冷誘導RNA結(jié)合蛋白生物學功能的研究進展

陳靈修 王世波

(重慶三峽中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科，重慶404000)

1 CIRP的發(fā)現(xiàn)及分子結(jié)構(gòu)

CIRP最早是在1997年由Nishiyama等[1]在研究基因轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)現(xiàn)，并在小鼠睪丸細胞中分離鑒定。研究學者又在小鼠、非洲爪蟾、大鼠、墨西哥美西螈、牛蛙、鮭魚等多種生物細胞中發(fā)現(xiàn)了CIRP的表達。人CIRP基因定位于第19號染色體p13.3位點上，人和大鼠的GenBank/EMBL/DDBJ 序列號分別是D78135[2]和AB0062[3]。

CIRP由172個氨基酸殘基組成，分子量約18 kD。其核酸結(jié)構(gòu)和氨基酸結(jié)構(gòu)都高度保守,具有較高同源性，屬于RNA結(jié)合蛋白異源核糖核蛋白hnRNP a18。CIRP蛋白有氨基末端的共有序列RNA識別區(qū)(RNA recognition motify,RRM)和羧基末端的甘氨酸富含區(qū)重復序列(Glycine-richdomain,GRD)。前者包含兩個高度保守的核糖核蛋白序列：一個為八聚體(核糖核蛋白1，RNP1)；另一個為六聚體(核糖核蛋白2，RNP2)，其序列分別為：(K/R)G(F/Y)(G/A)FVX(FY)and(L/I)(F/Y)(V/I)(G/K)(G/N)L[4]，此區(qū)域與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控有關(guān)。后者是一段重復出現(xiàn)的精氨酸-甘氨酸-甘氨酸重復序列[5]，目前對其功能尚不了解，推測其可能參與了CIRP胞內(nèi)定位及與其他蛋白質(zhì)的相互作用。

2 CIRP的表達及定位

CIRP作為一種RNA結(jié)合蛋白，可以在多種細胞及多個器官中表達，且其表達在應(yīng)激原的作用下升高或降低。如Nishiyama等[6]在K562、NEC8、HepG2、HeLa、T24和NC65細胞中發(fā)現(xiàn)了CIRP的表達；Danno等[7]檢測了常溫下人體胰腺、甲狀腺、腎上腺、睪丸和胎盤細胞中CIRP的表達情況，結(jié)果顯示CIRP在上述細胞中均有少量表達；Xue等[2]在大鼠腦、肺臟、肝臟、腎臟、結(jié)腸、胃等器官中CIRP于常溫有低水平表達。不僅如此，CIRP的表達強度與溫度密切相關(guān)，降低溫度可使其表達增加[8]，而升高溫度則導致其表達降低[9]。據(jù)研究，CIRP的表達與動物冬眠有密切關(guān)系(CIRP在冬季表達水平明顯升高，反之在夏季表達量則明顯降低，這恰好與動物冬眠的時期相對)[10]，陰囊的溫熱環(huán)境亦可降低CIRP表達水平并影響小鼠精子DNA的完整性[11]。

CIRP最初是Nishiyama等[1]在人和小鼠多種細胞核中被檢測發(fā)現(xiàn)的。而Matsumoto等[3]在非洲爪蟾卵母細胞質(zhì)中也檢測到了CIRP的表達。此外，研究者在人精子細胞的胞質(zhì)中也檢測到了CIRP的表達[12]，且發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌 RKO 細胞株中，CIRP在紫外線照射條件下從細胞核轉(zhuǎn)位到了細胞質(zhì)。有研究也證實在應(yīng)激原的刺激下，CIRP在其精氨酸甲基化的作用支配下，被誘導出核并在細胞質(zhì)中積累[13]。綜上我們推測CIRP的細胞定位不是固定的，而是取決于細胞類型及細胞狀態(tài)。

3 CIRP與應(yīng)激反應(yīng)

應(yīng)激反應(yīng)是一種全身性的、復雜的適應(yīng)性反應(yīng)，具體指機體在受到強烈有害刺激時，所產(chǎn)生的交感神經(jīng)興奮、丘腦下部-腦垂體-腎上腺皮質(zhì)系統(tǒng)活動增強等一系列神經(jīng)內(nèi)分泌改變。適當?shù)膽?yīng)激對機體而言具有適應(yīng)性的保護意義。不過，過度的應(yīng)激反應(yīng)對動物體也會造成損傷，即所謂的適應(yīng)性疾病(如應(yīng)激性潰瘍、應(yīng)激性糖尿病等)。因此深入研究應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展及相關(guān)調(diào)控機制，促使機體能夠在有效進行保護性應(yīng)激的同時，最大限度降低其病理性應(yīng)激所帶來的傷害，無疑對人們的日常生活及臨床患者的治療均具有一定的指導意義。迄今為止，多項研究表明，眾多環(huán)境因素可上調(diào)CIRP的表達，并且過表達的CIRP在低溫[14]、缺氧[15]、紫外線[16]、高滲[17]等應(yīng)激條件下發(fā)揮了重要的細胞保護作用。

3.1CIRP與低溫應(yīng)激 CIRP作為一種應(yīng)激反應(yīng)蛋白，伴隨著多種生物應(yīng)激條件過量表達，而冷應(yīng)激是第一個被發(fā)現(xiàn)能誘導CIRP過表達的應(yīng)激條件[18]。研究證實CIRP的表達強度與低溫高度密切相關(guān)，小鼠CIRP 基因表達水平在溫和冷刺激下(32～18℃)其表達呈低溫依賴性，即隨溫度的降低其表達逐漸升高,相反其表達水平在熱處理(39℃或42℃)條件下明顯降低[8]。研究者通過體外細胞培養(yǎng)(K562、NC65 、HepG2 等細胞系)，CIRP在冷應(yīng)激后1～3 h被檢測發(fā)現(xiàn)，12 h表達水平達高峰，據(jù)此推測CIRP可能是亞低溫環(huán)境中最早的應(yīng)激產(chǎn)物，在冷應(yīng)激反應(yīng)過程中發(fā)揮著重要作用。這一論斷被后續(xù)研究證實：CIRP在低溫環(huán)境下不僅可抑制環(huán)已酞亞胺和TNF-γ介導的細胞凋亡[14]，還能有效抑制H2O2誘導的神經(jīng)元細胞凋亡[19]。此外，大腸桿菌對低溫的適應(yīng)能力被來源于擬南芥的 CIRP蛋白顯著提高[20]。這充分表明CIRP在冷應(yīng)激過程中扮演了積極有利的角色。

3.2CIRP與缺氧應(yīng)激 在海平面自然狀態(tài)下，平靜呼吸氧濃度為21%的空氣時，機體不同組織的氧含量具有明顯異質(zhì)性[21]。與正常氧含量相比，缺氧可誘發(fā)多種急慢性損傷、甚至疾病(包括腫瘤)[22]。既往研究發(fā)現(xiàn)，低氧調(diào)控的mRNA與低溫調(diào)控的mRNA具有相同的組成元件，即內(nèi)部核糖體進入位點(Internal ribosome entry site，IRES)。當外界刺激因素發(fā)生變化時，絕大部分蛋白的mRNA翻譯水平和翻譯效率受到抑制，然而含有IRES元件的mRNA翻譯仍可以有效且高效進行[23]。此外，Wellmann等[24]發(fā)現(xiàn)CIRP的基因序列中含有低氧誘導因子(Hypoxia-inducible factor 1，HIF-1)共有序列結(jié)合位點。并且，低氧環(huán)境可通過線粒體依賴機制和HIF-1不依賴機制誘導CIRP的表達。相反，Zhang等[25]利用神經(jīng)干細胞建立缺血缺氧模型發(fā)現(xiàn)輕度低氧(8%)可通過上調(diào)ROS進一步誘導CIRP的高表達，而重度缺氧(1%)卻由于超載的ROS抑制了CIRP的表達引起細胞周期停滯，進而阻斷了神經(jīng)干細胞的增殖。綜上，我們推測低氧調(diào)節(jié)的CIRP表達呈劑量依賴性。

3.3CIRP與紫外線及滲透壓應(yīng)激 大量研究證實CIRP在紫外線(UV)照射和高滲透壓環(huán)境下發(fā)揮著細胞保護效應(yīng)[12,23]。 具體機制如下：當細胞受到UV損傷后，CIRP的C-端發(fā)生甲基化從細胞核運動至細胞質(zhì)，并綁定靶向mRNA的3′UTR，通過與翻譯元件的相互作用來參與DNA的損傷修復、轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)及增加蛋白質(zhì)翻譯，從而發(fā)揮細胞保護作用。

3.4CIRP與其他應(yīng)激 除上述因素外，毒素和藥物也能促進CIRP的表達。如神經(jīng)毒素多糖酸可誘導小鼠大腦CIRP的表達[26]，LPS可上調(diào)魚體內(nèi)CIRP mRNA表達[27]。此外，研究表明纖維素樣生長因子21(FGF21)和胰島素樣生長因子(IGF-1)對CIRP和RBM3的表達也有一定促進作用[28,29]。

4 CIRP的生物學功能與疾病

4.1CIRP與生物節(jié)律 1998年，Nishiyama等[9]檢測了小鼠腦中CIRP蛋白24 h內(nèi)的表達情況，結(jié)果顯示不同時間的CIRP呈現(xiàn)不同表達趨勢：下午6點其表達量最高，下午6點至凌晨3點其表達量逐漸降低，隨后又慢慢回升?？傮w表明CIRP的表達存在晝夜節(jié)律，即白天表達升高，夜間開始下降。2012年，Morf等[30]將CIRP和CLOCK基因定義為“晝夜節(jié)律基因”，并揭示了其在體溫節(jié)律性變動影響下表達的分子機制：溫度變化引起CIRP的節(jié)律性表達，編碼不同晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)器蛋白的RNA通過與CIRP結(jié)合，以此增強自身的穩(wěn)定性，并提高自身翻譯效率。此外，Bellesi等[31]及Nikonova等[32]對機體睡眠和覺醒狀態(tài)下基因表達情況進行相關(guān)研究，均發(fā)現(xiàn)CIRP在睡眠相表達明顯上調(diào)，而在覺醒狀態(tài)表達顯著降低。綜上，我們推測CIRP在動物晝夜節(jié)律、睡眠/覺醒周期等生物節(jié)律的調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮重要作用。

4.2CIRP與生殖 CIRP蛋白最初是由Nishiyama等[1]在睪丸細胞中發(fā)現(xiàn)的，且在進一步研究中發(fā)現(xiàn)CIRP在初級精母細胞中呈現(xiàn)過量表達，熱處理6 h后其表達下降，提示CIRP在初級精母細胞中具有特殊作用。Banks等[33]也發(fā)現(xiàn)了陰囊的溫熱環(huán)境在下調(diào)CIRP的表達，同時影響小鼠精子DNA的完整性，進一步提示在精子的發(fā)生過程中CIRP具有非常重要的作用。因此我們研究不同溫度下睪丸中CIRP的表達狀況將有助于闡明雄性不育的分子機制。

4.3CIRP與胚胎發(fā)育 盡管我們對CIRP在胚胎發(fā)育期間所起的作用還不十分了解,但是早前研究已經(jīng)證實CIRP存在于兩棲動物卵母細胞質(zhì)中[3],后來又被精確定位于假定的神經(jīng)組織和原腎(兩棲動物幼蟲時期的最初級排泄器官)或胚腎內(nèi)，且在原腸胚期表達量快速增加。2006年，Peng等[34]研究證實，在非洲爪蟾胚胎發(fā)育期間,CIRP參與了其原腎特化和胚胎細胞移行過程。這提示CIRP可能在動物胚胎發(fā)育過程中起著重要作用。

4.4CIRP與腦部疾病 CIRP在低溫中的神經(jīng)保護作用已被肯定。諸多研究證實亞低溫不僅在急性缺血性疾病[35]和外傷性脊髓損傷[36]中有效降低原發(fā)損傷，積極抑制其帶來的二次傷害，而且在慢性神經(jīng)退行性疾病[37]延緩其疾病進程。研究者通過體外培養(yǎng)原代神經(jīng)細胞和嗜鉻細胞瘤PC12細胞株，發(fā)現(xiàn)低溫誘導的CIRP過表達具有抗細胞凋亡的作用[39]。

然而，CIRP在缺血性腦損傷中的作用卻存在爭議。早期，在大鼠腦缺血-再灌注模型中[2]，研究者利用原位雜交、免疫組化等方法發(fā)現(xiàn)再灌注后3～6 h，海馬中CIRP mRNA表達明顯減少，大腦皮質(zhì)中的CIRP mRNA即使灌注后48 h也無明顯變化；然而在同樣的大鼠腦缺血-再灌注模型中，Liu等[40]利用real-time PCR法檢測發(fā)現(xiàn)在大鼠皮層腦缺血后24 h，CIRP mRNA逐漸增加至5倍；與局部缺血相比，低溫處理24 h后，CIRP mRNA的表達增至30倍，而低溫和缺血共同刺激下，CIRP mRNA的表達亦不超過30倍；另在32℃低溫條件下培養(yǎng)的PC12細胞中，CIRP mRNA表量顯著增加；這種CIRP的過表達現(xiàn)象可因培養(yǎng)液中外加H2O2而呈劑量依賴性抑制。此外，大量研究證明，腦缺血后產(chǎn)生的過量ROS(H2O2的代謝產(chǎn)物)可致腦損傷加重[41]，而H2O2下調(diào)CIRP表達可能是ROS引起腦損傷的作用機制之一。當內(nèi)源性CIRP合成增多或人為上調(diào)的表達可顯著抑制H2O2引起的神經(jīng)細胞凋亡[42]。這些結(jié)果充分說明CIRP具有神經(jīng)保護作用。但后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)釋放入循環(huán)系統(tǒng)的CIRP蛋白與損傷性免疫應(yīng)答密切相關(guān)。Zhou等[43]通過體內(nèi)外實驗發(fā)現(xiàn)，腦缺血后小腦膠質(zhì)細胞分泌的CIRP可通過介導的TNF-α表達導致神經(jīng)炎癥，并引起神經(jīng)元損傷。另研究者在小鼠酒精誘導大腦炎癥模型中也發(fā)現(xiàn)酒精可促進小腦膠質(zhì)細胞CIRP的表達及分泌，通過上調(diào)炎癥因子TNF-α和IL-1β誘發(fā)神經(jīng)炎癥[44]。這些研究結(jié)果提示CIRP在大腦缺血再灌注損傷中存在保護和加重損傷的雙重功能：一方面，只要CIRP存留于細胞內(nèi)，其可抑制損傷引起的神經(jīng)細胞凋亡；另一方面，一旦CIRP被釋放入血則可引起嚴重的神經(jīng)炎癥反應(yīng)。

4.5CIRP與腫瘤 既往研究發(fā)現(xiàn)，在肝細胞肝癌(HCC)中，CIRP通過介導ROS的累積和腫瘤干/祖細胞的擴增促進腫瘤的發(fā)生，且HCC復發(fā)風險與肝臟CIRP表達呈正相關(guān)[45]；在結(jié)腸直腸腫瘤中，CIRP通過刺激細胞因子(包括TNF-α和IL-23)的生成來調(diào)節(jié)腫瘤和慢性炎癥的發(fā)生[46]；在垂體腺瘤中，過量表達的CIRP可能通過ERK1/2介導腫瘤細胞的增殖、浸潤和復發(fā)[47,48]；在口腔鱗狀細胞癌中，CIRP與TLR4的過量表達，與該腫瘤存活率低有關(guān)[49]；CIRP還可通過增加細胞周期調(diào)節(jié)因子CyclinE1(一種重要的細胞周期調(diào)節(jié)因子)的表達，促進導管癌向浸潤性乳腺癌的發(fā)展。此外，CIRP的過表達還可通過ERK/P38信號通路促進上皮向間質(zhì)的轉(zhuǎn)變，促進腫瘤的轉(zhuǎn)移及浸潤[50]。這些研究表明CIRP與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有密切聯(lián)系。2009 年，Zeng等[51]發(fā)現(xiàn)抑制敲除CIRP基因抑制CIRP蛋白表達，不僅能降低前列腺癌細胞(PC-3，LNCaP)的增殖能力，還能提高癌細胞對化療藥物的敏感性。此外有研究證實，降低CIRP的表達還能有效抑制TERA2、HeLa等細胞的生長。綜上我們不難看出CIRP蛋白可能成為治療癌癥的新靶點。

4.6CIRP與免疫應(yīng)答 在植物和哺乳動物中，模式識別受體(PRR)，其是識別病原體相關(guān)分子模式(PAMP)和損傷相關(guān)分子模式(DAMP)的初始關(guān)鍵分子[52,53]。2007年，F(xiàn)u等[54]首次發(fā)現(xiàn)植物冷誘導蛋白AtGRP7參與植物免疫應(yīng)答。AtGRP7通過結(jié)合兩種PRRs(FLS2和EFR)的轉(zhuǎn)錄子和蛋白質(zhì)，顯著增強PAMP引發(fā)的免疫反應(yīng)[55]。而動植物的CIRP同源性高達99%，據(jù)此我們推測，哺乳動物冷誘導蛋白也參與先天免疫應(yīng)答。2013年，CIRP被確定為在出血性休克和敗血癥期間從心臟和肝臟釋放到循環(huán)系統(tǒng)中的新型炎癥介質(zhì)，且分泌的CIRP可作為DAMP，通過結(jié)合TLR4-MD2復合物(一類哺乳動物PRRs)，刺激TNF-α和HMGB1分泌進而引發(fā)炎癥反應(yīng)[56]。近期，Yang等[57]發(fā)現(xiàn)釋放入血的CIRP增加細胞表面黏附分子表達，活化NAD(P)H氧化酶并激活Nlrp3炎癥小體誘發(fā)血管內(nèi)皮細胞凋亡。Klhan等[58]發(fā)現(xiàn)細胞外CIRP可通過TLR4信號通路接到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導致膿毒血癥相關(guān)的急性肺損傷，Bolognese等[59]指出在脾臟，過表達的CIRP可直接激活CD4+和CD8+T細胞啟動對膿毒血癥啟動適應(yīng)性免疫反應(yīng)。在腹主動脈瘤患者中血清及動脈瘤組織中，Li等[60]94發(fā)現(xiàn)了CIRP的表達，且過量表達的CIRP增加MMP-2、MMP-9、TNF-α和巨噬細胞的積累，而用CIRP中和性抗體下調(diào)CIRP的表達不僅抑制了巨噬細胞積累和MMP-2/9的過表達，而且抑制了動脈瘤的擴張。不僅如此，Ran等[61]和Chen等[62]等發(fā)現(xiàn)CIRP高表達于支氣管上皮細胞，在冷應(yīng)激下，通過ERK/NF-κB誘導炎癥因子及氣道黏蛋白的過表達而抑制其表達，可有效降低炎癥因子和黏蛋白的表達。Yu等[63]研究發(fā)現(xiàn)在骨關(guān)節(jié)炎患者中CIRP呈高表達，且CIRP表達高低與疾病嚴重程度密切相關(guān)。總的來說，這些結(jié)果表明，在疾病狀態(tài)下，CIRP可能釋放到細胞外并通過擴大炎癥反應(yīng)而加劇組織損傷。

類似于上述CIRP在腦中的雙重作用，最近的報告顯示，肝臟中低溫誘導的CIRP表達可通過降低ROS的生成來保護肝細胞[64]，而使用抗CIRP抗體中和血清中分泌的CIRP，能顯著降低炎癥反應(yīng)并保護肝臟免于缺血-再灌注損傷[65]，另有研究也證實抑制CIRP表達可加速炎癥反應(yīng)速度，促進傷口愈合[66]?？偟脕碚f，細胞外CIRP通過誘導炎癥反應(yīng)引起細胞損傷。然而，在炎癥的后期，損傷的細胞被炎癥消除，功能障礙的細胞被再生細胞替代[67]，這意味著CIRP介導的免疫應(yīng)答也可能具有有利的方面。這些結(jié)果提示CIRP在介導免疫應(yīng)答過程中也具有雙重功效。

5 總結(jié)

CIRP自從21年前首先被確定為冷應(yīng)答蛋白以來，學者們?yōu)殛U明CIRP的生理和病理生物學作用做了大量努力。目前，CIRP幾乎分布于哺乳動物的所有細胞中，并且作為一種應(yīng)激反應(yīng)蛋白，通過過表達和核質(zhì)穿梭轉(zhuǎn)調(diào)節(jié)各種應(yīng)激反應(yīng)。細胞內(nèi)CIRP作為RNA分子伴侶，通過與其靶標結(jié)合來調(diào)節(jié)mRNA穩(wěn)定性，或通過與其他信號蛋白相互作用傳遞信號，從而調(diào)節(jié)細胞的增殖和分化、細胞生存與凋亡、腫瘤的發(fā)生發(fā)展及生物節(jié)律。另外，CIRP可以被分泌至細胞外，細胞外的CIRP作為促炎因子參與各種急性和/或慢性炎性疾病?？紤]到在多種癌癥中的廣泛作用，CIRP被認為是一種新的癌基因，并且極有可能成為癌癥治療中的新治療靶標。CIRP中和抗體在膿毒癥和其他炎癥性疾病中阻斷CIRP誘導的炎癥反應(yīng)，強烈證明了CIRP在炎癥相關(guān)疾病中的關(guān)鍵作用，并為CIRP中和抗體或CIRP靶向肽的治療炎性疾病的潛力提供了理論基礎(chǔ)。盡管我們在研究CIRP在細胞生物學和疾病狀況中的作用方面取得了巨大成功，但仍有許多問題尚未解決，例如CIRP在慢性炎癥性疾病如肥胖癥、糖尿病和其他疾病中的作用如何。 因此，闡明CIRP在這些疾病中的作用將對(病理)疾病生理學的理解產(chǎn)生重大影響，并可能為設(shè)計新型治療藥物提供理論基礎(chǔ)。