí)間為9 d，以誘導(dǎo)小鼠慢性水腫，建立小鼠炎性痤瘡模型[31]。組織學(xué)檢測(cè)可見中性粒細(xì)胞和多形核白細(xì)胞的浸潤(rùn)、組胺和血清素的釋放以及血管通透性隨著水腫的形成而增加。巴豆油單次應(yīng)用可提供抗痤藥物在急性炎癥過程中抗水腫活性的數(shù)據(jù)，而巴豆油多次應(yīng)用可用于評(píng)估抗痤藥物慢性炎癥過程中的抗水腫活性，但巴豆油具有毒性，建模過程中應(yīng)注意防護(hù)。

2.3 角叉菜膠誘導(dǎo)模型

角叉菜膠(carrageenan，CG)是一種強(qiáng)化學(xué)物質(zhì)，用于刺激釋放炎癥和促炎介質(zhì)(包括前列腺素、白三烯、組胺、血清素、緩激肽和TNF-α)。炎癥的初始階段(0～1 h)是由組胺、5-羥色胺和緩激肽釋放引起的[32]。CG注射到后爪中可誘導(dǎo)進(jìn)行性水腫在3 h內(nèi)炎癥指數(shù)達(dá)到峰值，注射后3 h，被炎癥級(jí)聯(lián)的一些抑制分子調(diào)節(jié)，炎癥在24～72 h內(nèi)消退[33]。CG引起的急性炎癥反應(yīng)以液體和血漿蛋白滲出為特征[34]。小鼠足跖皮下注射CG后，由于前驅(qū)炎癥因子釋放在爪子組織的作用，小鼠足趾出現(xiàn)水腫、痛覺過敏和紅腫。通過將30 μL 濃度為1% 的CG注射KM種小鼠足底，以誘導(dǎo)小鼠足腫脹，建立小鼠炎性痤瘡模型[35]。該模型具有高度的重復(fù)性，常用于研究與炎性痤瘡相關(guān)的吞噬細(xì)胞浸潤(rùn)和自由基產(chǎn)生過量以及如TNF-α、環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶等炎癥介質(zhì)釋放的炎癥階段[36]。

2.4 2,4-二硝基氯苯誘導(dǎo)模型

2,4-二硝基氯苯(2,4-dinitrochlorobenzene，DNCB)是一種環(huán)己酰亞胺苯，DCNB可通過產(chǎn)生過敏原特異性抗體的I型超敏反應(yīng)誘導(dǎo)體液免疫反應(yīng)[46]。小鼠皮膚暴露于DNCB可由皮膚固有免疫的激活引起致敏階段，以模擬痤瘡炎癥中因固有免疫引起的炎癥反應(yīng)[38]。

在實(shí)驗(yàn)前24 h，剃除5周或6周齡的BALB/C種雌性小鼠的背毛。在第0天和第4天，用無菌涂藥器將100 μL 1%DNCB涂抹在小鼠剃毛區(qū)域，以建立小鼠痤瘡模型。實(shí)驗(yàn)階段，用涂藥器將100 μL 0.2% DNCB涂抹至小鼠剃毛區(qū)域，每周兩次，持續(xù)3周，以維持該模型[39]。此外，也可將1% DNCB涂抹于小鼠耳部建立小鼠痤瘡模型[40]。在小鼠背側(cè)皮膚上反復(fù)應(yīng)用涂抹DNCB后，可出現(xiàn)紅疹、結(jié)痂和免疫器官水腫，血清CD4+和CD8+值升高，胸腺指數(shù)、脾指數(shù)有明顯升高[41-42]。DNCB致敏通常被用作誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)免疫的方法，該模型常用以研究抗痤藥物對(duì)痤瘡中的免疫性炎癥反應(yīng)的干預(yù)作用。

3 雄激素誘導(dǎo)模型

雄激素(androgen)是所有調(diào)節(jié)皮脂分泌的激素中最重要，可刺激皮脂的產(chǎn)生和痤瘡的形成。皮膚中的雄激素的局部過量分泌和/或雄激素受體的高表達(dá)，通過過氧化物酶體增殖物激活受體-C受體來調(diào)節(jié)表皮生長(zhǎng)和脂肪細(xì)胞分化，而導(dǎo)致皮脂細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞的增值/分化，促使痤瘡形成。皮脂的雄激素依賴性分泌由睪酮(testosterone，T)、二氫睪酮(dihydrotestosterone，DHT)等雄激素介導(dǎo)。T主要通過局部轉(zhuǎn)化為DHT通過1型5α-還原酶影響皮脂腺[43]。小鼠雄激素代謝酶活性升高，可使DHT增多，導(dǎo)致皮脂腺增生[44]。

對(duì)SPF級(jí)KM種雄性小鼠隔日肌肉注射丙酸睪酮0.1 mL，造模時(shí)間持續(xù)14 d，建立小鼠痤瘡模型[45]。結(jié)果顯示，小鼠血清睪酮、精囊腺指數(shù)、前列腺指數(shù)均明顯升高。該模型常用于評(píng)價(jià)抗痤藥物對(duì)雄激素分泌調(diào)控效應(yīng)。此外，還可以將人面部全厚皮膚移植到成年雄性CD-1裸鼠上。移植4周后，通過植入充滿T或DHT的導(dǎo)管給裸鼠注射雄激素，建立人皮脂腺的小鼠痤瘡模型。在人面部全厚皮膚移植到成年雄性裸鼠前至少閹割1周，以進(jìn)一步控制影響皮膚移植的內(nèi)分泌環(huán)境。該模型可以研究雄激素導(dǎo)致痤瘡的機(jī)制，也可用于研究抗痤藥物對(duì)雄激素水平異常造成痤瘡的療效[46]。

4 結(jié)語

目前，小鼠痤瘡模型的造模方式多由家兔、大鼠等痤瘡動(dòng)物模型改進(jìn)而來，雖然從痤瘡臨床病癥特點(diǎn)吻合度與癥狀模擬特點(diǎn)觀察而言，小鼠模型相對(duì)不具優(yōu)勢(shì)，但小鼠模型在P.acnes定植與炎癥方面優(yōu)于家兔。而具有重復(fù)性好、造?？?、成本低、易獲得性更高的小鼠痤瘡模型在大規(guī)?？桂钏幬锖Y選中比大鼠痤瘡模型更具優(yōu)勢(shì)。不同的小鼠痤瘡模型具有不同的研究用途，因痤瘡發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性，并沒有一種小鼠痤瘡模型能夠完全模擬人類痤瘡的臨床表現(xiàn)和病理、生化變化。小鼠痤瘡模型難以模擬痤瘡的黑頭粉刺癥狀，而家兔模型、墨西哥無毛犬模型則可模擬，因此痤瘡模型的聯(lián)合應(yīng)用有利于提高痤瘡研究的可信度。利用生物工程的方法使小鼠痤瘡模型能夠從多方面反映痤瘡的表現(xiàn)的急性/慢性小鼠痤瘡模型是其研究方向。炎癥是痤瘡模型的核心，對(duì)痤瘡炎癥因子抑制劑的靶向研究是痤瘡治療的新方向，而建立一個(gè)完善的炎性痤瘡小鼠模型對(duì)于研究痤瘡的防治具有重大意義。此外，不同的小鼠品種表現(xiàn)出反映人類痤瘡早期炎癥反應(yīng)的變化的能力不同，HR-1小鼠更適合于建立炎性痤瘡小鼠模型[16]。完善小鼠痤瘡模型將推動(dòng)痤瘡發(fā)病機(jī)制和抗痤藥物的研究，此必對(duì)人類攻克痤瘡難題具有重要意義。