東北七鰓鰻TRAF6基因克隆、表達(dá)分析及亞細(xì)胞定位研究

丁少青 周澤斌 王雅倩 羅 鑫 何緣圓 任建峰 李偉明 張慶華

(1. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 201306; 2. 上海海洋大學(xué)中國科學(xué)技術(shù)部海洋生物科學(xué)

國際聯(lián)合研究中心, 上海 201306; 3. 上海海洋大學(xué)國家水生動(dòng)物病原庫, 上海 201306;4. 密歇根州立大學(xué)漁業(yè)與野生生物系, 東蘭辛, 密歇根, 美國 48824)

高等脊椎動(dòng)物如哺乳類和鳥類主要依靠適應(yīng)性免疫系統(tǒng)抵御病原菌的入侵, 而昆蟲和低等脊椎動(dòng)物(魚類和兩棲類)主要依靠反應(yīng)速度更快、非特異性的先天免疫系統(tǒng)[1,2]。先天免疫系統(tǒng)是機(jī)體抵御病原微生物入侵的第一道防線, 依靠細(xì)胞表面表達(dá)的模式識(shí)別受體(Pattern-recognition receptors,PRRs)來識(shí)別病原相關(guān)分子模式(Pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)。Toll樣受體(Tolllike receptors, TLRs)作為重要的模式識(shí)別受體, 能夠識(shí)別保守的PAMPs并觸發(fā)信號(hào)通路, 在先天免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用[3]。

在TLRs識(shí)別PAMPs后, 募集接頭蛋白髓樣分化因子88 (Myeloid differentiation factor 88, MyD 88), 其死亡結(jié)構(gòu)域與白介素1受體相關(guān)激酶4 (IL-1R associated kinase 4, IRAK4)的死亡結(jié)構(gòu)域相互作用, 然后IRAK4將IRAK1募集到復(fù)合物中, 導(dǎo)致其磷酸化和活化[4]。接著IRAK1和IRAK4從復(fù)合物中解離出來并與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6 (Tumor necrosis factor receptor-associated factor 6,TRAF6)相互作用[5]。信號(hào)經(jīng)過傳導(dǎo), 最終激活核因子-κB (Nuclear factor kappa B, NF-κB)和絲裂原激活蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases, MAPKs)[6]。TRAF6在脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物中也相繼被發(fā)現(xiàn), 如鯉(Cyprinus carpio)[7]、斑馬魚(Daniorerio)[8,9]、草魚(Ctenopharyngodon idella)[10]、櫛孔扇貝(Chlamys farreri)[11]、蝦夷扇貝(Mizuhopecten yessoensis)[12]、凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)[13]以及刺參(Apostichopus japonicus)[14]等。TRAF6除了介導(dǎo)免疫信號(hào)傳導(dǎo)外, 還在各種生理過程中發(fā)揮重要作用, 例如破骨細(xì)胞形成, 樹突狀細(xì)胞、皮膚附屬組織和乳腺的發(fā)育, 淋巴結(jié)的形成以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育等[15—21]。

七鰓鰻(Lamprey)屬于圓口綱(Cyclostomata),七鰓鰻目(Petromyzoniformes), 七鰓鰻科(Petromyzontidae), 是一種古老的無頜類動(dòng)物, 在進(jìn)化上處于無脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物之間, 對其免疫系統(tǒng)的研究有著重要的進(jìn)化意義。與高等脊椎動(dòng)物相比, 七鰓鰻沒有完整的胸腺, 其類淋巴細(xì)胞中尚未分化出T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞[22,23], 其免疫應(yīng)答模式落后于硬骨魚(具有部分或完整的獲得性免疫), 是研究免疫系統(tǒng)進(jìn)化的一個(gè)良好模型。本研究首次克隆東北七鰓鰻(Lethenteron morii)TRAF6基因的cDNA全長序列, 分析了其在不同生長階段各組織中的組成型表達(dá)和病原菌感染后的誘導(dǎo)表達(dá), 以及在HEK293T細(xì)胞中的定位情況, 為TRAF6基因在免疫系統(tǒng)中的進(jìn)化及功能的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

健康東北七鰓鰻取自遼寧省丹東市鴨綠江支流, 暫養(yǎng)期間養(yǎng)殖水溫保持在(8±1)℃。幼魚體長(11.5±0.8) cm, 體重(5.2±0.6) g, 成魚體長(30.1±3.2) cm, 體重(36.1±2.1) g。銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa) PA11株是本實(shí)驗(yàn)室分離自患病東北七鰓鰻, 保存于-80℃冰箱。

1.2 試劑

DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、DNA Marker、克隆載體pMD19-T、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser等購買于TaKaRa公司; Lipofectamine?2000、Trizol購買于Invitrogen公司; PCR產(chǎn)物回收試劑盒、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、感受態(tài)細(xì)菌DH5α購買于北京天根生物科技有限公司; LightCycler 480 SYBR Green I Master購買于Roche公司; Hoechst 33342購自于Solarbio公司, LB培養(yǎng)基、甘油、乙醇等其他藥品購買于上海生工生物工程技術(shù)有限公司。

1.3 RNA提取及cDNA合成

分別選取3尾健康東北七鰓鰻的幼魚和成魚,取腦、腸、心、鰓、肝、肌肉、腎、脂肪體和皮膚等9個(gè)組織。利用Trizol法提取總RNA, 并用1%瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 2000分光光度計(jì)檢測其濃度和質(zhì)量, 然后保存于-80℃冰箱。攻毒組以500 μL/100 g劑量, 濃度為1.96×106CFU/mL銅綠假單胞菌對東北七鰓鰻成魚進(jìn)行腹腔注射, 分別于注射后0、6h、12h、24h、48h和72h取脂肪體、鰓、腸、腎等組織提取RNA, 檢測濃度和質(zhì)量后保存于-80℃冰箱。用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄, 實(shí)際操作根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 TRAF6基因引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增

根據(jù)已有的日本七鰓鰻和海七鰓鰻轉(zhuǎn)錄組和基因組數(shù)據(jù), 通過生物信息學(xué)方法初步篩選到TRAF6的mRNA序列以及DNA序列, 然后根據(jù)七鰓鰻物種間基因的高度保守性設(shè)計(jì)引物, 其中TRAF6-F1/R1是在該基因的5′端和3′端設(shè)計(jì)的, 得到包含5′UTR和3′UTR的全長序列; 為獲得更長的TRAF6基因的3′端序列, 設(shè)計(jì)了3′端分段擴(kuò)增的引物TRAF6-F2/R2和TRAF6-F3/R3。并由上海生工生物技術(shù)有限公司合成(表 1)。以東北七鰓鰻的肌肉、鰓、腸等混合cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 25 μL PCR體系如下: Premix 12.5 μL, ddH2O 9.5 μL, 上游引物1 μL, 下游引物1 μL, cDNA模板1 μL。反應(yīng)條件如下: 98℃預(yù)變性2min, 98℃變性30s, 58℃退火30s, 72℃延伸1min, 共35個(gè)循環(huán); 72℃延伸5min,12℃保存。PCR產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,切膠純化回收目的片段, 然后將產(chǎn)物與pMD19-T載體連接, 并轉(zhuǎn)化至DH5α中, 氨芐抗性平板篩選陽性克隆并進(jìn)行菌液PCR鑒定, 最后送往上海生工生物技術(shù)有限公司測序。

1.5 TRAF6基因序列分析

利用NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)的BLASTP工具進(jìn)行同源基因序列的查找,利用Getorf軟件(http://emboss.bioinformatics.nl/cgibin/emboss/getorf)預(yù)測開放閱讀框, 利用ExPASy(http://web.expasy.org/protparam/)軟件預(yù)測蛋白分子量及等電點(diǎn), 利用SMART (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)和PROSITE (https://prosite.expasy.org/)軟件預(yù)測和分析蛋白結(jié)構(gòu)域。利用PSORT II (https://psort.hgc.jp/form2.html)軟件預(yù)測亞細(xì)胞定位。利用DNAMAN6.0進(jìn)行氨基酸序列比對以及MEGA7.0軟件中的鄰接法(Neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.6 TRAF6基因組織表達(dá)分析

利用實(shí)時(shí)熒光定量方法(qPCR)檢測TRAF6基因在東北七鰓鰻幼魚和成魚不同組織中的表達(dá), 以β-actin基因做為內(nèi)參基因。TRAF6特異性引物為TRAF6-qF和TRAF6-qR;β-actin特異性引物為βactin-qF和β-actin-qR (表 1)。在LightCycler 480 II熒光定量PCR儀上進(jìn)行qPCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為:Master Mix 10 μL, ddH2O 7 μL, 上游引物1 μL, 下游引物1 μL, cDNA 1 μL; 反應(yīng)條件為: 50℃ 2min,95℃ 10min; 95℃ 10s, 60℃ 30s, 40個(gè)循環(huán); 95℃30s, 60℃ 30s, 40℃ 30s。每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù), 陰性對照設(shè)置3個(gè)無cDNA模板的樣品, 用2-ΔΔCt法計(jì)算相對表達(dá)量, 實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SEM)表示, 圖形制作及數(shù)據(jù)分析由GraphPad Prism 5軟件完成,P＜0.05表示具有顯著性差異。

1.7 TRAF6基因在銅綠假單胞菌感染后的組織表達(dá)分析

檢測脂肪體、鰓、腸、腎等組織中TRAF6基因在不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)變化, 分析TRAF6基因在細(xì)菌感染后的相對表達(dá)量。所用定量引物和分析方法同1.6。

1.8 TRAF6基因細(xì)胞定位

pEGFP-TRAF6重組質(zhì)粒構(gòu)建使用本實(shí)驗(yàn)室保存的綠色熒光蛋白質(zhì)粒pEGFP-N1, 用含有酶切位點(diǎn)的引物(表 1)擴(kuò)增去掉終止密碼子(TGA)的TRAF6基因, 經(jīng)HindⅢ和BamHⅠ雙酶切后, 通過T4連接酶將其連接至pEGFP-N1真核表達(dá)載體。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)DH5α中, 挑選陽性克隆, 并通過雙酶切鑒定。

（3）資金使用績效有待提高。部分項(xiàng)目實(shí)施單位對項(xiàng)目資金使用績效管理工作認(rèn)識(shí)不足，現(xiàn)階段監(jiān)管制度也不夠完善，導(dǎo)致“重爭取、輕績效”，“重分配、輕管理”的現(xiàn)象仍然存在，造成部分項(xiàng)目資金使用沒有達(dá)到預(yù)期績效目標(biāo)。

pEGFP-TRAF6轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染前24h將細(xì)胞接種于6孔板, 融合率達(dá)到80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。設(shè)置pEGFP-N1為空載對照, 轉(zhuǎn)染12h后換液,48h后用Hoechst 33342進(jìn)行細(xì)胞核染色, Olymapus顯微鏡進(jìn)行熒光拍照。

2 結(jié)果

2.1 東北七鰓鰻TRAF6基因序列分析

LmTRAF6的cDNA全長為2751 bp, 包含127 bp的5′端非編碼區(qū)、1785 bp的開放閱讀框(ORF)和839 bp的3′端非編碼區(qū), 共編碼594個(gè)氨基酸, 具有典型的AATAAA加A尾信號(hào)。其相對分子質(zhì)量為65.596 kD, 理論等電點(diǎn)(Isoelecric point)為6.25。序列提交至GenBank獲得的登錄號(hào)為MH016957。SMART和InterProScan軟件預(yù)測分析了TRAF6的蛋白結(jié)構(gòu)域, 結(jié)果表明該蛋白包含了4個(gè)結(jié)構(gòu)域: N端的RING結(jié)構(gòu)域(65—103 aa)、2個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域(146—187 aa、199—248 aa)、C端的環(huán)-環(huán)(Coiled-coil)α螺旋結(jié)構(gòu)域(352—388 aa)以及TRAF同源結(jié)構(gòu)域MATH (392—543 aa)。PSORT II軟件預(yù)測分析了Lm-TRAF6的亞細(xì)胞定位情況, 結(jié)果發(fā)現(xiàn), 該蛋白位于細(xì)胞核的概率為47.8%, 位于細(xì)胞質(zhì)的概率為30.4%, 位于高爾基體、分泌系統(tǒng)小囊泡的概率均為4.3%。

2.2 東北七鰓鰻TRAF6氨基酸序列的同源性及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

將LmTRAF6的氨基酸序列與其他物種的同源序列進(jìn)行比對分析, LmTRAF6的氨基酸序列與其他物種的一致性(Identity)均在43%—48%, 其中與美麗硬仆骨舌魚(Scleropages formosus)(KPP69926.1)和矛尾魚(Latimeria chalumnae)(XP_005987021.2)的一致性最高, 均達(dá)到48%。與人(Homo sapiens)(NP_665802.1)、小鼠(Mus musculus)(NP_001290202.1)的一致性分別為43%和45%。利用16個(gè)物種的TRAF6氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹表明, 哺乳類、鳥類、爬行類和兩棲類TRAF6聚為一大支, 硬骨魚類TRAF6聚為一大支, 東北七鰓鰻又與這兩支聚為一大支(圖 1)。

2.3 東北七鰓鰻TRAF6基因的組織表達(dá)分析

東北七鰓鰻TRAF6基因的正常組織表達(dá)分析幼魚的TRAF6基因在心臟、腦、皮膚、肌肉、鰓、腸、肝、腎和脂肪體(Supraneural body,SN)中均有表達(dá), 其中在心臟、皮膚、鰓和肝中的表達(dá)量相對較高, 而在腸中的表達(dá)量相對較低。成魚的TRAF6基因在上述組織中均有表達(dá), 其中在腎、鰓和肌肉中的表達(dá)量相對較高, 而在心臟中的表達(dá)量相對較低(圖 2)。

圖 1 NJ法構(gòu)建LmTRAF6氨基酸系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 1 Phylogenetic tree constructed from LmTRAF6 amino acid with Neighbor-joining method

東北七鰓鰻TRAF6基因在銅綠假單胞菌感染后在成魚組織的表達(dá)分析成魚的鰓、腸和腎組織中TRAF6基因表達(dá)量在銅綠假單胞菌感染24h后顯著升高, 且與對照相比差異顯著(P＜0.05);隨著時(shí)間的增加TRAF6基因的表達(dá)量逐漸下降并趨于穩(wěn)定。而脂肪體組織中TRAF6基因表達(dá)量在銅綠假單胞菌感染12h后有所升高但差異不顯著(P＞0.05)(圖 3)。

2.4 東北七鰓鰻TRAF6基因的細(xì)胞定位

經(jīng)酶切鑒定, 成功構(gòu)建表達(dá)綠色熒光蛋白和目的基因融合蛋白(pEGFP-TRAF6)的重組質(zhì)粒(圖4A)，將pEGFP-TRAF6重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞。結(jié)果表明, pEGFP-TRAF6的表達(dá)與pEGFP-N1類似, 在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有表達(dá)(圖 4B)。

3 討論

3.1 LmTRAF6生物信息學(xué)分析

3.2 LmTRAF6的組織表達(dá)分析

圖 2 LmTRAF6基因在幼魚和成魚不同組織中的相對表達(dá)量Fig. 2 Relative expression of LmTRAF6 in difference tissues between juvenile and adult

本研究表明,LmTRAF6基因在檢測的各個(gè)組織中均有表達(dá), 與其他魚類中TRAF6基因的表達(dá)對比,發(fā)現(xiàn)不同物種的組織表達(dá)圖譜并不完全一致。TRAF6在斑馬魚的鰓組織中[9], 在鯉的肝和鰓組織中[7], 在麥瑞加拉鯪(Cirrhinus mrigala)的腎組織中[31], 在草魚的頭腎組織中[10]表達(dá)量最高, 而在巨石斑魚(Epinephelus tauvina)的腸和胃組織中表達(dá)量較高[32]。本研究表明, 幼魚在免疫相關(guān)組織(皮膚、鰓、肝、腎)中表達(dá)量較高, 在腸、腦等組織中表達(dá)量較低。成魚在免疫相關(guān)組織(腎、鰓、腸)中表達(dá)量較高, 在心臟、皮膚、肝、脂肪體等組織中表達(dá)量較低。在不同魚類中TRAF6在各種組織中不同的表達(dá)模式可能是因?yàn)槲锓N差異以及不同的發(fā)育階段造成的。在本實(shí)驗(yàn)中東北七鰓鰻幼魚主要以吸食其他魚類血肉為食物, 正處在生長發(fā)育的旺盛階段; 而成魚處于絕食狀態(tài), 正處在繁殖期。這可能是幼魚和成魚TRAF6基因表達(dá)量產(chǎn)生差異的原因之一。LmTRAF6基因的廣泛表達(dá)表明其在宿主各組織中的免疫監(jiān)視系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。一旦病原體侵入, 宿主就可以通過TRAF6介導(dǎo)的TLR信號(hào)通路等觸發(fā)免疫應(yīng)答反應(yīng)。

3.3 LmTRAF6參與抗細(xì)菌感染的免疫應(yīng)答

在魚類上的研究表明,TRAF6廣泛參與到TLR信號(hào)通路對細(xì)菌、病毒、寄生蟲引起的免疫應(yīng)答中。例如, 草魚在被多子小瓜蟲(Ichthyophthirius multifiliis)感染后,TRAF6表達(dá)量顯著上調(diào)3.0—5.4倍[10]。斑馬魚在被烏鱧彈狀病毒(Snakehead rhabdovirus, SHRV)和遲緩愛德華菌(Edwardsiella tarda)感染后,TRAF6表達(dá)量分別上調(diào)3.6—4.5倍和0.8—10.3倍[9]。斜帶石斑魚(Epinephelus coioides)在刺激隱核蟲(Cryptocaryon irritans)感染后,TRAF6表達(dá)量上調(diào)3.0—7.0倍[33]。本研究表明,LmTRAF6可以被細(xì)菌誘導(dǎo)表達(dá), 在成魚的免疫器官如腸、腎和鰓中, 在銅綠假單胞菌感染24h后表達(dá)量顯著上調(diào), 分別上調(diào)1.7、2.4和3.6倍。相比于其他魚類受到感染后TRAF6的表達(dá)情況, 本實(shí)驗(yàn)中東北七鰓鰻在銅綠假單胞菌感染后, 各免疫器官中TRAF6基因上調(diào)倍數(shù)相對較低, 可能與實(shí)驗(yàn)物種此時(shí)處于絕食產(chǎn)卵期, 機(jī)體的免疫力相對較弱有關(guān), 因此對細(xì)菌感染的應(yīng)答反應(yīng)較弱, 或者與病原的種類有關(guān)。另外, 這也說明了七鰓鰻做為低等的無頜類脊椎動(dòng)物,其免疫應(yīng)答模式可能不同于其他魚類。

3.4 LmTRAF6亞細(xì)胞定位分析

圖 3 銅綠假單胞菌感染后LmTRAF6基因在成魚各組織的表達(dá)量變化Fig. 3 LmTRAF6 expression in adult lamprey tissues challenged by P. aeruginosa

圖 4 pEGFP-TRAF6重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定(A)和pEGFP-TRAF6在HEK293T細(xì)胞中的定位(B)Fig. 4 Identification of pEGFP-TRAF6 recombinant plasmid (A) and intracellular localization of pEGFP-TRAF6 in HEK293T (B)

TLR信號(hào)通路中關(guān)鍵分子的定位對于理解蛋白質(zhì)功能和分子機(jī)制具有重要作用[34]。本研究顯示, pEGFP-TRAF6定位在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中, 與生物信息學(xué)分析結(jié)果一致。TRAF6在細(xì)胞質(zhì)中的定位在人類中已有報(bào)道, TLR受到白細(xì)胞介素-1(Interleukin-1, IL-1)刺激后, IRAK在膜上與TRAF6形成復(fù)合物, 之后TRAF6解離, 從膜上轉(zhuǎn)位到細(xì)胞質(zhì)中, 在胞質(zhì)中形成TRAF6-TAK1-TAB 1-TAB 2復(fù)合物, TAK1被活化, 接著TAK1、TAB 1、TAB 2磷酸化, 最終激活NF-κB和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)[35]。TRAF6不僅存在于細(xì)胞質(zhì)中, 在正常和惡性B淋巴細(xì)胞的細(xì)胞核中也有定位[36,37], TRAF6與原癌基因c-myb(Proto-oncogene c-Myb)5′端的啟動(dòng)子相互作用, 負(fù)向調(diào)節(jié)B淋巴細(xì)胞核中的c-myb, 以維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和免疫監(jiān)視[37]。

本研究克隆了東北七鰓鰻TRAF6基因的cDNA全長, 該基因與哺乳類和魚類相比, 具有相似的結(jié)構(gòu)域。LmTRAF6在檢測的各組織中均有表達(dá), 銅綠假單胞菌感染后表達(dá)量發(fā)生顯著上調(diào)。這些結(jié)果表明LmTRAF6可能參與到細(xì)菌引起的免疫應(yīng)答, 但LmTRAF6對細(xì)菌做出免疫應(yīng)答的機(jī)制以及生物學(xué)功能有待進(jìn)一步研究。