腎缺血再灌注通過(guò)促凋亡途徑加重糖尿病小鼠腎損傷

韓慶玲, 鄭德義, 李偉人, 王志偉, 杜 嬌, 王 毅

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一組以高血糖為特征的代謝性疾病，糖尿病時(shí)長(zhǎng)期存在的高血糖，導(dǎo)致各種組織損傷，特別是腎、心臟、血管和神經(jīng)等多器官組織的慢性損害及功能障礙[1]。實(shí)驗(yàn)研究[2-3]顯示糖尿病會(huì)加重器官對(duì)缺血的損傷，降低器官缺血的預(yù)后。腎臟是機(jī)體維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要器官，臨床上不同病因如麻醉、手術(shù)或移植等引起循環(huán)休克都可以導(dǎo)致腎缺血再灌注損傷，腎缺血再灌注是急性腎功能衰竭的病因之一[4]。但是，在糖尿病的病理基礎(chǔ)上，遭受以上病變所致的急性腎功能損傷及其發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。該實(shí)驗(yàn)從凋亡方面探索腎缺血再灌注加重糖尿病腎損傷的機(jī)制，為臨床研究糖尿病合并腎缺血再灌注損傷病理生理機(jī)制及防治措施提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要實(shí)驗(yàn)試劑及儀器鏈脲佐菌素購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；無(wú)創(chuàng)微動(dòng)脈夾購(gòu)自北京中科恒天科技有限公司；抗體Bcl-2、Bax、β-actin購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；抗體Caspase-3購(gòu)自美國(guó)Millipor公司;RIPA裂解緩沖液、ECL顯色液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所;GelDoc XR System凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司。

1.2實(shí)驗(yàn)分組及模型建立清潔級(jí)雄性C57BL/6J小鼠，18～20 g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供(SCXK 2014-0004)。28只C57 BL/6J小鼠隨機(jī)分為正常血糖假手術(shù)組(Sham組)6只，糖尿病假手術(shù)組(DM+Sham組)6只，正常血糖腎缺血組(I/R組)8只，糖尿病腎缺血組(DM+I/R組)8只。小鼠飼養(yǎng)在清潔、通風(fēng)良好的環(huán)境中，自由飲食水，12 h晝夜節(jié)律。

1.3糖尿病及腎缺血再灌注損傷模型建立參考文獻(xiàn)[5]建立1型糖尿病小鼠模型，小鼠禁食不禁水12 h后，將鏈脲佐菌素以0.5%的濃度溶于0.1 mol/L無(wú)菌檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH 4.5)，以55 mg/kg連續(xù)5 d腹腔注射，自由進(jìn)食水，觀察72 h后，用血糖儀檢測(cè)鼠尾靜脈血糖濃度，血糖濃度>16.7 mmol/L，小鼠出現(xiàn)多尿，體重下降表現(xiàn)，表示糖尿病模型成功。繼續(xù)喂養(yǎng)糖尿病小鼠4周后，建立腎缺血再灌損傷模型：小鼠腹腔注射3.6%(10 ml/kg)水合氯醛麻醉后，脫去腹部毛發(fā)，碘伏常規(guī)消毒后，沿腹正中做大約2.5手術(shù)切口，找到并分離左右腎動(dòng)靜脈，用無(wú)創(chuàng)微血管夾夾閉，腎臟由鮮紅色變?yōu)榘底仙?0 min后，松開微血管夾恢復(fù)血流灌注，腎臟迅速恢復(fù)正常顏色，假手術(shù)組只分離腎動(dòng)靜脈不夾閉，逐層關(guān)閉腹腔。整個(gè)手術(shù)過(guò)程中，小鼠都放置在加熱毯上以保持體溫恒定在(37±0.5)℃，術(shù)區(qū)以生理鹽水濕紗布覆蓋。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1腎功能檢測(cè) 按照試劑盒說(shuō)明書取血清，采用貴州省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科全自動(dòng)生化分析儀 (日本日立公司)進(jìn)行血清尿素氮與肌酐的檢測(cè)。

1.4.2Western blot 檢測(cè)腎組織凋亡蛋白的表達(dá) 取腎組織，加入RIPA裂解緩沖液用組織研磨器研磨勻漿后，提取腎臟總蛋白并定量變性。取10 μl總蛋白加入預(yù)制好的15%聚丙烯酰胺凝膠中，先用80 V電壓分離30 min，然后再調(diào)至120 V分離1.5 h。半干轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上(16 V，16 min)。室溫下5%的脫脂奶粉封閉1 h，然后用含有目的蛋白抗體的一抗稀釋液孵育(Bax，兔抗，1 ∶500稀釋；Bcl-2，兔抗，1 ∶500稀釋；Caspase-3，兔抗，1 ∶200稀釋；β-actin，鼠抗，1 ∶200稀釋)于4 ℃冰箱搖床上孵育過(guò)夜。TPS漂洗3次，每次10 min，后用含辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)二抗(1 ∶1 000稀釋)稀釋液室溫下孵育1 h。再次經(jīng)TPS洗滌3次，每次10 min，加入ECL顯色液用GelDoc XR System凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)。以β-actin表達(dá)水平作為內(nèi)參，應(yīng)用Image J進(jìn)行條帶分析，目的蛋白的表達(dá)量以目的蛋白與內(nèi)參照蛋白平均光密度的比值表示。

2 結(jié)果

2.1各組小鼠血糖、體重、血清肌酐、尿素氮情況腎臟缺血再灌注術(shù)前，測(cè)小鼠空腹血糖和體重，Sham組與I/R組比較無(wú)明顯差異；分別與Sham組及I/R組比較，DM+Sham組和DM+I/R組小鼠血糖明顯升高、體重顯著減輕(P<0.05)。通過(guò)檢測(cè)各組血清肌酐、尿素氮顯示，與Sham組比較，DM+Sham組、I/R組及DM+I/R血清肌酐、尿素氮升高(P<0.05)，表明糖尿病及腎缺血再灌注導(dǎo)致腎功能損害，但DM+I/R表現(xiàn)更嚴(yán)重的腎功能損害。與DM+Sham組比較，DM+I/R組血肌酐、尿素氮明顯增高(P<0.05)，說(shuō)明腎I/R加重腎功能損害。見(jiàn)表1。

2.3Westernblot檢測(cè)凋亡蛋白在各組小鼠模型腎組織中的表達(dá)Western blot檢測(cè)各組小鼠腎組織Bax 、Bcl-2和Caspase-3蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示:與Sham組比較，DM+Sham組和I/R組Bax和Caspase-3的蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05),而Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)；與DM+Sham組和I/R組比較，DM+I/R組小鼠腎組織中Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯增加(P<0.05)，而Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

3 討論

糖尿病發(fā)病率持續(xù)增高趨勢(shì)，根據(jù)國(guó)際糖尿病聯(lián)盟(IDF)最新報(bào)告，2017年全球約4.25億成人患糖尿病，預(yù)計(jì)到2045年，糖尿病患者可能達(dá)到6.29億[6]。隨著糖尿病病程的延長(zhǎng)，可伴發(fā)多器官功能障礙，其中糖尿病腎病為糖尿病引起的微血管并發(fā)癥，是引起終晚期腎病的首要原因[7]。腎臟是能量需求大、微循環(huán)豐富的器官，對(duì)缺血再灌注損傷極為敏感[8]，腎缺血再灌注損傷是急性腎損傷最常見(jiàn)的原因之一，臨床上主要繼發(fā)于低血容量休克、心血管外科手術(shù)及腎移植等[9]。目前針對(duì)糖尿病腎損傷報(bào)道較多，但糖尿病腎急性缺血再灌注損傷國(guó)內(nèi)外尚少報(bào)道。所以糖尿病腎缺血再灌注損傷值得引起重視。目前研究[10]表明，腎臟缺血再灌注損傷的機(jī)制可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，氧化應(yīng)激，炎癥，內(nèi)皮功能障礙等有關(guān)。但是，腎缺血再灌注加重糖尿病腎損傷的發(fā)生機(jī)制尚不清楚。

表1 4組小鼠術(shù)前空腹血糖、體重及術(shù)后腎功能情況比較

與Sham組比較：*P<0.05；與I/R組比較：#P<0.05;與DM+Sham組比較：▽P<0.05

圖1 凋亡相關(guān)蛋白在各組小鼠腎組織中表達(dá)

A：Bax；B：Bcl-2；C：Caspase-3；與Sham組比較：*P<0.05；與I/R組比較：#P<0.05;與DM+Sham組比較：▽P<0.05

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)腹腔連續(xù)注射低劑量鏈脲佐菌素制作糖尿病動(dòng)物模型，建模成功后觀察4周，檢測(cè)小鼠空腹血糖及體重，結(jié)果顯示糖尿病小鼠空腹血糖明顯高于正常血糖小鼠，而糖尿病小鼠空腹體重卻明顯低于正常血糖小鼠，說(shuō)明糖尿病模型成功建立。本實(shí)驗(yàn)采取夾閉雙側(cè)腎動(dòng)脈30 min，再灌注12 h造腎缺血再灌注模型，顯示缺血小鼠血清肌酐尿素氮明顯高于假手術(shù)組，且糖尿病缺血組小鼠血清肌酐尿素氮明顯高于正常血糖缺血組，說(shuō)明腎缺血模型建立成功，且腎缺血加重了糖尿病腎功能的損傷。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在一定的生理或病理?xiàng)l件下，受多種基因精確調(diào)控的主動(dòng)的、程序化的死亡過(guò)程，是機(jī)體重要穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)控機(jī)制[11]。調(diào)控細(xì)胞凋亡的Bcl-2家族在細(xì)胞凋亡轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)揮了極為重要的調(diào)控作用[12]。Bcl-2家族中，Bcl-2是抑凋亡基因，Bax是促凋亡基因。Caspase家族是細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的一組半胱氨酸蛋白酶，其中的Caspase-3是最重要的細(xì)胞凋亡效應(yīng)蛋白酶之一，是凋亡的執(zhí)行者[13]。Bcl-2可以抑制細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)從而抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。而Bax可以通過(guò)與Bcl-2形成二聚體而抑制Bcl-2的表達(dá)及活性[14]。Bcl-2與Bax是一個(gè)平衡體系，Bax表達(dá)過(guò)度，則Bcl-2表達(dá)下調(diào)可活化Caspase-3，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡，反之則抑制細(xì)胞凋亡[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，凋亡相關(guān)蛋白Bax、Caspase-3在正常血糖缺血組和糖尿病假手術(shù)組升高，在糖尿病缺血組升高更明顯，而Bcl-2在正常血糖缺血組和糖尿病假手術(shù)組降低，在糖尿病缺血組降低更明顯。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明凋亡參與了糖尿病加重腎缺血再灌注損傷，凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3的變化起調(diào)控作用。目前本實(shí)驗(yàn)只是初步探測(cè)了糖尿病腎缺血中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)變化，關(guān)于其上下游的調(diào)控機(jī)制和三者之間的相互關(guān)系還需進(jìn)一步探索。