腸致病性大腸桿菌改變腸道上皮細胞極性的研究進展

王玉波1，徐倩倩，郭時金，王艷萍，張 穎，楊麗梅，沈志強

在發(fā)展中國家，腸致病性大腸桿菌(enteropathogenicEscherichiacoli，EPEC)經常引發(fā)嬰兒腹瀉。EPEC感染分為以下幾步：第一，粘附到宿主細胞引起黏附/消除損傷，并伴隨著微絨毛的消失；第二，利用Ⅲ型分泌系統(tǒng)(type III secretion system，T3SS)將細菌效應蛋白傳遞到宿主細胞內部；第三，激動蛋白基座形成[1]。腸道上皮細胞在防御EPEC入侵過程中發(fā)揮重要作用。腸道上皮細胞側膜的頂端部分含有連接復合體，包括緊密連接(tight junctions，TJs)、黏著連接和細胞橋粒。細胞橋粒和黏著連接機械性地與相鄰細胞連接，而緊密連接在腸腔和單層上皮細胞漿膜側形成了可調節(jié)的屏障(屏障功能)。細胞頂端-基底極性對于細胞功能的發(fā)揮具有重要作用，主要表現在：細胞形態(tài)的維持、定向囊泡運輸、離子和溶質運輸、蛋白和脂類在特異性膜位點的定位等[2-3]。緊密連接通過限制上皮細胞膜頂端和基底側的自由活動維持細胞極性，從而直接幫助水分、電解質和營養(yǎng)的移動(柵欄功能)。本文主要闡述了緊密連接在維持上皮細胞極性中的作用、腸致病性大腸桿菌對緊密連接的破壞作用、腸致病性大腸桿菌對上皮細胞極性的影響及其作用機制。

1 緊密連接與上皮細胞極性

上皮細胞在防御病原微生物入侵中發(fā)揮了重要作用。緊密連接位于側膜頂端部位，負責填充上皮細胞間的孔隙[4]。TJs通過調節(jié)跨上皮水和溶質流動控制細胞滲透性，通過限制頂端和側面細胞質膜成分混合維持頂端-基底極性[5]。

TJs由跨膜蛋白和調節(jié)蛋白構成?？缒さ鞍装ㄩ]合蛋白、閉鎖蛋白、tricellulin、MarvelD3，和連接粘附分子-A(junctional adhesion molecule-A，JAM-A)，用于維持TJ鏈結構，控制細胞滲透性，調節(jié)屏障功能，參與黏附和免疫系統(tǒng)細胞遷移；調節(jié)蛋白包括正閉鎖小帶蛋白-1(zonula occludens 1，ZO-1)、ZO-2、ZO-3、扣帶蛋白、膜關聯(lián)鳥苷酸激酶轉化蛋白-1(membrane—associated guanylate inverted 1，MAGI-1)、MAGI-3和MUPP-1，將跨膜蛋白連接于細胞骨架。細胞骨架蛋白(ARP2/3、N-WASP、皮動蛋白和VASP)，激動蛋白調節(jié)因子(RhoA、Rac和小GTP酶CDC42家族)，轉錄因子和非肌肉肌球蛋白II(nonmuscle myosin II，NMII)定位于緊密連接，調節(jié)不同的信號通路[5]。

TJs對于上皮細胞頂端-基底極性的形成和維持至關重要，通過三種極性復合物控制。Crumbs復合物包括Crumbs(CRB)，Lin-7相關蛋白(PALS1)和PALS1相關緊密連接蛋白(PATJ)。Par復合物由分隔缺陷類似物3和6(partitioning defective homologue 3 and6，PAR3/PAR6)，非典型的蛋白激酶C(atypical protein kinase C，aPKC)和CDC42構成。第三個復合物由Scribble、幼蟲巨大致死性基因(lethal giant larvae，Lgl)、disc large(Dlg)構成。它們共同維持著細胞頂端-基底極性，從而維持細胞形態(tài)、囊泡定向運輸，離子和電解質轉運以及蛋白質和脂質特異性定位于不同的膜位點[2]。

PAR6/aPKC復合物引起了特別關注，PAR6作為支架蛋白與其他所有極性復合物相互作用，使PKC能夠將以此激酶為底物的極性蛋白磷酸化。PAR與CDC42-GTP相互作用激活PKC使PAR3磷酸化，導致TJ蛋白聚集和細胞極性的建立[6]。PAR6與PALS1和CRB3相互作用，CRB3是aPKC的靶蛋白，該復合物對于TJ形式非常重要[7]。PAR6與側面極性蛋白Lgl相互作用，促使aPKC磷酸化及Lgl從頂膜排出，使頂端-基底進一步極性化，促進上皮連接形成[8]。由上可知，TJ和極性蛋白之間存在復雜的相互作用以構成并維持TJ結構和功能以及頂端-基底極性，保證細胞結構和功能完整。

2 EPEC破壞TJs

EPEC通過Ⅲ型分泌系統(tǒng)(type III secretion system，T3SS)將細菌效應蛋白傳遞到宿主腸道上皮細胞，引發(fā)腹瀉。EPEC破壞腸道上皮細胞TJ結構，導致腸道上皮細胞屏障和門控功能改變[9-13]。EPEC介導的TJs破壞引發(fā)宿主細胞多種改變：蛋白-蛋白相互作用的解離；TH蛋白claudin-1、occludin和ZO-1分布紊亂；側膜出現異常鏈導致屏障功能丟失[14]。EPEC效應因子，特別是EspF、Map、NleA和EspG對TJ混亂方面已有諸多研究。EspF將TJ內occludin重新定位，減弱了經上皮細胞電阻(transepithelial electrical resistance，TER)，增加了T84單層細胞的通透性[9]。在小鼠感染模型中顯示，EspF也能破壞TJs體內結構[15]。EPEC感染小鼠回腸和結腸顯示閉鎖蛋白呈現顯著的再分布和屏障功能的消失，說明其在EPEC致病性中的作用[9, 11]。

Map調節(jié)上皮屏障功能也在EPEC引發(fā)腹瀉中發(fā)揮作用。Map與鈉氫交換體調控因子Ⅰ和Ⅱ(Na+/H+exchanger regulatory factors I 和II，NHERF1/2)相互作用，調節(jié)腸道離子通道[15]。敲除map可減弱EPEC誘導的Caco-2單層細胞TER下降[10]。Citrobacterrodentium是與EPEC相似的鼠病原，小鼠感染敲除map的Citrobacterrodentium菌株，與野生型C.rodentium引起的腹瀉相比，腹瀉嚴重程度明顯降低，說明map在腸道離子和水轉運中發(fā)揮重要作用[16]。Map在MDCKⅡ細胞中組成型表達增強了帶電荷和不帶電荷分子的通透性，表明門控功能的失效[17]。

NleA使ZO-1和閉鎖蛋白重新分配，引起腸道單層細胞中TER快速降低。NleA結合并抑制COPⅡ蛋白復合物，該復合物參與蛋白從內質網到高爾基體的包裝和運輸[18]。感染C.rodentium鼠模型顯示，去除NleA與COPⅡ復合物相互作用能夠抑制ZO-1和閉鎖蛋白的重新分布并減少野生型菌株引起的細胞滲透性增強，說明NleA能夠通過阻止新合成的TJ蛋白到達頂膜來影響TJs[19]。

EspG使TER減少，調節(jié)上皮細胞粒度選擇滲透性[12]。EspG破壞微管網絡表現在閉鎖蛋白在細胞質的蓄積和TJ恢復的延遲，表明EspG阻止TJ修復[20]。

3 EPEC引起細胞頂端-基底極性消失

EPEC對宿主腸道上皮細胞極性的影響多采用間接研究。Muza-Moons等采用T84腸道上皮細胞證明EPEC感染導致兩種底外側蛋白，β1-整聯(lián)蛋白和Na+/K+ATP酶有序地重新分布到頂端部分。β1-整聯(lián)蛋白是一種細胞黏附分子，參與將極性上皮細胞錨定到底膜。整合素類在極性的形成中發(fā)揮了重要作用。

EPEC外膜蛋白和主要黏附因子intimin與EPEC Tir(translocated intimin receptor，Tir)相互作用。intimin能夠與宿主蛋白β1-integrin相互作用，但這種蛋白位于極性上皮細胞底外側，因此不能與腸道EPEC接觸。然而EPEC感染促使β1-integrin移到頂端位置，從而可以與intimin相互作用。敲除Tir的EPEC感染極性單層上皮細胞對TER沒有影響。在極性已改變，β1-integrin已到達頂端的單層細胞，TER下降與野生型EPEC引起的下降相似，表明了其在EPEC致病中改變極性的作用[21]。

腸道內有效的離子轉運有賴于細胞極性。Na+/K+ATP酶通過底外側膜轉運三種細胞內Na+和兩種胞外K+。這種電化學梯度對于小腸和結腸電解質和水轉運非常重要[22]。EPEC感染影響多種腸道轉運體，包括鈉氫交換體3(NHE3)和腺瘤下調(down regulated in adenoma，DRA)，造成離子和水分丟失，引發(fā)腹瀉[23]。EPEC還擾亂Na+/K+ATP酶在底外側的定位，甚至將其他離子轉運體和通道重新分配于頂膜位點[14, 21]，可能與EPEC的病理生理學有關。

除了底外側蛋白重新分布，EPEC感染還導致ZO-1，閉鎖蛋白和claudin-1從TJ區(qū)轉移到側膜和細胞質，這就造成了結構/分子相關性屏障功能的丟失。EPEC感染單層細胞冷凍斷裂復型揭示了異常鏈沿著側膜表面延伸TJ區(qū)下方，表明TJ區(qū)域的普遍性改變。這些結構改變與細胞滲透性增加和TER減少都有關系[14]?；鶄饶ず蚑H蛋白的再分布和異常TH鏈的出現表明頂端-基底極性的消失。EPEC誘導的TJ結構和頂端-基底極性的擾亂使得其他細胞質和膜蛋白自由擴散到非正常細胞位點，進一步增強了EPEC的致病性。

4 EPEC對Par極性復合物的影響

EPEC感染T84細胞增加PKC-ζ酶活性，并促使其從細胞質轉移到含有不溶性碎片的膜蛋白[24]。aPKC激酶的激活增加了CDC42與PAR6/aPKC結合，這是Par極性復合物調節(jié)的關鍵步驟。EPEC效應因子Map激活CDC42 GTPase，促使絲足的形成[25]和CDC42活化，可能在改變aPKC活性中也發(fā)揮作用。細胞質銜接蛋白14-3-3家族也參與細胞信號傳導。PAR3磷酸化后能通過aPKC比較容易地與14-3-3結合，破壞這種相互作用會導致上皮細胞極性消失，說明14-3-3/PAR3調節(jié)Par極性復合物的活性[26]。在T84單層細胞，EspF與14-3-3ζ和細胞角蛋白-18(CK-18)相連[27]，支持了EPEC通過其效應因子調節(jié)Par復合物的假說。

EspG破壞微管并延遲EPEC感染引發(fā)的TJs損傷的修復[20]。EspG與ADP-核糖基化因子(ADP-ribosylation factor，ARF)和P21-激酶(p21-activated kinase，PAK)結合位點RAC/CDC42相結合[28]。PAK家族作用于RAC1和CDC42 GTP酶下游，調節(jié)細胞骨架動力學和細胞移動。雖然EspG與ARF和PAK之間的相互作用對微管損傷沒有影響[20]，但其對頂端-基底極性的影響則未見報道。

除了EPEC效應因子對Par極性復合物的直接作用，可能還存在黏附底座引起的間接作用。例如，EPEC感染過程中，Tir被直接注入宿主細胞，在細胞內磷酸化并將肌動蛋白聚合物募集于細菌結合位點[29]。Tir與CK-8和CK-18相互作用并將它們募集到EPEC誘導的底座。細胞角蛋白是中間絲(intermediate filaments，IF)的必須部分，在上皮細胞極化中發(fā)揮了重要作用。例如，CK-8基因敲除小鼠顯示aPKC下調，突觸融合蛋白3和頂膜蛋白(堿性磷酸酶、蔗糖異麥芽糖酶、囊性纖維化跨膜傳導調節(jié)因子)消失，微管紊亂，離子轉運缺陷及離子轉運體對細胞隔室脫靶[30]。14-3-3蛋白與CK-8和CK-18結合，CK-18的磷酸化對其與Ser33的結合至關重要[31-32]。EspF與CK-18相互作用，EPEC感染增加了CK-18的溶解性，導致EPEC感染上皮細胞IF網絡的架構發(fā)生劇烈變化。敲除espF能破壞EPEC誘導的CK-18溶解性和IF形態(tài)學改變[27]。EspF與14-3-3ζ/CK-18以時間依賴性形成復合物。因此我們推斷，EspF通過與14-3-3ζ/CK-18結合在細胞極性破壞中發(fā)揮作用。以上結果說明，EPEC效應因子協(xié)同作用，通過在空間上和時間上多角度多步驟的調控的方式破壞細胞極性。

5 展 望

大量研究強調了細胞間連接在頂端-基底極性維持中的作用，反之亦然，說明兩類分子復合物之間存在交互對話。EPEC對上皮細胞破壞作用的研究較多，而EPEC對頂端-基底極性的研究較少。我們討論了EPEC是如何通過異常調節(jié)多種因素來改變上皮細胞極性，包括腸道屏障的破壞、粘附和極性蛋白的重新分布、極性復合物向感染位點的募集，所有這些都會破壞頂端基底極性。TJs完整性和細胞極性的改變可能是病原體感染性疾病發(fā)生過程中的重要步驟。微生物對上皮細胞穩(wěn)態(tài)方面的影響還需進一步研究。

利益沖突：無

本文引用格式：王玉波, 徐倩倩, 郭時金, 等. 腸致病性大腸桿菌改變腸道上皮細胞極性的研究進展[J]. 中國人獸共患病學報, 2019,35(4):350-354. DOI: 10.3969/j.issn.1002-2692.2019.00.037