基于Masquelet誘導(dǎo)膜技術(shù)比較不同固定方式構(gòu)建的脛骨大段骨缺損模型

申震，姜自偉，李定，曾志奎，陳國茜，張嚴，李紫閣，陳柏行，黃楓，李悅

(1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣州 510405； 2. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣州 510405； 3. 江西省中醫(yī)院，南昌 330006)

大段骨缺損(massive bone defect, MBD)，是指由高能創(chuàng)傷、感染、骨腫瘤等各種原因?qū)е碌囊活惒±韺W(xué)變化，是導(dǎo)致肢體功能喪失并影響生活質(zhì)量的重要原因[1]。MBD不僅給患者生理和心理上造成了巨大的痛苦，還會產(chǎn)生嚴重的社會經(jīng)濟負擔(dān),而對于MBD的治療無論從解剖結(jié)構(gòu)重建還是功能角度重建都是骨科臨床中面臨的極大挑戰(zhàn)[2-3]。因而深入了解MBD并尋求行之有效的治療方法一直是國內(nèi)外學(xué)者的研究熱點。近些年，針對MBD涌現(xiàn)出許多新觀點和新技術(shù)[4],其中Masquelet技術(shù)因其操作簡單、治療周期短、愈合率高、適應(yīng)癥廣等優(yōu)點被廣泛應(yīng)用于治療各部位、各類型的MBD[1,5-6]。而且無論是各類型臨床報道[5]還是相關(guān)Meta分析[7]均表明Masquelet技術(shù)是臨床中治療MBD的有效方法。故而基于Masquelet技術(shù)構(gòu)建MBD模型并研究誘導(dǎo)膜特性和作用機制，對指導(dǎo)臨床深入開展該技術(shù)治療MBD具有重要的現(xiàn)實意義。目前，有多種MBD誘導(dǎo)膜模型構(gòu)建方法，在模型動物(新西蘭白兔、大鼠、小鼠等)、缺損部位(股骨、脛骨、尺橈骨等)、固定方式(內(nèi)固定鋼板、髓內(nèi)針、外固定支架等)等方面多種多樣[6,8-12]，但標準各異，尤其是各方法之間在模型質(zhì)量、應(yīng)用范圍、操作難易程度及可重復(fù)性等方面缺乏統(tǒng)一的評價標準。而構(gòu)建穩(wěn)定的、標準化的動物模型是深入研究相關(guān)疾病的基礎(chǔ)，對探究其病生理特點、相關(guān)作用機制以及治療方法都至關(guān)重要。因而為統(tǒng)一評價標準，提高實驗的可靠性和重復(fù)性，構(gòu)建標準化的動物模型，有必要選擇一種操作簡便、快捷、質(zhì)量穩(wěn)定可靠的MBD模型構(gòu)建方法。鑒于SD大鼠是醫(yī)學(xué)實驗研究最常用的動物之一[13]，而臨床中MBD最多見于脛骨部位[14-16]，故而，本研究基于Masquelet技術(shù)構(gòu)建大鼠脛骨大段骨缺損(massive tibial bone defect，MTBD)模型，并比較內(nèi)固定鋼板、髓內(nèi)針和外固定架三種固定方式在此模型中的特點，從而選擇較優(yōu)的造模方法，繼而為構(gòu)建穩(wěn)定的、標準化的MBD誘導(dǎo)膜動物模型提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

選用60只10周齡SPF級SD雄性大鼠，體重(308.50±6.00)g，購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心【SCXK (粵)2013-0034】。飼養(yǎng)及實驗操作在廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院SPF級實驗動物中【SYXK(粵)2013-0092】，實驗室溫度22～24℃，相對濕度60%～70%。常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由飲水。本實驗科研項目倫理審查編號：TCMF1-2018002，實驗中對動物處置符合科技部頒行的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》，滿足動物保護、動物福利以及倫理原則的相關(guān)要求，嚴格遵守動物使用的3R原則。

1.1.2 主要試劑與儀器

自主設(shè)計并取得專利的大鼠脛骨牽張外固定裝置(專利號：ZL201520667-424.3)，定制6孔不銹鋼鋼板，1.5 mm螺釘，直徑1 mm醫(yī)用不銹鋼克氏針，4% 多聚甲醛固定液(北京Biosharp公司，批號1704464)，注射用青霉素鈉(華北制藥股份有限公司，160萬單位/瓶，國藥準字H13020655)，DR拍片機(廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院影像科，柯達DR7500，管電壓50 kV，電流4 mA)等。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組

按照隨機數(shù)字表法隨機分為內(nèi)固定鋼板組(internal fixation plate，IFP)、髓內(nèi)針組(intramedullary pin，IMP)和環(huán)形外固定架組(circular external fixator，CEF)3個組，每組20只。

1.2.2 MTBD模型的建立

所有大鼠術(shù)前禁食禁飲12 h, 3%戊巴比妥鈉(1.5 mL/kg)腹腔注射麻醉，右后肢剃毛備皮，麻醉起效、消毒、鋪單后，分別選用六孔不銹鋼鋼板、直徑1 mm克氏針和自制外固定架進行模型構(gòu)建(見圖1)，具體如下：

(1)內(nèi)固定鋼板組(IFP)

沿小腿前外側(cè)依次切開皮膚、淺筋膜，深筋膜，鈍性分離脛骨前肌等肌肉組織，顯露脛骨中上段骨骼；于脛骨干中部外側(cè)置入一枚6 孔、1.5 mm 不銹鋼微型接骨板，于接骨板遠近兩端各擰入2 枚1.5 mm 皮質(zhì)骨螺釘，將接骨板固定于脛骨干外側(cè)。采用微型電動擺鋸于脛骨干中部截骨，截取4 mm 長骨缺損區(qū)；將聚甲基丙烯酸甲酯(polymethyl methacrylate，PMMA)骨水泥塑形后置入骨缺損區(qū)(見圖2 A-C)。

(2)髓內(nèi)針組(IMP)

于右脛骨結(jié)節(jié)以下約2 cm處行1 cm縱行手術(shù)切口，逐層分離淺筋膜，深筋膜，鈍性分離脛骨前肌等肌肉組織，顯露脛骨中上段骨骼；用擺鋸截斷脛骨截取4 mm 長骨缺損區(qū)，將事先準備好的帶有骨水泥的長約2 cm克氏針插入髓腔行髓內(nèi)固定(見圖2D-F)。

(3)環(huán)形外固定架組(CEF)

助手雙手輕柔固定大鼠右側(cè)膝關(guān)節(jié)及踝關(guān)節(jié)，輕輕牽引皮膚，在脛骨弧度頂點行1 cm縱行手術(shù)切口，鈍性分離皮下組織，暴露脛骨；然后首先置第1枚環(huán)形壓片，電鉆裝0.5 mm 克氏針，脛骨上段前內(nèi)側(cè)45°垂直于脛骨軸線進針，穿透雙側(cè)皮質(zhì)，對側(cè)出針；同法用第2 根克氏針與第1根冠狀面成角30°～45°，靠近第1 根進針點穿入；置第2枚環(huán)形壓片，調(diào)整位置，盡量使大鼠小腿中軸與環(huán)形壓片中軸重合；置第3枚環(huán)形壓片，同法在脛骨中段穿入克氏針2 枚后置第4枚壓片，用3根長2.5 cm螺桿將兩端壓片連接，并擰緊螺絲；用擺鋸截取4 mm長骨缺損區(qū)；將PMMA 骨水泥塑形后置入骨缺損區(qū)(見圖2G-I)。

此外，上述3種固定方式在脛骨干中部截4 mm骨缺損區(qū)，置入PMMA骨水泥塑形后，用生理鹽水沖洗術(shù)區(qū)，4-0可吸收縫線依次縫合深筋膜、淺筋膜，1-0 絲線縫合皮膚。術(shù)后連續(xù)3 d肌注青霉素5萬U預(yù)防感染，術(shù)后完全負重活動，單籠飼養(yǎng)至皮膚切口愈合。

1.2.3 觀察指標

(1)造模過程前后一般情況觀察

觀察并記錄3種方式造模用時、術(shù)中出血量、術(shù)后腫脹持續(xù)時間以及骨水泥、固定裝置松動率、感染率和模型成功率等指標。

(2)X線影像學(xué)觀察

于術(shù)后第1天，第2周，第4周行X線檢查，觀察骨水泥、固定裝置是否有斷釘、松動、滑脫、移位等情況以評價固定方式的穩(wěn)定性。

(3)誘導(dǎo)膜組織形態(tài)觀察

于造模術(shù)后第4周，大鼠麻醉后采用頸椎脫臼法將其處死，收集各組誘導(dǎo)膜組織，肉眼直觀下觀察誘導(dǎo)膜顏色、質(zhì)地、厚度等特征，之后立即用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片等操作后行HE染色，光鏡下觀察誘導(dǎo)膜組織形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 造模前后一般情況觀察

IFP組在造模用時及出血量方面明顯大于IMP和CEF兩組(P< 0.05)，且IMP組造模用時最短，而CEF組出血量最少(完全浸濕1.0 cm×1.0 cm的紗塊約是0.1 mL血，見圖3A)；而在術(shù)后肢體腫脹持續(xù)時間方面，CEF組腫脹時間最短，但三組之間差異無顯著性(P> 0.05)(見表1)。此外，與IFP組相比，IMP和CEF兩組的松動率偏低(P< 0.05)，但模型成功率偏高P< 0.05)，而在感染率方面，CEF組無感染發(fā)生，明顯低于IFP和IMP兩組(P< 0.05)，而IFP組出現(xiàn)皮膚壞死感染、鋼板外露情況，IMP組有膿性包塊形成(見表2,圖3B-C)。

2.2 X線影像學(xué)觀察

術(shù)后第1天X線檢查結(jié)果顯示內(nèi)固定鋼板、髓內(nèi)針、外固定架3種固定方式構(gòu)建的MTBD模型質(zhì)量可靠。其中，鋼板、螺釘，克氏針及外固定架固定在位，骨水泥位置良好，未見松動、移位跡象(見圖4 A-C)。但在術(shù)后第2周、第4周，IFP組出現(xiàn)螺釘松動、骨水泥移位等情況(見圖4D)，CEF組出現(xiàn)骨水泥移位表現(xiàn)(見圖4E),而IMP組無異常表現(xiàn)。

注:A.IFP組；B.IMP組；C.CEF組。圖1 各固定方式所需的材料裝置Note. A. IFP group. B. IMP group. C. CEF group.Figure 1 Material devices required for each fixation method

注: A-C. IFP組：顯露脛骨及安裝鋼板，截骨，置放骨水泥；D-F. IMP組：顯露脛骨，截骨并置放骨水泥，縫合皮膚；G-I.CEF組：顯露脛骨并安裝外固定架，截骨，置放骨水泥。圖2 各固定方式簡要步驟造模流程圖Note. A-C. IFP group, tibia exposure, steel plate installation, osteotomy, and placing the PMMA. D-F. IMP group, tibia exposure, osteotomy, and placing the PMMA. G-I. CEF group, tibia exposure, external fixator installation, osteotomy, and placing the PMMA. Figure 2 Brief steps of the modeling flow chart in each fixation method

組別Groups造模用時(min)Modeling time(min)出血量(mL)Blood loss(mL)腫脹時間(d)Duration of edema(d)鋼板組IFP group45.70±3.332.04±0.167.90±0.88髓內(nèi)針組IMP group30.10±2.13* 1.05±1.04* 7.80±0.79外固定架組CEF group32.80±2.30*0.92±0.10* 7.60±0.84

注：與IFP組比較，*P<0.05。

Note. Compared with the IFP group,*P<0.05.

表2 三種固定方式松動率、感染率及成功率比較(%，n=20)Table 2 Comparison of loosening rate, infection rate, and success rate in the three groups (%, n=20)

注：與IFP組比較，*P< 0.05；與IMP組比較，#P< 0.05。

Note. Compared with the IFP group,*P< 0.05． Compared with the IMP group,#P< 0.05．

注: A. 改制小型血墊；B. 鋼板外露；C. 膿性包塊。圖3 造模前后一般情況觀察Note. A. Small modified gauze. B. Plate exposure. C. Purulent mass. Figure 3 General observation during the perioperative period

注: A.內(nèi)固定鋼板固定術(shù)后第1天；B.髓內(nèi)針固定術(shù)后第1天；C.環(huán)形外固定架固定術(shù)后第1天；D.螺釘松動、骨水泥移位；E.骨水泥移位。圖4 造模術(shù)后固定裝置及骨水泥穩(wěn)定情況Note. A. IFP at day 1 postoperatively. B. IMP at day 1 postoperatively. C. CEF at day 1 postoperatively. D. Loose screws and displaced PMMA. E. Displaced PMMA.Figure 4 Fixation devices and PMMA stability after the modeling operation

2.3 誘導(dǎo)膜組織形態(tài)觀察

肉眼直觀下誘導(dǎo)膜組織均顏色紅潤鮮活，質(zhì)地柔軟，膜表面四周存在少許網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)微小血管(見圖5A)；光鏡下HE染色結(jié)果顯示各組誘導(dǎo)膜厚度在460～520 μm，差異無顯著性(P> 0.05),結(jié)構(gòu)也基本一致,呈現(xiàn)明顯的分層結(jié)構(gòu)，其中內(nèi)層主要由滑膜樣上皮細胞構(gòu)成，外層則富含成纖維細胞和膠原纖維，此外誘導(dǎo)膜中含有豐富的血管系統(tǒng)(見圖5B)。

3 討論

MBD是骨科醫(yī)生在臨床中常見的但又極其難以處理的一類病癥，缺損的部位、周圍軟組織情況以及患者的全身狀況等都會影響骨缺損的愈合。正是由于其發(fā)病機理及影響因素多樣性，導(dǎo)致MBD的治療也十分復(fù)雜[17]。而Masquelet誘導(dǎo)膜技術(shù)是治療MBD的一種有效方法，自1986年由法國醫(yī)生Masquelet[18]報道以來，就得到了廣泛的關(guān)注和應(yīng)用，國內(nèi)外諸多學(xué)者對其進行不斷深入的研究，在臨床中也取得不錯的治療效果。據(jù)報道[19]，Masquelet 技術(shù)成功治愈了缺損長度為25 cm的患者，而且重建后平均 8.5個月就可以正常行走并完全負重。更為重要的是，Masquelet 技術(shù)不僅可以避免在可能存在感染的情況下行帶血管蒂骨移植術(shù)產(chǎn)生的潛在風(fēng)險，而且在整個治療過程中可以有效地控制感染[19-20]。在2010 年，Masquelet等[21]再次報道了運用該技術(shù)治療手腕部骨缺損，擴大了該技術(shù)的應(yīng)用范圍，隨后該技術(shù)廣泛用于無菌性骨不連、感染性及腫瘤切除后骨缺損的治療，并取得良好臨床療效[22-28]。然而，當(dāng)前對于MBD以及Masquelet技術(shù)促進骨缺損修復(fù)的認識尚不夠全面，甚至無論在臨床上還是動物實驗中對于MBD始終沒有統(tǒng)一、準確的定義[29]，這也說明當(dāng)前對于MBD的研究還有諸多不足或是亟待闡明的內(nèi)容，而Masquelet技術(shù)等諸多治療方式以及相應(yīng)的作用機制都還需更深入、更全面的研究。

在本實驗中，我們選擇了國內(nèi)常用的實驗動物SD大鼠，選擇臨床中骨缺損最多見的脛骨部位構(gòu)建模型[14-16]，并比較鋼板、髓內(nèi)針、外固定架三種最常見的固定方式的特點。本研究發(fā)現(xiàn)，與IMP和CEF兩組相比，采用IFP固定方式術(shù)中所需時間較長，出血量較大，考慮到在安裝鋼板之前需要廣泛分離周圍軟組織，還需植入4枚螺釘，這在一定程度上增加了操作難度，一方面考驗著術(shù)者所具備的外科手術(shù)基礎(chǔ)，稍有不慎就可能傷及周圍的血管、神經(jīng)，另一方面無疑增加了操作時間和出血概率。此外，結(jié)果表明手術(shù)時間與術(shù)中出血量之間存在正相關(guān)關(guān)系這也符合臨床中的一般規(guī)律[30]。而相比之下，IMP和CEF兩種固定方式對周圍軟組織損傷較小，在造模用時及出血量方面優(yōu)于IFP。由于三種方式截骨部分相同，截骨方式相同，且截取長度均為4 mm，術(shù)后給予的護理措施也大體一致，這或許是三者之間腫脹持續(xù)時間無明顯差異的原因，但考慮到CEF除了上述相同操作之外，主要步驟均在肢體外操作，對肢體損傷程度最小，故而腫脹持續(xù)時間最短。在感染方面，脛骨部皮下軟組織組織較少，置放鋼板使局部組織間間隙縮窄，壓力增大，在皮膚縫合后局部張力也會明顯增大，則縫合后皮膚壞死幾率較大，一旦出現(xiàn)壞死就會導(dǎo)致局部皮膚缺損，繼而出現(xiàn)鋼板外露，而IMP出現(xiàn)的膿包是在深肌層之下、骨干附近，可能是由于在置放髓內(nèi)針時出現(xiàn)骨髓內(nèi)感染所致。與此同時，感染問題會引起持續(xù)疼痛[31],也會一定程度上延長腫脹時間，這或許是解釋IFP組腫脹時間最長的原因之一。此外，感染會導(dǎo)致固定裝置松動以致固定失敗[32]，這與本研究結(jié)果相一致，在IFP組其感染率最高，對應(yīng)松動率也最高，出現(xiàn)了多次螺釘松動、滑脫、骨水泥移位現(xiàn)象，繼而模型成功率最低。而CEF組出現(xiàn)的1例骨水泥松動現(xiàn)象或許可以用無菌性松動的知識加以解釋，由于骨-針界面力學(xué)及生物學(xué)條件相對較差,長期的應(yīng)力刺激反而導(dǎo)致骨質(zhì)磨損和骨吸收現(xiàn)象，繼而出現(xiàn)克氏針松動，固定不良的情況[33],但有別于IFP出現(xiàn)的感染性松動。雖然IMP暫未發(fā)現(xiàn)有松動跡象，但早有文獻報道在骨修復(fù)動物模型中與外固定架相比，克氏針髓內(nèi)固定方式固定強度不夠，易發(fā)生旋轉(zhuǎn)，支撐作用有限[34]，而當(dāng)取掉骨水泥植入顆粒狀松質(zhì)骨時，由于缺少骨水泥的“占位”支撐，對于IMP而言植入骨只能松散的包裹在細小克氏針周圍，在顆粒狀松質(zhì)骨尚未完全皮質(zhì)化之前植骨區(qū)缺乏牢靠的支撐和固定，不利于植骨重建。在誘導(dǎo)膜結(jié)構(gòu)形態(tài)方面，本研究發(fā)現(xiàn)三組收集的膜組織無論是肉眼直觀下的大體形態(tài)還是光鏡下HE染色結(jié)果均顯示無明顯差別，而且與之前研究報道的誘導(dǎo)膜形態(tài)結(jié)構(gòu)相一致[35]，這說明3種固定方式均可成功復(fù)制Masquelet技術(shù)產(chǎn)生誘導(dǎo)膜組織，且在組織形態(tài)方面無明顯差異。

綜上，IFP、IMP和CEF三種固定方式均可成功構(gòu)建MTBD誘導(dǎo)膜模型，而CEF為模擬Masquelet技術(shù)構(gòu)建大鼠MTBD模型較優(yōu)的方式。