棕鞭藻及其培養(yǎng)濾液對(duì)銅綠微囊藻生長及生理特性的影響

施軍瓊 楊燕君 董聰聰 張紅波 吳忠興

(西南大學(xué)三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 重慶市三峽庫區(qū)植物生態(tài)與資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 重慶 400715)

近年來, 隨著水體富營養(yǎng)化的加劇, 國內(nèi)外許多湖泊均出現(xiàn)了大量的藍(lán)藻水華。藍(lán)藻水華的發(fā)生不僅導(dǎo)致水體透明度下降, 水質(zhì)惡化, 產(chǎn)生異味,對(duì)水體的多種用水功能和觀賞功能造成嚴(yán)重?fù)p害[1]。關(guān)于藍(lán)藻水華發(fā)生過程和機(jī)制的研究已有大量的報(bào)道[2—4], 然而, 迄今為止的藍(lán)藻水華的發(fā)生機(jī)理研究仍未能清楚地闡釋。

浮游植物種群或群落的變化不僅與外界環(huán)境因素有關(guān), 而且還與其周邊的其他生物種群有著密不可分的作用與聯(lián)系。大量研究表明, 種間關(guān)系是決定微藻群落形成的多樣性和穩(wěn)定性的主要因素[5,6]。Pratt[7]研究發(fā)現(xiàn)硅藻骨條藻(Skeletonema costatum)引起的赤潮和黃藻金黃滑盤藻(Olisthodiscus luteus)的赤潮交替發(fā)生原因是骨條藻的濾液有促進(jìn)金黃滑盤藻增殖的作用, 而金黃滑盤藻的濾液卻明顯地阻礙了骨條藻的增殖。對(duì)Scandinavian水體調(diào)查發(fā)現(xiàn), 小定鞭金藻(Prymnesium parvum)經(jīng)常在春季硅藻赤潮之后、藍(lán)綠藻赤潮之前暴發(fā)[8]。Fistarol等[9]通過模擬實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)小定鞭金藻的濾液能在幾天之內(nèi)改變赤潮群落的結(jié)構(gòu), 表明小定鞭金藻濾液可能存在化感作用使群落出現(xiàn)由硅藻向藍(lán)綠藻演替的現(xiàn)象。因此, 研究微藻的化感作用對(duì)種群結(jié)構(gòu)的形成、穩(wěn)定以及水華藻種的演替具有重要的生態(tài)學(xué)意義。

棕鞭藻(Ochromonas)屬于金藻綱 (Chrysophyceae)、棕鞭藻科 (Ochromonadaceae)、棕鞭藻屬。研究已經(jīng)表明其能夠抑制微囊藻和蛋白核小球藻的生長[10—14], 但對(duì)其化感的研究未見報(bào)道。因此,本論文對(duì)分離的棕鞭藻及其培養(yǎng)液對(duì)微囊藻的生長及生理特性的影響展開研究, 旨在了解棕鞭藻對(duì)微囊藻的生長、繁殖的生態(tài)效應(yīng), 為揭示生態(tài)系統(tǒng)中生物之間的復(fù)雜關(guān)系提供一定的理論依據(jù), 也為微囊藻水華的形成和控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 藻種來源和培養(yǎng)條件

銅綠微囊藻FACHB-905(Microcystis aeruginosaFACHB-905)來自中國科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫。棕鞭藻(Ochromonassp.)分離于重慶北碚一公園形成微囊藻水華的水體。藻種在光強(qiáng)為25 μE/(m2.s), 溫度為(25±1)℃, 光周期為L∶D=12h∶12h的BG11完全培養(yǎng)基[15]中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期進(jìn)行共培養(yǎng)和濾液實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)分為共培養(yǎng)和濾液培養(yǎng)2部分。在共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中, 棕鞭藻細(xì)胞密度保持不變, 為0.5×106個(gè)/L,微囊藻細(xì)胞密度分別設(shè)置為2.13×106、0.5×106和0.125×106個(gè)/L, 使得棕鞭藻和微囊藻接種比例為1∶4、1∶1和4∶1。按比例接種到250 mL的錐形瓶中,在25℃、光周期L∶D=12h∶12h條件下混合培養(yǎng), 單獨(dú)培養(yǎng)的棕鞭藻和微囊藻作為對(duì)照, 每天取樣, 用浮游植物計(jì)數(shù)框?qū)煞N藻的密度進(jìn)行統(tǒng)計(jì), 實(shí)驗(yàn)處理4d。

濾液培養(yǎng): 棕鞭藻按照1×105個(gè)/L初始密度, 在25℃、光周期L∶D=12h∶12h條件下, 培養(yǎng)至穩(wěn)定期后, 過濾, 去除棕鞭藻, 然后把棕鞭藻培養(yǎng)液用孔徑0.22 μm的GC微孔濾膜抽濾, 得到的即為棕鞭藻無細(xì)胞培養(yǎng)濾液。取銅綠微囊藻80 mL置于250 mL錐形瓶中, 試驗(yàn)處理組添加30 mL棕鞭藻培養(yǎng)濾液,對(duì)照組添加30 mL BG11 培養(yǎng)基, 保持培養(yǎng)液總體積為150 mL。試驗(yàn)組和對(duì)照組藻密度在試驗(yàn)起始時(shí)無顯著差異(P＞ 0.05)。置于光照培養(yǎng)箱中, 實(shí)驗(yàn)處理7d。培養(yǎng)條件同上, 所有操作過程均在無菌狀態(tài)下進(jìn)行。

1.3 微囊藻粗酶液制備

取各處理藻樣30 mL, 在4℃, 10000 r/min冷凍離心7min, 去上清液后, 加入1 mL的磷酸緩沖溶液(PBS pH 7.0), 液氮研磨, 再用PBS定容至3.0 mL,4℃離心, 上層清液即為酶液, 酶液用來測定丙二醛、過氧化氫酶活性及可溶性蛋白等指標(biāo)。

1.4 丙二醛(Malondialdehyde, MDA)含量及過氧化氫酶(Catalase, CAT)的活性測定

膜脂過氧化的產(chǎn)物之一丙二醛(MDA), 其濃度的變化常作為脂質(zhì)過氧化指標(biāo), 表示細(xì)胞膜脂過氧化過程和對(duì)逆境條件反應(yīng)的強(qiáng)弱, 以每毫克蛋白MDA含量為單位[16]。過氧化氫酶采用鉬酸銨法,結(jié)果以每毫克蛋白質(zhì)使反應(yīng)體系在1h內(nèi)在365 nm的吸收值下降0.1為1個(gè)酶活單位表示[17]。

1.5 可溶性蛋白含量及胞外多糖(Extracellular polysaccharides, EPS)測定

可溶性蛋白含量測定含量采用考馬斯亮藍(lán)結(jié)合法測定[18]。胞外多糖的測定采用苯酚-硫酸法[19]。

1.6 細(xì)胞計(jì)數(shù)

每天定時(shí)取出1 mL均勻的培養(yǎng)液, 用5%甲醛固定, 并在顯微鏡下細(xì)胞數(shù)通過浮游植物計(jì)數(shù)框在Olympus CX41顯微鏡進(jìn)行計(jì)數(shù), 平行計(jì)數(shù)3—5 次,每次誤差＜15%, 取平均值作為其細(xì)胞數(shù)。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次, 數(shù)據(jù)中的“±”表示標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)。顯著性檢驗(yàn)由Origin 6.1 (Microcal Software Inc.)的Statistic程序進(jìn)行one way-ANOVA統(tǒng)計(jì),P＜0.05時(shí)表示差異顯著,P＜0.01時(shí)表示差異極其顯著。

2 結(jié)果

2.1 共培養(yǎng)過程棕鞭藻與微囊藻的種群動(dòng)態(tài)

分離到的鞭毛藻類, 藻體不透明, 具有2個(gè)色素體, 片狀、周生, 色素體淡黃色; 球形、橢圓形或卵形, 具有2根不等長的鞭毛, 從細(xì)胞頂部伸出; 長鞭毛25—37 μm, 平均28 μm左右, 短鞭毛7—12 μm, 平均9 μm左右。一般藻細(xì)胞直徑為15—25 μm, 平均20 μm, 個(gè)體大小因吞噬物的多少和不同變化較大。在靠近鞭毛基部, 有一個(gè)伸縮泡(圖 1A)。因此,將其歸為金藻門(Chrysophyta)、金藻綱(Chrysophyceae)、色金藻目(Chromulinales)、棕鞭藻科(Ochromonadaceae)、棕鞭藻屬(Ochromonas)。當(dāng)該藻與微囊藻共同培養(yǎng), 能夠大量攝食微囊藻, 一個(gè)棕囊藻細(xì)胞內(nèi)甚至可以發(fā)現(xiàn)7—8個(gè)微囊藻細(xì)胞(圖 1B)。

圖 1 攝食微囊藻前后的棕鞭藻形態(tài)Fig. 1 The morphology of Ochromonas sp. before and after grazing Microcystis aeruginosa

當(dāng)按3種不同細(xì)胞密度比例(1∶4、1∶1和4∶1)培養(yǎng)微囊藻和棕鞭藻, 連續(xù)培養(yǎng) 4d, 每天計(jì)數(shù) 1次, 統(tǒng)計(jì)微囊藻和棕鞭藻的種群動(dòng)態(tài)變化, 并繪制種群動(dòng)態(tài)變化曲線 (圖 2)。從圖中可以看出, 棕鞭藻共培養(yǎng)時(shí)的生長狀況都比單獨(dú)培養(yǎng)的對(duì)照組好, 而微囊藻共培養(yǎng)后生長狀況較差, 細(xì)胞密度到第4天時(shí)降到最低值。

圖 2 不同接種密度對(duì)微囊藻和棕鞭藻細(xì)胞數(shù)的影響Fig. 2 The effect of different inoculated density on both Microcystis and Ochromonas

當(dāng)棕鞭藻與微囊藻的細(xì)胞密度比為 1∶1 時(shí)( 圖2A) , 4d后, 對(duì)照組微囊藻和棕鞭藻細(xì)胞數(shù)分別從0.5×106和0.5×106個(gè)/L增加到1.87×106和0.79×106個(gè)/L, 增加了約3.7和1.6倍。在共培養(yǎng)條件下, 微囊藻細(xì)胞數(shù)迅速降低, 由原來的0.5×106個(gè)/L下降到0(P＜0.01); 而棕鞭藻細(xì)胞數(shù)則顯著增加, 由原來的0.5×106個(gè)/L增加到1.43×106個(gè)/L, 增加了約2.9倍(P＜0. 05)。當(dāng)棕鞭藻與微囊藻的細(xì)胞密度比為 1∶4時(shí)(圖 2B) , 4d后, 對(duì)照組微囊藻和棕鞭藻細(xì)胞數(shù)增加了約3.5和1.6倍。在共培養(yǎng)條件下, 微囊藻細(xì)胞數(shù)先增加后迅速降低, 到第2天達(dá)到最高值 (P＜0.05); 而棕鞭藻細(xì)胞數(shù)則顯著增加, 由原來的0.5×106個(gè)/L增加到1.81×106個(gè)/L, 增加了約3.6倍(P＜0. 05)。當(dāng)棕鞭藻與微囊藻的細(xì)胞密度比為 4∶1時(shí)(圖 2C) , 4d后, 對(duì)照組微囊藻和棕鞭藻細(xì)胞數(shù)增加了約3.7和1.6倍。而在共培養(yǎng)條件下, 微囊藻細(xì)胞數(shù)則迅速降低(P＜0.01); 棕鞭藻細(xì)胞數(shù)則顯著增加,由原來的0.5×106個(gè)/L增加到1.29×106個(gè)/L, 增加了約2.6倍(P＜0. 05)。

2.2 棕鞭藻胞外濾液對(duì)微囊藻生理特性的影響

棕鞭藻胞外濾液對(duì)微囊藻的生長影響 對(duì)單獨(dú)培養(yǎng)的微囊藻以及棕鞭藻培養(yǎng)液處理的微囊藻的細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù), 結(jié)果表明(圖 3)單獨(dú)培養(yǎng)的微囊藻細(xì)胞數(shù)表現(xiàn)出一直增加的態(tài)勢, 培養(yǎng)7d后,細(xì)胞數(shù)增加約5.5倍(P＜0.01); 然而, 棕鞭藻培養(yǎng)液處理7d后, 微囊藻細(xì)胞數(shù)由初始的(2.72±0.65)×106個(gè)/L增加到(7.83±0.08)×106個(gè)/L, 增幅約為2.9倍(P＜0.05)。

圖 3 不同處理下微囊藻細(xì)胞數(shù)變化Fig. 3 Changes of cell number in Microcystis aeruginosa at different treatments

棕鞭藻胞外濾液對(duì)微囊藻的丙二醛(MDA)含量及過氧化氫酶(CAT)活性的影響如圖 4所示, 單獨(dú)培養(yǎng)的微囊藻MDA含量和CAT活性一直保持較低的水平, 處理7d后, 差異不顯著(P＞0.05);而棕鞭藻培養(yǎng)液處理微囊藻7d后, MDA含量由初始的(1.52±0.08) μmol/mg proteins增加到(13.98±0.69) μmol/mg proteins (P＜0.01, 圖 4A)。CAT活性由初始的(0.05±0.08) U/mg proteins增加到(0.46±0.05) U/mg proteins, 增加了8.2倍(P＜0.01, 圖 4B)。

圖 4 不同處理下微囊藻丙二醛(MDA)含量及過氧化氫酶(CAT)活性變化Fig. 4 The change of malondialdehyde (MDA) and catalase(CAT) in Microcystis aeruginosa at different treatments

棕鞭藻胞外濾液對(duì)微囊藻的胞外多糖(EPS)的影響 如圖 5所示, 單獨(dú)培養(yǎng)的微囊藻, 3d后胞外多糖含量比初始時(shí)含量約增加了2倍, 之后胞外多糖含量增加減緩(P＞0.05); 然而, 棕鞭藻培養(yǎng)液處理的微囊藻胞外多糖顯著增加, 7d后胞外多糖含量由初始的(1.10±0.13) pg/cell增加到(6.04±0.17) pg/cell,增加了449.09%(P＜0.01)。

圖 5 不同處理下微囊藻胞外多糖含量的變化Fig. 5 The extracellular polysaccharides of Microcystis aeruginosa at different treatments

3 討論

3.1 棕鞭藻與微囊藻種群動(dòng)態(tài)變化

1973年, Daley等[10]在開放體系中培養(yǎng)藍(lán)藻組囊藻(Anacystis nidulans)時(shí)發(fā)現(xiàn)接種少量的自身污染物(Ochromonas)后, 組囊藻在6-24h內(nèi)細(xì)胞生物量降至極低水平, 首次發(fā)現(xiàn)了棕鞭藻的吞食作用。隨后, Baeka等[11]比較了棕鞭藻對(duì)有毒和無毒微囊藻的攝食。楊曉景等[12]研究發(fā)現(xiàn)滇池水體分離的棕鞭藻(Ochromonassp.)對(duì)惠氏微囊藻(Microcystis wesenbergii)具有很強(qiáng)的吞食能力, 共培養(yǎng)至6d時(shí),微囊藻去除率達(dá)到90%以上。本研究也發(fā)現(xiàn)銅綠微囊藻FACHB-905與棕鞭藻共培養(yǎng)后, 微囊藻細(xì)胞數(shù)第4天顯著降低, 約減少為初始細(xì)胞數(shù)的90%以上, 且效果隨著微囊藻濃度的變化而變化(圖 1)。同時(shí), 本研究也發(fā)現(xiàn)當(dāng)棕鞭藻共培養(yǎng)后, 細(xì)胞數(shù)顯著高于單獨(dú)培養(yǎng)(圖 1), 表明棕鞭藻不僅能夠自養(yǎng)生長, 而且能夠異養(yǎng)生長, 且異養(yǎng)生長顯著高于自養(yǎng)生長, 進(jìn)一步支持了前人研究結(jié)論, 即棕鞭藻對(duì)微囊藻較強(qiáng)的攝食能力。此外, 彭玉輔在滇池(海埂公園)近岸水域水華發(fā)生區(qū)分離到能夠攝食微囊藻的棕鞭藻, 并研究在不同的環(huán)境條件下棕鞭藻對(duì)惠氏微囊藻的吞食效果, 發(fā)現(xiàn)棕鞭藻的最適吞食溫度約為30℃, 且棕鞭藻濃度越大, 吞食微藻的作用越明顯[14]。這表明棕鞭藻和微囊藻能夠共存于同一個(gè)生境, 且對(duì)微囊藻具有攝食能力, 因此具有控制藻類水華的潛能。然而, 劉新堯等[19]認(rèn)為不像營養(yǎng)源控制(下行調(diào)控)和“生物操縱”等會(huì)對(duì)湖泊生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生根本的改變, 而使用食藻生物控制法不僅能短期內(nèi)控制藻類生物量或者阻止藻類大量增殖而且也不影響湖泊生態(tài)系統(tǒng), 具有潛在的優(yōu)勢。綜合本研究和前人研究結(jié)果, 棕鞭藻能夠攝食微囊藻,因此可作為潛在的藻類水華控制生物, 抑制早期藻類大量增殖。然而, 由于湖泊藍(lán)藻水華的復(fù)雜性,藍(lán)藻水華的治理絕非易事?？刂坪椭卫硭{(lán)藻水華,不僅要對(duì)藻類本身的生理學(xué)和生態(tài)學(xué)有足夠的認(rèn)識(shí), 而且要對(duì)藻類周邊環(huán)境的生物地球化學(xué)、水化學(xué)、以及湖泊生態(tài)學(xué)等方面全面的了解。因此, 利用食藻生物控制藍(lán)藻水華目前仍有許多實(shí)際應(yīng)用問題亟待去解決。

3.2 棕鞭藻培養(yǎng)液對(duì)微囊藻生理特性的影響

Tang等[20]認(rèn)為生理信號(hào)是低營養(yǎng)級(jí)生物覺察攝食壓力形成自我保護(hù)主要方式。Keating[5]指出,浮游植物之間的相互作用是通過分泌胞外有機(jī)物的方式實(shí)現(xiàn)的。大量的研究表明, 一些藻類在生長過程中會(huì)通過不斷釋放脂類、氨基酸、有機(jī)磷酸、碳水化合物以及揮發(fā)性物質(zhì)等多種胞外代謝產(chǎn)物(Extracellular products, ECP), 改變周圍環(huán)境,從而影響其他種群的生長[21,22]。Wang等[6]認(rèn)為化感作用對(duì)海洋微藻以及赤潮的暴發(fā)、消退具有重要的生態(tài)學(xué)意義。本研究發(fā)現(xiàn)棕鞭藻培養(yǎng)液處理的微囊藻的生物量的降低(圖 2), 表明棕鞭藻培養(yǎng)液抑制了微囊藻的生長。孫穎穎等[23]發(fā)現(xiàn)球等鞭金藻存在不飽和雙鍵的共軛結(jié)構(gòu)物質(zhì)能夠抑制三角褐指藻和新月菱形藻的生長。Guilard和Hellebust[24]也發(fā)現(xiàn)棕囊藻能夠分泌丙烯酸等抑藻物質(zhì)抑制藻類的生長。因此, 推測該株棕鞭藻能夠釋放某些物質(zhì)到培養(yǎng)液中, 抑制微囊藻的生長, 然而, 該棕鞭藻濾液中存在哪些抑藻物質(zhì)有待后續(xù)工作進(jìn)行深入研究。

本研究也發(fā)現(xiàn)棕鞭藻培養(yǎng)液處理后, 微囊藻的一些生理特性也發(fā)生明顯的變化, 表現(xiàn)為MDA含量和CAT活性明顯增加(圖 3)。Okamoto和Colepicolo表明環(huán)境壓力產(chǎn)生的細(xì)胞損傷是通過形成氧化壓力來實(shí)現(xiàn)的[25]。本研究發(fā)現(xiàn)在濾液培養(yǎng)下, 微囊藻的MDA含量顯著增加, 表明微囊藻細(xì)胞受到氧化損傷。而CAT酶都被認(rèn)為是細(xì)胞受到脅迫表現(xiàn)出來的抗氧化壓力的特性[16], 本研究發(fā)現(xiàn)CAT活性的增加, 表明微囊藻ROS水平增加, 并通過CAT清除體內(nèi)ROS造成傷害。這些結(jié)果進(jìn)一步說明了棕鞭藻濾液中可能存在著某些物質(zhì)來誘導(dǎo)藻類的膜脂過氧化, 影響了微囊藻的生理生化。

同時(shí), 本研究發(fā)現(xiàn)棕鞭藻培養(yǎng)液處理后, 微囊藻的可溶性胞外多糖(EPS)含量顯著增加(圖 3)。相似的結(jié)果也被Abomohra等[26]報(bào)道。Burkert等[27]認(rèn)為棕鞭藻與微囊藻共培養(yǎng)可能誘導(dǎo)微囊藻的黏液層組成和厚度發(fā)生改變。Reynolds等[28]認(rèn)為胞外多糖在細(xì)胞群體形成中具有重要的作用。已研究表明鞭毛藻的攝食[29]、微囊藻毒素的增加[30]、鈣濃度的提高[31]以及高光及氮脅迫[32]均能增加胞外多糖的含量, 進(jìn)而導(dǎo)致群體的形成。在本研究過程中, 我們也發(fā)現(xiàn)微囊藻FACHB-905有群體形成的現(xiàn)象(結(jié)果未顯示), 這說明了棕鞭藻培養(yǎng)液對(duì)微囊藻產(chǎn)生了脅迫壓力, 誘導(dǎo)了微囊藻胞外多糖的形成,促進(jìn)了微囊藻細(xì)胞的聚集, 并形成群體來應(yīng)對(duì)脅迫。

綜上所述, 本研究發(fā)現(xiàn)棕鞭藻不僅能夠攝食微囊藻細(xì)胞, 而且其培養(yǎng)濾液中可能存在著抑藻物質(zhì)抑制微囊藻細(xì)胞的生理活動(dòng), 導(dǎo)致微囊藻生長和繁殖受到抑制。因此, 棕鞭藻可作為一種潛在的藻類水華控制生物, 控制微囊藻水華的發(fā)生。