甲基蓮心堿減輕D-半乳糖胺/脂多糖誘導的小鼠急性肝損傷作用研究

王念,魏純玲，蔣世雙，陶武，唐澤

急性肝損傷是指在較短時間內迅速發(fā)生的肝細胞損傷[1]。目前，我國急性肝損傷患者主要以藥物性肝損傷為主，且發(fā)病率逐年增加[2]。研究表明[3]，蓮心堿對肝臟有保護作用，可清除氧自由基、減輕脂質過氧化損傷。甲基蓮心堿屬于蓮心堿的一種，其可以有效清除氧自由基[4]。目前，國內少有關于應用甲基蓮心堿治療急性肝損傷的研究。本研究采用D-半乳糖胺/脂多糖誘導昆明種小鼠急性肝損傷，通過測定小鼠血清超氧化物歧化酶（SOD)、丙二醛（MDA)、谷胱氨肽（GSH）、腫瘤壞死因子 -α（TNF-α)、白細胞介素-6（IL-6)和白細胞介素-10（IL-10)水平，觀察了甲基蓮心堿對急性肝損傷的保護作用，并對其機制進行了初探，以期為急性肝損傷的臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物、儀器、藥品與試劑 80只昆明種雄性小鼠購于重慶市實驗動物中心【動物許可證號：SCXK（渝）2016-0001]，SPF級，8周齡，體質量 15～25 g,實驗前適應性飼養(yǎng)1 w。Allegra25R高速冷凍離心機（美國貝克曼庫爾特公司），7600全自動生化分析儀（日本日立公司）、UV1800紫外分光光度計（日本島津公司），ELx800酶標儀（美國BioTek公司）。甲基蓮心堿（HPLC≥98%）、脂多糖、D-半乳糖胺（大連美侖美生物技術有限公司），檢測ALT、AST、SOD、MDA、GSH、TNF-α、IL-6和IL-10試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2 急性肝損傷小鼠模型構建[5]將80只小鼠隨機分為正常組、模型組、小劑量甲基蓮心堿組和大劑量甲基蓮心堿組，每組20只。給予正常組和模型組小鼠生理鹽水灌胃，在小劑量甲基蓮心堿組和大劑量甲基蓮心堿組小鼠，分別給予100 mg.kg-1和300 mg.kg-1甲基蓮心堿溶液灌胃。在模型組、小劑量和大劑量甲基蓮心堿組小鼠，在末次給藥后1 h，按0.2 mL/10 g體積給予脂多糖（40 μg.kg-1）和 D- 半乳糖胺（600 mg.kg-1）腹腔注射，構建急性肝損傷小鼠模型。觀察小鼠造模后表現，并給予少量水和飼料，12 h后進行實驗取材。

1.3 觀察與檢測和檢查 造模12 h后，每組取10只小鼠，摘眼球取血。離心后取血清，行有關檢測。取血后，處死小鼠，解剖并取肝臟，制備切片，觀察其病理學變化。在每組剩余10只小鼠，觀察存活時間。

1.4 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 23.0軟件對數據進行處理。對服從正態(tài)分布的計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Newman-Keuls檢驗。采用Kaplan-Meier法分析各組小鼠存活率的差異。檢驗水準為α=0.05。

2 結果

2.1 各組小鼠血清ALT和AST水平比較 與正常組比，模型組、小劑量甲基蓮心堿組和大劑量甲基蓮心堿組小鼠血清ALT和AST水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；甲基蓮心堿處理組動物血清ALT和AST水平顯著低于模型組（P＜0.01）；大劑量甲基蓮心堿組小鼠血清ALT和AST水平均顯著低于小劑量甲基蓮心堿組（P＜0.01，表1）。

表1 四組小鼠血清ALT和AST水平（±s）比較

表1 四組小鼠血清ALT和AST水平（±s）比較

與正常組比，①P＜0.05；與模型組比，②P＜0.05；與小劑量甲基蓮心堿組比，③P＜0.05

只 ALT（U/L） AST（U/L）正常組 10 65.3±16.5 127.1±25.3模型組 10 272.4±42.8① 497.2±62.1①小劑量甲基蓮心堿 10 198.6±39.2①② 327.9±60.6①②大劑量甲基蓮心堿 10 138.8±28.9①②③ 223.0±45.5①②③

2.2 各組小鼠血清SOD、MDA和GSH水平比較 與正常組比，模型組、小劑量甲基蓮心堿組和大劑量甲基蓮心堿組小鼠血清SOD和GSH水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01)，而血清MDA水平顯著升高（P＜0.01）；甲基蓮心堿處理組小鼠血清SOD和GSH水平顯著高于（P＜0.01），而血清MDA水平顯著低于模型組（P＜0.01）；大劑量甲基蓮心堿組小鼠血清SOD和GSH水平顯著高于小劑量甲基蓮心堿組（P＜0.01），而血清MDA水平顯著低于小劑量甲基蓮心堿處理組（P＜0.01，表2）。

2.3 各組小鼠血清TNF-α、IL-6和IL-10水平比較 與正常組比較，模型組、小劑量甲基蓮心堿組和大劑量甲基蓮心堿組小鼠血清TNF-α、IL-6和IL-10水平均顯著升高（P＜0.05)；甲基蓮心堿處理組小鼠血清TNF-α水平顯著低于模型組（P＜0.05），大劑量甲基蓮心堿處理組小鼠血清IL-6和IL-10水平與模型組比較，差異顯著（P＜0.05）；大劑量甲基蓮心堿處理組小鼠血清TNF-α、IL-6和IL-10水平與小劑量甲基蓮心堿處理組比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，表 3）。

表2 四組小鼠血清SOD、MDA和GSH水平（±s）比較

表2 四組小鼠血清SOD、MDA和GSH水平（±s）比較

與正常組比，①P＜0.05；與模型組比，②P＜0.05；與小劑量甲基蓮心堿組比，③P＜0.05

只 SOD（U/mL） MDA(mol/L)GSH(μmol/L)正常組 10 92.4±7.4 4.0±0.8 33.0±2.9模型組 10 37.5±6.2① 9.2±1.4① 11.8±2.7①小劑量甲基蓮心堿 10 61.8±5.5①② 7.6±1.2①② 20.4±2.2①②大劑量甲基蓮心堿 10 82.5±7.3①②③ 6.1±0.9①②③ 26.6±2.8①②③

表3 四組小鼠血清細胞因子水平（pg/ml,±s）比較

表3 四組小鼠血清細胞因子水平（pg/ml,±s）比較

與正常組比，①P＜0.05；與模型組比，②P＜0.05

只 TNF-α IL-6 IL-10正常組 10 440.2±52.5 100.6±19.8 81.0±8.4模型組 10 587.6±48.9① 153.4±18.0① 96.4±9.7①小劑量甲基蓮心堿 10 511.2±50.4①②136.6±18.4① 104.3±9.8①大劑量甲基蓮心堿 10 489.0±46.3①② 122.1±18.8①② 110.5±10.1①②

2.4 各組小鼠肝組織病理學表現的變化 正常組小鼠肝組織細胞排列規(guī)則，無炎性細胞浸潤或細胞壞死；模型組小鼠肝組織炎性細胞浸潤明顯，肝細胞呈灶性壞死；小劑量甲基蓮心堿處理組小鼠肝組織有少量炎性細胞浸潤，細胞排列較混亂；大劑量甲基蓮心堿處理組小鼠肝組織病變減輕，僅有小部分炎性細胞浸潤（圖1）。

圖1 各組小鼠肝組織病理學表現（HE，400×）

2.5 實驗組動物存活率比較 模型組小鼠12 h存活率為60.0%，24 h存活率為10.0%；小劑量甲基連心堿處理組小鼠12 h存活率為80.0%，24 h存活率為50.0%，而大劑量甲基蓮心堿處理組小鼠12 h存活率為90.0%，24 h存活率為70.0%（圖2），組間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖2 三組小鼠存活率比較

3 討論

磷酸尿苷對維持肝細胞結構和功能有著重要的作用[6]，D-半乳糖胺能夠降低肝細胞內磷酸尿苷含量[7]。脂多糖可激發(fā)機體免疫系統(tǒng)，進而釋放大量的炎性細胞因子，阻礙肝臟微循環(huán)，引發(fā)肝臟缺血、缺氧和氧化應激反應等，引起肝損傷[8-9]。本研究通過觀察模型組小鼠存活情況，得知24 h內死亡10只，存活率僅為10.0%。同時，血清ALT和AST水平急劇升高。進一步觀察肝組織病理學表現發(fā)現，肝組織細胞排列混亂，大量炎性細胞浸潤，肝細胞呈現灶性壞死。以上結果表明，本次通過D-半乳糖胺和脂多糖誘導的急性肝損傷小鼠模型制備成功。

給予小鼠甲基蓮心堿預處理后，其血清ALT和AST水平降低，肝組織病理學切片觀察顯示肝損傷情況得到一定程度的緩解，而小鼠存活率也得到明顯提升，提示應用甲基蓮心堿對于D-半乳糖胺和脂多糖誘導的急性肝損傷具有保護作用。當機體處于氧化應激狀態(tài)時，會發(fā)生脂質過氧化，血清MDA水平升高[10]。本研究模型組小鼠血清MDA水平急劇升高，表明其氧化應激程度較高。SOD可催化超氧陰離子分解，產生氧氣和過氧化氫[11]。GSH是谷胱甘肽過氧化物酶的底物，能反映機體抗氧化和清除氧自由基的能力，其與抗氧化酶共同作用，減弱氧化應激損傷[12，13]。本研究結果顯示，模型組小鼠血清SOD和GSH水平降低，表明其肝臟內發(fā)生了劇烈的氧化應激反應，與以往研究結果一致[14-16]。給予甲基蓮心堿灌胃處理的小鼠，其血清MDA水平顯著降低，而血清SOD和GSH水平顯著升高，表明甲基蓮心堿可有效抑制肝臟內氧化應激反應，有效保護肝臟損傷。有研究[17，18]顯示，在肝臟發(fā)生急性損傷時，機體釋放大量的TNF-α和IL-6等炎性細胞因子，促進炎性細胞浸潤，導致炎性反應更趨嚴重。IL-10具有抗炎作用，能夠直接抑制TNF-α生成，間接抑制IL-6生成[19，20]。本研究發(fā)現，甲基蓮心堿能夠降低急性肝損傷小鼠血清TNF-α和IL-6水平，升高IL-10水平，其結果說明甲基蓮心堿還可以調節(jié)炎性因子的釋放，進而發(fā)揮保護肝臟作用。

綜上所述，甲基蓮心堿可抑制氧化應激反應，有效保護肝臟損傷，其機制可能與降低血清MDA、TNF-α和IL-6水平，升高SOD、GSH和IL-10水平有關。下一步我們將檢測小鼠肝組織SOD、GSH、MDA、TNF-α、IL-6和IL-10 mRNA水平，進一步從基因水平研究甲基蓮心堿保護肝臟的分子機制。