小鼠實驗性肝損傷模型的研究進展

呂 超，石清蘭，覃 倩，周玲瑤，周小博，易鑫宇，毛德文*

(1. 廣西中醫(yī)藥大學，南寧 530222；2. 廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，南寧 530023)

肝臟疾病是危害人類健康的一個重大醫(yī)學難題，建立合適的實驗性肝損傷動物模型對肝病的防治、發(fā)病機制的研究和護肝藥物的篩選都有著十分重要的意義。常用的動物肝損傷模型有小鼠、大鼠、犬類、兔子以及豬，從實驗動物的生物學特性、易獲得性、安全性、可重復性、經(jīng)濟性等多方面考慮，小鼠最為適合作肝損傷模型動物。實驗動物由于代謝及生理狀況與人類相似，基因組同源性高，成為重要的實驗對象，目前對于小鼠的基因組研究最為透徹，因此用小鼠建立肝損傷動物模型十分必要。本文簡要綜述近年來國內(nèi)外建立小鼠實驗性肝損傷模型的造模方法、適用范圍及優(yōu)缺點，為今后小鼠肝損傷模型的建立以及肝臟疾病的研究起指導作用。

1 化學性肝損傷

1.1 四氯化碳(CCl4)

CCl4是一種常見的化學誘導劑，被廣泛用于建立肝損傷動物模型[1]。CCl4通過細胞色素P450 2E1(CYP2E1)在肝中代謝，產(chǎn)生高反應活性的三氯甲基自由基，干擾肝中的氧化還原穩(wěn)態(tài)，引起氧化應激。自由基還可通過與細胞中的不飽和脂肪酸氧化反應促進脂質過氧化，誘導肝細胞中DNA損傷，引起肝細胞凋亡和壞死，最終造成肝細胞損傷[2]。

將CCl4溶于橄欖油中配成體積分數(shù)10%的CCl4橄欖油溶液，按2 mL/kg的劑量對8～9周齡C57BL/6小鼠進行一次性腹腔注射，建立小鼠急性肝損傷模型[3]。該模型病理結果顯示肝小葉結構紊亂，大量壞死的肝上皮細胞空泡樣變，細胞核固縮、溶解，炎性細胞浸潤，輕度脂肪變性，Kupffer細胞聚集，融合形成多核巨細胞，吞噬壞死細胞[4-5]。CCl4誘導的小鼠肝損傷模型在病理生理等方面與人類肝臟疾病相似，且易于復制，是理想的小鼠肝損傷模型。然而CCl4毒性較強，不僅損害肝，還危害其它臟器，并且CCl4肝損傷屬于中毒性肝損傷，與機體免疫調節(jié)反應關聯(lián)性不強，因此該模型不適用于免疫調節(jié)類護肝藥物的篩選以及免疫機制方面的研究。

1.2 D-氨基半乳糖聯(lián)合脂多糖(D-GalN+LPS)

脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革蘭氏陰性菌的表面抗原物質，通過與體內(nèi)的Toll樣受體4(Toll-like receptors,TLR4)蛋白結合，激活細胞內(nèi) MAPKs-NFκB信號通路，產(chǎn)生白細胞介素-1(interleukin-1,IL-1)、白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等炎癥因子，導致肝組織損傷[6]。嚙齒類動物多對LPS具有免疫性[7]，D-氨基半乳糖(D-galactosamine,D-GalN)是一種肝特有的毒素，可以提高肝對LPS毒性的敏感性。D-GalN在肝中選擇性地耗盡尿苷核苷酸，抑制肝細胞內(nèi)蛋白質和mRNA的合成，致使肝細胞不可逆的損傷。D-GalN、LPS的聯(lián)用可以加劇肝細胞的損傷對LPS的毒性作用很敏感，聯(lián)合使用可在幾小時內(nèi)急劇誘導肝細胞損傷。D-GalN+LPS可以激活Kupffer細胞產(chǎn)生各種炎性因子[8]，并激活caspase酶、啟動子caspase 8和caspase 9多種凋亡信號，最終激活效應細胞caspase 3，進而裂解細胞底物(poly ADP-ribose polymerase, PARP)，觸發(fā)凋亡程序導致肝細胞壞死[9]。另外有研究表明，氧化應激是D-GalN+LPS誘導肝損傷的一個重要因素[10]。

將D-GalN、LPS溶于生理鹽水中，按D-GalN(300 mg/kg)+LPS(2.5 mg/kg)劑量給8-9周齡雄性C57BL/6小鼠一次性腹腔注射，每只小鼠注射0.2 mL液體，18 h可建立小鼠急性肝損傷模型[11-12]。也可在注射D-GalN+LPS前分4次(前3次每次間隔14 d，第四次與第三次之間間隔10 d)對小鼠多點皮下注射人血清白蛋白(human serum albumin, HSA)溶液，每次0.5 mL，小鼠經(jīng)HSA致敏后按D-GalN(400 mg/kg)+LPS(0.1 mg/kg)劑量一次性腹腔注射，導致小鼠慢加急性肝衰竭[13]。組織形態(tài)學上顯示肝小葉結構紊亂，炎癥細胞浸潤，肝細胞實質壞死，細胞核溶解，肝管與血管大量出血[12]。D-GalN+LPS誘導的肝損傷模型是一個穩(wěn)定的動物實驗模型，D-GalN只作用于肝，不損害其它臟器，對于篩選護肝藥物具有重要意義。然而因為小鼠種系的不同，藥物的用量變化很大，需要進行預實驗，且D-GalN價格較貴，限制了其在大型動物上的使用。

1.3 二甲基亞硝胺(DMN)

二甲基亞硝胺(nitrosodimethylamine, DMN)是一種烷基化肝毒素，通過激活DNA片段和促進金屬蛋白酶活化等多種方式誘導肝細胞壞死和癌變[14]。另外有學者研究表示DMN可誘導肝星狀細胞(hepatic stellate cells, HSC)增殖，誘導肝纖維化的形成，破壞肝細胞結構，損傷肝細胞[15]。

將DMN溶于生理鹽水中配成1 mg/mL溶液，按DMN 10 mg/kg劑量對8周齡C57BL/6小鼠進行腹腔注射，每周3次，數(shù)周內(nèi)可形成小鼠慢性肝損傷模型[16]。該模型鏡下病理表現(xiàn)為肝組織大片出血，肝細胞大面積壞死，壞死細胞邊緣出現(xiàn)空泡變性，炎性細胞浸潤[17]。DMN誘導小鼠肝損傷模型穩(wěn)定、易于復制，對肝纖維化機制的研究及抗肝纖維化藥物的篩選具有重要的意義，但DMN具有強烈的毒性，實驗人員操作時需注意防護。

1.4 α-萘基異硫氰酸酯(ANIT)

肝細胞的一個關鍵功能是膽汁酸的合成和轉運，膽汁酸是脂代謝的關鍵調節(jié)因子，然而膽汁酸濃度過高時具有明顯的肝毒性[18]。α-萘基異硫氰酸酯(α-naphthylisothiocyanate,ANIT)在肝中代謝，與谷胱甘肽(glutathione, GSH)可逆結合后被轉運蛋白MRP2轉運到膽汁中[19]。過多的ANIT消耗肝中的GSH，ANIT代謝產(chǎn)物在膽管中淤積，產(chǎn)生炎癥，阻礙膽汁的分泌，導致肝內(nèi)膽管內(nèi)襯膽管上皮細胞(bile duct epithelial cells, BDECs)損傷和肝壞死灶的形成，引起高膽紅素血癥和肝細胞壞死。

將ANIT溶解于玉米油中，按80 mg/kg劑量給8周齡C57BL/6雄性小鼠灌胃，每只小鼠灌0.2 mL，24 h可形成ANIT小鼠急性肝損傷模型[20]。組織形態(tài)學表現(xiàn)為肝細胞損傷以點狀壞死為主，膽囊粘膜炎癥，膽道增生明顯，門脈結締組織中小葉內(nèi)膽管及其支流數(shù)目明顯增加，膽汁上皮細胞比正常膽管上皮細胞嗜堿性明顯[21]。該模型很好地模擬了人類膽汁淤積型肝損傷，是用于研究梗阻性黃疸發(fā)病機制和篩選護肝利膽退黃藥的理想小鼠實驗模型。

1.5 硫代乙酰胺(TAA)

硫代乙酰胺(thioacetamide, TAA)是一種常用的建立肝損傷動物模型的化合物。TAA攝入后，可誘導細胞內(nèi)N-甲基-D-天冬氨酸(NMDAR)過度激活，引起谷氨酸(glutamic acid, GLU)含量升高，改變細胞膜內(nèi)外離子平衡性，誘導神經(jīng)毒性信號傳導，損傷神經(jīng)元，導致神經(jīng)元功能障礙，從而小鼠出現(xiàn)肝性腦病表現(xiàn)[22]。另外TAA在肝中代謝為硫氧化物，進而產(chǎn)生自由基和活性氧，破壞細胞膜的通透性，誘導肝細胞增殖，促進肝細胞纖維化的產(chǎn)生。

TAA以20 mg/mL的濃度溶解在生理鹽水中，按TAA 300 mg/kg的劑量給8-10周齡C57BL/6小鼠進行腹腔注射，每隔24 h注射一次，連續(xù)三次，可造成小鼠急性肝損傷模型[23]。TAA誘導的小鼠肝損傷模型可造成小鼠神經(jīng)系統(tǒng)疾病，類似于人類肝病終末期的肝性腦病；造成的小鼠肝纖維化模型易于復制，形成的肝纖維化不易逆轉。該模型是研究并防治肝性腦病、篩選抗纖維化藥物的理想小鼠模型。

2 藥物性肝損傷

2.1 對乙酰氨基酚(APAP)

對乙酰氨基酚(Acetaminophen, APAP)是臨床上解熱鎮(zhèn)痛類的一線藥物，過量服用會導致嚴重的肝損傷[24]。APAP在肝內(nèi)的主要代謝產(chǎn)物是葡萄糖醛酸和硫酸鹽偶聯(lián)物，少量被CYP2E1轉化為一種具有高度活性的毒性代謝產(chǎn)物N-乙酰-對-苯醌亞胺(NAPQI)。正常情況下，NAPQI由于肝中GSH的減少而被迅速激活，然后在膽汁和尿液中排泄為半胱氨酸和巰基酸。APAP攝取過多時，葡萄糖醛酸內(nèi)酯和硫酸鹽途徑飽和，過量的APAP通過CYP系統(tǒng)代謝產(chǎn)生大量的NAPQI，消耗肝中的GSH，未與GSH共價結合的NAPQI還可以與細胞蛋白硫醇共價結合，促進肝細胞氧化，降低肝抗氧化能力，導致急性肝壞死。

APAP以15 mg/mL的最高濃度在60℃水浴條件下溶于生理鹽水中，保存在40℃水浴恒溫箱內(nèi)，待固體析出前按250 mg/kg劑量給10～12周齡的C57BL/6雄性小鼠進行一次性腹腔注射，12 h可達到肝損害高峰[25-26]。APAP誘導的小鼠肝損傷模型組織形態(tài)學表現(xiàn)以小葉中心區(qū)域壞死為特征，這是APAP毒性的標志[27]。該模型方便、廉價，代謝機理接近臨床，因此逐漸成為近年來研究過量服用解熱鎮(zhèn)痛藥導致急性肝損傷的治療藥物篩選的動物模型。然而，該模型造模時藥物溶解度低等因素限制了造模的成功率，需要多加探索以改進造模方法。

2.2 異煙肼聯(lián)合利福平(INH+RMP)

異煙肼和利福平，兩種臨床使用最廣泛的抗結核藥物，具有潛在的肝毒性。其發(fā)病機制是:異煙肼由細胞色素CYP450代謝生成乙酰肼和肼[28-30]，在異煙肼(isoniazid, INH)的代謝過程中，肼可以直接從INH產(chǎn)生，也可以間接從乙酰基生成。這兩種水解反應都涉及一種酰胺酶，由酰胺酶介導的肼與巰基的高反應性消耗肝細胞中的GSH，氧化應激增強，線粒體結構紊亂，細胞膜通透性改變，導致肝細胞損傷[31]。利福平(rifampicin, RMP)沒有產(chǎn)生毒性代謝產(chǎn)物的直接證據(jù)，但是RMP是肝CYP450強誘導因子，促進了INH的代謝，增加肼的產(chǎn)量，導致INH的肝毒性明顯增加[32]。

將INH、RMP溶于生理鹽水中，每日按INH 75 mg/kg+RMP 150 mg/kg劑量給6～8周齡BALB/c小鼠灌胃，每只小鼠灌胃0.2 mL，連續(xù)灌胃1周，可形成小鼠急性肝損傷模型[32-33]。肝組織學檢查顯示明顯的脂肪堆積，產(chǎn)生大量炎癥細胞[29]。該模型穩(wěn)定性好，重復率高，適用于研究聯(lián)用異煙肼、利福平抗結核導致肝損傷的機制。

2.3 甲基咪唑(MTZ)

甲基咪唑(methimazole, MTZ)是一種抗甲狀腺藥物，可引起急性肝壞死和膽汁性肝炎[34]。其損傷機制尚不完全清楚，但認為與其活性代謝產(chǎn)物有關。MTZ通過細胞色素P450和含黃素的單氧酶(flavin-containing monooxygenases, FMO)進行代謝，生成n-甲基硫脲、乙二醛等多種活性代謝產(chǎn)物，消耗肝中的GSH，破壞線粒體膜的通透性，誘導肝細胞受損[35]。還有研究證明MTZ致小鼠急性肝損傷與Th2細胞因子介導的免疫反應有關[36]。MTZ常與L-丁硫氨酸-S，R-磺基(L-buthionine-S，R-sulfoximine，BSO)聯(lián)用，BSO是GSH生物合成的限速酶，抑制肝中GSH的合成，加重MTZ對肝的損害。

將BSO、MTZ分別溶于適量的生理鹽水中，先按667 mg/kg的劑量給6周齡雌性BALB/c小鼠腹腔注射0.2 mL BSO溶液，2 h后再按15 mg/kg劑量給小鼠灌胃0.2 mL MTZ溶液，24 h可造成小鼠急性肝損傷模型[36]。生化檢查可見血漿丙氨酸轉氨酶(alanine transaminase, ALT)水平顯著升高，肝中小葉樣變性壞死。該模型利用GSH耗盡進行免疫相關因素的研究，有助于闡明肝損傷的機制，為預測生物標志物的發(fā)展提供新的見解，并通過揭示肝損傷免疫機制來開發(fā)藥物。

3 免疫性肝損傷

3.1 刀豆蛋白A(ConA)

刀豆蛋白A(Concanavalin A, ConA)是一種從矮刀豆中提取出的凝集素，被廣泛應用于免疫介導的小鼠肝損傷模型中。其特點是通過刺激Kupffer細胞分泌IL-1、IL-6、TNF-α等多種炎性細胞因子，激活CD4+T細胞，最終引發(fā)炎癥反應，誘導肝細胞損傷[37]。最近有學者研究表明，ConA通過線粒體磷酸甘油酸變位酶5(phosphoglycerate mutase family member 5, PGAM5)依賴的方式觸發(fā)肝細胞中的線粒體分裂，抑制肝細胞能量代謝，導致肝細胞受損[38]。

ConA以5 mg/ml的濃度溶解在生理鹽水中，按25 mg/kg劑量給7周齡雄性BALB/c小鼠進行一次性尾靜脈注射，造成急性肝損傷[39]。ConA肝損傷模型中可觀察到肝細胞內(nèi)線粒體有很強的周核聚集，這是線粒體壓力的特征指標[38]。該模型由T淋巴細胞介導免疫性肝損傷的機制較好地模擬了病毒性肝炎引發(fā)的免疫性肝損傷的病理生理過程。然而，該模型與人類感染肝炎病毒相比，沒有病毒復制和肝細胞持續(xù)損傷的過程，不能完全模擬肝炎病毒侵襲人體的病理機制，適于從細胞免疫學角度研究肝損傷機制。

3.2 卡介苗聯(lián)合脂多糖(BCG+LPS)

卡介苗(bacille Calmette-Guerin, BCG)誘導單核細胞浸潤到肝小葉并促進肉芽腫形成，隨后注射LPS引起急性大規(guī)模肝損傷并釋放大量活性氧化物，一氧化氮(NO)、GSH和促炎細胞因子如IL-6、IL-1β、干擾素(interferon, IFN)-γ、TNF-α[40]。早期的研究表明LPS誘導細胞外信號調節(jié)激酶2 (extracellular regulated protein kinases 2, ERK2)磷酸化并激活NF-κB通路[41]，促進炎性細胞因子的表達，損害肝細胞。在BCG+LPS模型中，腫瘤壞死因子和輔助T1(Th1)細胞因子是導致肝損傷的主要介質[42]。

將2.5 mg BCG溶于0.2 mL生理鹽水中(約含5×107個活菌)，對6～8周齡雄性BALB/c小鼠進行一次性尾靜脈注射，7～10 d后將10 μg LPS溶于0.2 mL生理鹽水后經(jīng)尾靜脈注射到小鼠體內(nèi)，建立急性免疫性肝損傷小鼠模型[43]。BCG+LPS模型與ConA誘導肝損傷模型的發(fā)病機制不同，在ConA模型中，NKT細胞和Kupffer細胞是誘導肝損害的必需細胞，而BCG+LPS誘導的肝損傷模型中，Th1促炎細胞因子是肝損傷的主要介質[44]。與人類肝炎中大量細胞因子釋放造成的肝細胞受損病理過程相似。該模型適用于由乙型肝炎病毒(viral hepatitis type B, HBV)感染引起的人免疫介導的慢性肝炎的研究。

4 酒精性肝損傷

酒精性肝損傷是一種過度飲酒導致的復雜病理過程，肝細胞凋亡是酒精引起的肝病理表現(xiàn)的主要標志之一[45]。絲裂原活化蛋白激酶-p53(MAPK-p53)軸是肝細胞凋亡的主要信號通路，具體來說，酒精通過p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)在肝細胞中的活化誘導p53轉錄激活和轉位到細胞核中，促發(fā)細胞凋亡機制，導致肝細胞凋亡壞死[46]。p38 MAPK的活化，導致細胞活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)的升高，誘發(fā)氧化反應，耗盡GSH，促進炎性因子的釋放，損傷肝細胞。另有研究表明酒精會破壞肝的沉默信息調節(jié)因子1(SIRTI)的表達，導致肝臟脂質積累[47]。SIRT1適當表達可抑制高脂誘導的脂肪肝，SIRT1的抑制誘導腺苷酸活化蛋白激酶α(AMPK-α)的激活[48]并導致過氧化物酶體增殖活化受體γ共激活因子1α(PGC1-α)的表達減少，導致脂肪酸氧化減少，脂質過度積累，損傷肝[49]。此外，激活的AMPK-α可促進脂肪增生的關鍵調節(jié)因子固醇調節(jié)元件結合蛋白-1(SREBP-1) 的表達，以及其他下游的脂肪生成酶的合成，導致肝細胞脂肪性病變[50]。

用濃度40%～52%酒精對8～10周齡雄性BALB/c小鼠進行灌胃，初始劑量為0.5 g/kg，2周內(nèi)劑量逐漸加至6 g/kg，8周可建立酒精性小鼠肝損傷模型[51]。有學者研究認為Lieber-DeCarli酒精液體飼料模型相較于酒精灌胃模型更適于小鼠酒精性肝損傷模型[52]。其具體操作方法是用含有酒精的飲用水和瓊脂塊喂養(yǎng)小鼠，飲用水中含有10%乙醇、1%花生醬和3%巧克力糖漿；初始瓊脂塊中乙醇濃度為10%，在4周內(nèi)每周增加10%的乙醇濃度，在研究結束前，瓊脂塊的乙醇濃度維持在40%，14～16周可導致小鼠慢性酒精性肝損傷[53]。該方法操作簡便，還避免了應灌胃不當導致小鼠窒息死亡。該模型鏡下病理表現(xiàn)可觀察到肝細胞腫水腫、胞漿內(nèi)微泡脂滴并炎癥細胞浸潤[54]。小鼠酒精性肝損傷模型同人類酒精性肝病發(fā)病機制相似，為研究酒精性脂肪肝發(fā)病機制提供巨大幫助。

5 肝部分切除術

肝具有很強的再生能力，肝細胞在受損情況下迅速進入細胞周期，促進肝細胞再生以恢復到原肝體積[55]。肝部分切除術(partial hepatectomy, PH)的再生性使其成為肝再生研究的首選方法。

用1%戊巴比妥鈉麻醉小鼠，腹部乙醇消毒后延小鼠劍突下方腹部中線剖腹，擠出肝，結扎肝蒂，沿結扎線外側無菌切除中葉和左外側肝葉，約占肝體積的70%，縫合腹部切口，形成小鼠急性肝損傷模型[56]。另有學者在此基礎上發(fā)明了顯微手術、腹腔鏡手術，大大提高了成功率，并減低了手術的創(chuàng)傷性。肝移植是治療肝衰竭的根本方法，明晰其免疫和再生機制是提高肝移植存活率的關鍵。建立一個理想的PH模型對于研究肝移植、肝再生、肝癌切除術、肝衰竭預后，降低致死率都有著十分顯著的意義。

6 結語

理想的肝損傷小鼠模型應具備以下特點：① 肝損傷的形成過程、病理機制與免疫機制與人類肝損傷的發(fā)生過程相似；② 生化檢查和病理檢查符合肝損傷的條件；③ 小鼠模型穩(wěn)定、操作簡便、易于復制、實驗周期短。目前中國大多肝臟疾病是感染肝炎病毒(主要是HBV)引起的[57]，建立一個完善HBV感染的小鼠肝損傷模型對研究肝臟疾病的防治及病情轉變具有重大的意義。以上的模型都不能全面復制出HBV侵襲人體的免疫病理機制，這為進一步研究乙肝病毒的致病機制和藥物篩選造成了巨大的阻礙。近來有學者研究出了HBV轉基因小鼠模型、HBV轉染小鼠模型[58]，使乙肝病毒在小鼠體內(nèi)成功復制，產(chǎn)生強烈的免疫反應，同人類感染HBV后的病理機制更為相似，然而由于小鼠的強烈的免疫反應，HBV的復制往往只能持續(xù)三個月。如何建立一個完善的模擬HBV感染的動物肝損傷模型是我們必須攻克下的難題。相信完善的肝損傷小鼠模型的建立將推動肝臟疾病的研究向前發(fā)展，解決肝炎這一大世界醫(yī)學難題，為全人類的健康謀幸福。