牛乳中硝基呋喃代謝物檢測技術(shù)研究進(jìn)展

朱寧，趙艷坤，蔡建星，安靜，陳賀

（新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所/農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估實(shí)驗(yàn)室（烏魯木齊）/新疆農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830091）

硝基呋喃類藥物是人工合成的具有5-硝基基本結(jié)構(gòu)的廣譜抗菌藥物，由于其強(qiáng)毒性和致癌性，已引起世界各國的高度重視，我國農(nóng)業(yè)部規(guī)定動(dòng)物源性食品中呋喃唑酮的限量為不得檢出[1]。硝基呋喃類藥物被用于小牛體內(nèi)，治療痢疾等腸道疾病。與此同時(shí)，若奶牛食用含有硝基呋喃成分的飼料添加劑，則不可避免地造成牛乳中硝基呋喃代謝物的殘留，給牛奶帶來嚴(yán)重的質(zhì)量安全隱患[2]。

常見的硝基呋喃類藥物有4種，即呋喃它酮、呋喃妥因、呋喃西林和呋喃唑酮。呋喃類物質(zhì)在動(dòng)物體內(nèi)穩(wěn)定性較差，能迅速分解，其代謝產(chǎn)物分別為3-氨基-2-噁唑烷基酮（AOZ）、氨基脲（SEM）、1-氨基乙內(nèi)酰脲（AHD）和5-甲基嗎啉代-3-氨基-2-唑烷酮（AMOZ），可以與組織蛋白結(jié)合形成穩(wěn)定的化合物，殘留時(shí)間長達(dá)數(shù)周之久。這些代謝物在弱酸性條件下可從蛋白質(zhì)中釋放出來( 如人類胃液的酸性條件)，因此當(dāng)人類食用了含有硝基呋喃類抗生素殘留的食品后，其在胃液里釋放出來被人體吸收，對人類健康造成危害[3]。通用的牛乳加工方法難以使蛋白結(jié)合態(tài)硝基呋喃殘留物降解，長期食用含有此類物質(zhì)的牛奶，會(huì)打亂體內(nèi)菌群平衡[2]，嚴(yán)重的會(huì)產(chǎn)生溶血性貧血、血小板減少性紫癜和多發(fā)性神經(jīng)炎等[4]，因此了解、歸納牛奶中硝基呋喃代謝物的檢測原理、檢測技術(shù)并用于指導(dǎo)實(shí)踐，對牛奶質(zhì)量安全具有重要意義。

本文主要介紹牛奶中硝基呋喃代謝產(chǎn)物檢測技術(shù)及發(fā)展趨勢，包括前處理方法、儀器測定方法。

1 樣品前處理

由于硝基呋喃代謝物在酸性條件下才能從蛋白質(zhì)中釋放出來，因此通用的樣品前處理方法是先使樣品在酸性條件下水解，再加試劑使其衍生化，經(jīng)過提取、凈化等步驟，最后上儀器測定[5]。

1.1 樣品衍生化

1.1.1 什么是樣品衍生化

衍生化是為了增加分子質(zhì)量，使化合物不在高噪音背景下，增加特征碎片離子的選擇性，提高質(zhì)譜響應(yīng)。硝基呋喃代謝物衍生化一般在37℃過夜進(jìn)行，親核基團(tuán)R-NH在酸性催化環(huán)境會(huì)很快游離出來與2-NBA碳?；l(fā)生化學(xué)作用[6]，增加代謝物的離子化效率，水解后生成硝基苯衍生物。衍生試劑大多選擇2-硝基苯甲醛(2-NBA)，也可以選擇2，4-二硝基苯甲醛、2-羥基-5-硝基苯甲醛[7]。

1.1.2 硝基呋喃代謝物衍生化的必要性

(1) 從硝基呋喃結(jié)構(gòu)看，其代謝物極性相對較強(qiáng)， 它們的結(jié)構(gòu)易和色譜柱硅膠表面重金屬發(fā)生螯合形成“二次保留”，造成死吸附、降低感度、峰形展寬拖尾、與相關(guān)雜質(zhì)及基質(zhì)的分離度不佳，嚴(yán)重影響結(jié)果判斷[8]。

(2) 從液相色譜儀利用的紫外-可見檢測器分析看，硝基呋喃結(jié)構(gòu)的紫外光譜吸收不明顯，靈敏度過低[8]，經(jīng)衍生化后紫外吸收加強(qiáng)，使其檢測限可以達(dá)到1.0μg/kg。

(3) 從質(zhì)譜檢測分析看，硝基呋喃類代謝物的相對分子量較小、離子化效率低、 離子碎片無特征性， 直接進(jìn)行質(zhì)譜測定時(shí)會(huì)造成較大困難。對硝基呋喃類藥物的代謝物進(jìn)行衍生有利于質(zhì)譜檢測時(shí)離子碎片的選擇[8]。

蒙君麗等人在研究分析中，使牛奶樣品與2-硝基苯甲醛進(jìn)行反應(yīng)，對硝基呋喃類代謝物進(jìn)行衍生化，加入0.5mol/L三氯乙酸5mL，加入0.05mol/L衍生化試劑2-硝基苯甲醛（二甲亞砜溶解）0.2mL，37℃衍生化16h[3]，結(jié)果使目標(biāo)化合物的離子化達(dá)到最佳水平，試驗(yàn)中各化合物都得到了較好的色譜峰形。

測定牛奶中硝基呋喃類藥物代謝物時(shí)，樣品基質(zhì)蛋白、脂肪等干擾物質(zhì)較多，影響最終的定性定量結(jié)果。所以，硝基呋喃代謝物經(jīng)衍生化后，需要進(jìn)一步的提取和凈化，才可用于檢測，得到準(zhǔn)確的檢測結(jié)果。

1.2 硝基呋喃代謝物的提取凈化

硝基呋喃類代謝物屬于獸藥成分的一類。針對獸藥殘留檢測，常用的提取凈化方法有液液萃取法、固相萃取法、凝膠滲透色譜、免疫親和色譜、超臨界流體萃取、分子印跡等[9]。現(xiàn)在最常用的方法為液液萃取法和固相提取法。

1.2.1 液液萃取法

在硝基呋喃代謝物提取凈化過程中，幾種硝基呋喃類抗生素及其代謝物可能同時(shí)殘留在介質(zhì)中，衍生后的特性和溶解性不同，利用其組分在溶劑中的不同溶解度可達(dá)到分離提取的目的[7]。液液萃取凈化方法簡單，并且可以大大縮短凈化時(shí)間，但是提取物范圍較廣泛，特別是對于牛奶這種基質(zhì)復(fù)雜的樣品，會(huì)造成共提出物質(zhì)較多。Freitas 等[10]與 Storey 等[11]建立的方法利用液液萃取卻有不錯(cuò)的回收率，可以滿足幾十種獸藥殘留同時(shí)定量檢驗(yàn)的要求。樣品溶液的pH對萃取效率有很大的影響，丁濤等[12]試驗(yàn)不同pH值對回收率的影響，發(fā)現(xiàn)pH值為7～7.5時(shí)，AHD、AOZ、SEM和AMOZ代謝物的衍生產(chǎn)物提取效率最高。

1.2.2 固相萃取法

固相萃取是在液液萃取的基礎(chǔ)上建立的一種凈化方法，填料為一般硅膠鍵合固定相，基于固體填料與樣品中的目標(biāo)化合物產(chǎn)生各種作用力，將目標(biāo)物與樣品基質(zhì)分離，再用洗脫液洗脫，達(dá)到分離和富集目標(biāo)化合物的目的。固相萃取分離效率高，處理樣品的容量大，使用有機(jī)溶劑少。蒙君麗等采用Oasis HLB固相萃取柱，用5mL甲醇、5mL水活化，再使樣品備用液全部過柱[3]，取得較好的效果。

由于牛奶樣品中的高蛋白、高脂肪，采用液液萃取較容易產(chǎn)生乳化現(xiàn)象，需要加入去乳步驟，從而延長了試驗(yàn)操作時(shí)間。根據(jù)分離模式不同，相對于液液萃取，固相萃取具有高效、快速、重現(xiàn)性好、凈化效果佳、少用有毒有害溶劑、環(huán)保、經(jīng)濟(jì)的優(yōu)點(diǎn)。商品化的固相萃取小柱也越來越多樣化。對于牛奶中硝基呋喃代謝物的檢測，固相萃取方法更為適合。

2 樣品的儀器檢測方法

2.1 高效液相色譜法( HPLC)

高效液相色譜法是最早被采用的硝基呋喃類藥物檢測方法。高效液相色譜大多用于硝基呋喃原藥化合物的檢測。該法的優(yōu)點(diǎn)是自動(dòng)化、精確度高，假陽性率低，缺點(diǎn)是儀器昂貴、操作繁瑣、樣品處理復(fù)雜、成本高、廢棄試劑易造成環(huán)境污染，并需要專業(yè)分析人員。

通常采用高效液相色譜結(jié)合紫外檢測器測定硝基呋喃類藥物代謝物，在檢測中由于呋喃結(jié)構(gòu)的紫外光譜吸收不明顯，導(dǎo)致靈敏度過低，經(jīng)衍生化試劑衍生化后，可產(chǎn)生強(qiáng)紫外吸收，但是復(fù)雜的基質(zhì)還會(huì)導(dǎo)致測定困難和干擾。用高效液相色譜-紫外檢測法(HPLC-UV)檢測硝基呋喃代謝物，已有對4種硝基呋喃類藥物同時(shí)檢測的方法，但由于樣品基質(zhì)復(fù)雜，會(huì)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成干擾，所以在前處理過程中必須嚴(yán)格按照要求凈化。此方法過程較繁瑣、復(fù)雜，需要花費(fèi)大量的時(shí)間和試劑，同時(shí)在應(yīng)用中也有一定的局限。該方法若要在硝基呋喃類藥物殘留檢測中廣泛應(yīng)用還需要不斷的改進(jìn)。Angelini等[13]利用LC-UV方法檢測牛肌肉組織中4種硝基呋喃類藥物的殘留，方法的檢測限是1mg/kg，定量限是2mg/kg，平均回收率76%。

2.2 高效液相色譜配合質(zhì)譜技術(shù)(LC-MS)

近些年來，高效液相色譜配合質(zhì)譜技術(shù)(LC-MS)在硝基呋喃代謝物殘留的檢測中越來越多地被采用，相信也可以被引入到牛乳測定中。目前，色譜技術(shù)廣泛應(yīng)用于多組分混合物的分離和分析，質(zhì)譜儀可對單一組分提供高靈敏度和特征的質(zhì)譜圖，質(zhì)譜檢測器具有穩(wěn)定性好、定量準(zhǔn)確、抗干擾能力強(qiáng)、檢測限低、測定快速等特點(diǎn)[1]。LC-MS 是一種靈敏度高、選擇性好、特異性強(qiáng)、可快速分析確證硝基呋喃類藥物殘留的方法。但是缺點(diǎn)同高效液相色譜法一樣，儀器設(shè)備的購置和運(yùn)行費(fèi)用較高，檢測過程中涉及大量的有機(jī)溶劑，對環(huán)境污染較大，周期也比較長[14]，距成為常規(guī)分析方法尚有一定距離。荷蘭瓦郝尼罕RIKIL T-DLO實(shí)驗(yàn)室建立了完整的LC-MS法用于檢測呋喃唑酮代謝物 AOZ 及其他代謝物[15]。

由于牛乳中幾種硝基呋喃類抗生素及其代謝物可能同時(shí)殘留，所以與LC-UV相比，LC-MS更適合牛乳中硝基呋喃代謝物的檢測。

2.3 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法是以液相色譜作為分離系統(tǒng)，質(zhì)譜為檢測系統(tǒng)。樣品在色譜部分對試樣中的各個(gè)組分進(jìn)行分離，在質(zhì)譜檢測器入口被離子化，經(jīng)質(zhì)譜的質(zhì)量分析器將離子碎片按質(zhì)量數(shù)分開，經(jīng)檢測器得到質(zhì)譜圖[7]。HPLC-MS/MS 也被廣泛應(yīng)用于測定各種復(fù)雜基質(zhì)樣品中的硝基呋喃類代謝物，該方法在對被測化合物的定量上有更高的可信度，同時(shí)具有相對較高的靈敏度，比液相色譜法的靈敏度高10倍以上，還具有更高的選擇性和精密度，對于假陽性問題，HPLCMS/MS 法可以利用待測分子的結(jié)構(gòu)來定性，排除酶聯(lián)免疫方法和高效液相色譜法檢測的假陽性結(jié)果，用以確證檢測結(jié)果。歐盟目前認(rèn)為 HPLC-MS 只能用于對硝基呋喃代謝產(chǎn)物進(jìn)行篩選實(shí)驗(yàn)，對檢出的陽性結(jié)果必須再用 HPLC-MS/MS 進(jìn)行確證[16]。余建新等[17]采用微量化樣品前處理技術(shù)，以鄰硝基苯甲醛為衍生劑和電噴霧正離子多反應(yīng)監(jiān)測方式，建立了蜂蜜及水產(chǎn)品中4種硝基呋喃類抗生素代謝物殘留量同時(shí)測定的液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)方法。方法的檢出限為0.02～0.3ng/g，線性范圍均＞102，線性方程的相關(guān)系數(shù)r＞0.997，回收率79.0%～95.6%。柳毅[5]用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測動(dòng)物源性食品中硝基呋喃代謝物，得到呋喃它酮代謝物、呋喃西林代謝物、呋喃妥因代謝物和呋喃唑酮代謝物的檢測限均為0.50μg/kg；在0.50～10.0μg/kg添加濃度的回收率均≥70%；相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD≤15%。

2.4 化學(xué)發(fā)光免疫法（酶聯(lián)免疫法，ELISA）

化學(xué)發(fā)光是當(dāng)基態(tài)分子吸收化學(xué)反應(yīng)中釋放的能量躍遷到激發(fā)態(tài)，處于激發(fā)態(tài)的分子以光輻射的形式返回到基態(tài)時(shí)產(chǎn)生的光。基于化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度和被測物含量之間關(guān)系建立的分析方法叫化學(xué)發(fā)光分析法[18]。在此基礎(chǔ)上，將化學(xué)發(fā)光與免疫分析方法相結(jié)合，得到諸多發(fā)光免疫分析研究成果。發(fā)光免疫分析是將發(fā)光分析和免疫反應(yīng)相結(jié)合而建立的一種新型超微量分析技術(shù)，該技術(shù)不但具有超過放射免疫的高靈敏度，而且具有酶聯(lián)免疫的操作簡便、快速的特點(diǎn)，且測試中不使用有害的試劑，試劑保存期長，穩(wěn)定性好，檢測范圍寬，可實(shí)現(xiàn)在不需要衍生的情況下直接測定其代謝物，從而大大減少了時(shí)間和成本。缺點(diǎn)是經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)假陽性結(jié)果，抗干擾能力相對較弱。國內(nèi)外關(guān)于硝基呋喃類抗生素免疫分析方法的報(bào)道很少?，F(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道的ELISA方法優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高、操作簡便、檢測迅速[7]，但不能作為確認(rèn)方法，同時(shí)由于ELISA方法特異性較強(qiáng)，故僅能對單一組分進(jìn)行檢測，無法同時(shí)一次性檢測樣品中的呋喃唑酮及AOZ、呋喃它酮及AMOZ、硝基呋喃妥因及AHD、硝基西林及 SEM。Chang等[19]采用ELISA測定可食性動(dòng)物組織中呋喃唑酮代謝物時(shí)以苯甲醛作為衍生化試劑，生成苯AOZ的衍生物進(jìn)行檢測，回收率為55.8%～99.6%。

目前國外已有檢測呋喃唑酮、呋喃它酮代謝物的商品化試劑盒開發(fā)出來。我國謝世紅等[20]建立了用四合一免疫膠體金快速檢測試劑板同時(shí)快速檢測水產(chǎn)品中殘留的4種硝基呋喃類代謝物殘留的方法。結(jié)果表明，該方法檢測速度快、時(shí)間短，準(zhǔn)確率高；最低檢出限為AOZ 1.0μg/kg、SEM 1.0μg/kg、AMOZ 2.0μg/kg、AHD 2.0μg/kg；假陽性率小于5%，假陰性率為0；對實(shí)際樣品的檢測結(jié)果與儀器方法一致。若運(yùn)用于牛乳中估計(jì)會(huì)有顯著的效果。

3 我國的現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)

3.1 關(guān)于高效液相色譜

農(nóng)業(yè)部1077號(hào)公告-2-2008 水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物殘留量的測定、農(nóng)業(yè)部1486號(hào)公告-8-2010 飼料中硝基呋喃類藥物的測定，均采用高效液相色譜法測定，其中農(nóng)業(yè)部1486號(hào)公告-8-2010的檢測限可達(dá)0.3mg/kg，定量限為1.0mg/kg。

DB34/T 1838-2013 、DB34/T 1839-2013中分別規(guī)定了動(dòng)物源性組織和水產(chǎn)品中硝基呋喃類藥物代謝物殘留量檢測方法，儀器采用高效液相色譜配熒光檢測器，其中DB34/T 1839-2013 適用于產(chǎn)品的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警監(jiān)測及相關(guān)科學(xué)研究。

3.2 關(guān)于液相色譜-質(zhì)譜

SN/T 2061-2008 進(jìn)出口蜂王漿中硝基呋喃類代謝物殘留量的測定、DB22/T 1614-2012 蛋及乳制品中硝基呋喃代謝物殘留量的測定，均規(guī)定采用液相色譜-質(zhì)譜法。

3.3 關(guān)于液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜

GB/T 21311-2007 、GB/T 20752-2006規(guī)定了動(dòng)物源性食品中包括肌肉、內(nèi)臟、魚、蝦、蛋、奶、蜂蜜和腸衣中硝基呋喃類藥物代謝物殘留量的檢測方法，均規(guī)定采用高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法測定四種硝基呋喃代謝物AOZ、AMOZ、AHD、SEM的殘留，其中GB/T 20752-2006四種殘留物的檢出限均達(dá)到0.5μg/kg。適用于定性確證和定量測定。

農(nóng)業(yè)部781號(hào)公告-4-2006 動(dòng)物源食品中硝基呋喃類代謝物殘留量的測定、農(nóng)業(yè)部783號(hào)公告-1-2006水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物殘留量的測定，也均規(guī)定采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。

SN/T 2061-2008 蜂王漿中硝基呋喃類代謝物殘留量的測定、GB/T 21167-2007 蜂王漿中硝基呋喃類代謝物殘留量的測定，也均規(guī)定采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。

3.4 關(guān)于酶聯(lián)免疫法

SN/T 3380-2012 出口動(dòng)物源食品中硝基呋喃代謝物殘留量的測定采用酶聯(lián)免疫吸附法，本標(biāo)準(zhǔn)適用于雞肉、豬肉、小龍蝦、回魚、牛奶、蜂蜜等動(dòng)物源食品中AOZ、AMOZ、SEM、AHD殘留量的檢測。

DB34/T 2253-2014 水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物殘留的檢測采用膠體金免疫層析法，適用于魚、甲魚、龜肌肉組織和去殼蝦、蟹及腸腺的可食用組織中四種硝基呋喃代謝物的快速篩查檢測，檢出限均為1.0μg/kg。

SB/T 10927-2012 酶聯(lián)免疫吸附法僅適用于以上產(chǎn)品的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警監(jiān)測及相關(guān)科學(xué)研究。

4 結(jié)論

國內(nèi)目前對于牛乳中硝基呋喃代謝物的檢測技術(shù)研究較少，由于牛乳不耐儲(chǔ)存，且高脂肪、高蛋白，使得前處理過程中基質(zhì)干擾多，易于乳化，一般需要較長的流程。因此需要開發(fā)一種快捷方便的檢測方法，先對牛乳中硝基呋喃類代謝物進(jìn)行快速篩查，再進(jìn)一步進(jìn)行定量分析，以取得更為準(zhǔn)確的結(jié)果。發(fā)光免疫試劑盒技術(shù)剛好能滿足這一特性，若能進(jìn)一步提高其靈敏度、準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性、回收率，使其接近或者優(yōu)于液譜檢測法，將會(huì)有深遠(yuǎn)意義，值得我們深入研究和開發(fā)。