石榴皮提取物對豬肉餅冷藏過程中脂肪氧化穩(wěn)定性的影響

曹云剛，李 穎，李春強(qiáng)，趙倩倩，朱振寶,*，李保玲，秦雪翠

（1.陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，陜西 西安 710021；2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽 110866；3.陜西嘉禾生物科技股份有限公司，陜西 西安 710077）

如今，肉干、肉餅等肉制品在世界范圍內(nèi)深受消費(fèi)者歡迎[1]，肉制品加工和貯藏過程中的品質(zhì)變化日益受到關(guān)注。已有許多研究表明，氧化會造成肉制品加工和貯藏過程中的品質(zhì)變化[2-4]，其中脂肪氧化是導(dǎo)致肉制品品質(zhì)下降的重要原因[5-7]。目前主要通過使用人工合成抗氧化劑來提高肉制品在加工和貯藏過程中的穩(wěn)定性，但越來越多的研究表明，合成抗氧化劑的過度攝入對人體健康存在潛在危害。天然植物提取物富含酚類物質(zhì)，具有抗氧化[8]、抗癌[9]和抗衰老等[8-11]多種生物活性。因此，天然植物源抗氧化劑在肉制品中的應(yīng)用成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)[12-13]。

石榴皮中富含多酚類物質(zhì)，其化學(xué)成分主要有生物堿類、黃酮類、有機(jī)酸和鞣質(zhì)類等[14-15]，具有高效的抗氧化能力，是優(yōu)良的天然抗氧化劑[16]。然而，目前石榴皮作為榨取石榴汁的副產(chǎn)物大都被丟棄，造成了優(yōu)質(zhì)資源的浪費(fèi)。陜西省作為我國石榴生產(chǎn)大省，石榴皮資源豐富、開發(fā)利用率低，限制了相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。并且目前關(guān)于石榴皮提取物在肉制品中的應(yīng)用研究報(bào)道非常有限。

基于此，本研究選擇陜西省優(yōu)勢天然資源產(chǎn)物石榴皮提取物，首先測定石榴皮提取物中的總酚和總黃酮含量，采用5 種方法對其抗氧化活性進(jìn)行評價(jià)，進(jìn)一步探究添加不同質(zhì)量濃度石榴皮提取物對于豬肉餅冷藏過程中脂肪氧化的影響，旨在為天然抗氧化劑在肉制品中的科學(xué)合理應(yīng)用提供依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬后腿肉 陜西省西安市未央?yún)^(qū)潤家超市；石榴皮提取物（CSLP-A-708089） 陜西嘉禾生物科技有限公司；菲啰嗪 上海瑞永生物科技有限公司；正丁醇、2,2'-聯(lián)氮雙-（3-乙基苯并噻唑林-6-磺酸）二胺鹽（2,2'-azinobis-（3-ethylbenzothi azoline-6-sulfonic acid）ammonium salt，ABTS）、2,4,6-三吡啶基三嗪（2,4,6-tripyridin-2-yl-1,3,5-triazine，TPTZ）、乙二胺四乙酸、抗壞血酸 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；所用試劑均為分析純或生物試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

SE-A6全自動(dòng)脂肪測定儀 濟(jì)南市阿爾瓦儀器有限公司；HE 53水分測定儀 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；RADWAG WTC 2000電子天平 上?？推潓?shí)驗(yàn)儀器設(shè)備有限公司；CP213電子天平 奧豪斯儀器（常州）有限公司；TP-350S智能數(shù)顯磁力加熱攪拌器 杭州米歐儀器有限公司；DK-98-Ⅱ電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司；HR/T20MM立式高速冷凍離心機(jī) 湖南赫西儀器裝備有限公司；UV2900紫外-可見分光光度計(jì) 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；GENIUS 4K臺式低速離心機(jī) 長沙市鑫奧儀器儀表有限公司；RS-JR80A絞肉機(jī) 合肥榮事達(dá)三洋電器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 總酚和總黃酮含量測定

參照高玉萍等[17]的方法，采用福林酚標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定石榴皮提取物中的總酚含量。將石榴皮提取物稀釋為一系列不同質(zhì)量濃度（0、50、100、200、300、400、500、1 000 μg/mL）的樣品溶液，準(zhǔn)確移取1 mL稀釋樣品，置于50 mL容量瓶中，加入10 mL蒸餾水，再先后加入5 mL福林酚試劑、4 mL 7.5% Na2CO3溶液，定容；避光反應(yīng)1 h后于765 nm波長處測定吸光度。以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品的總酚含量以沒食子酸當(dāng)量（mg/g）表示。

參照柴建新等[18]的方法，并稍作修改，測定石榴皮提取物中的總黃酮含量。準(zhǔn)確移取1 mL稀釋樣品，置于50 mL容量瓶中，加入14 mL無水乙醇，再加入硝酸鋁溶液、醋酸鉀溶液各1 mL，定容；靜置1 h后于420 nm波長處測定吸光度。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品中的總黃酮含量以蘆丁當(dāng)量（mg/g）表示。

1.3.2 總抗氧化能力測定

參照劉蕓等[19]的方法，采用亞鐵離子還原能力（ferric ion reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）法進(jìn)行總抗氧化能力測定。取1 mL樣品溶液置于10 mL玻璃試管中，加入0.3 mL去離子水和3.0 mL FRAP工作液混勻，37 ℃條件下水浴4 min后于593 nm波長處測定吸光度。相同實(shí)驗(yàn)條件下，以不同濃度FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L）替代樣品溶液，以FeSO4濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品的FeSO4還原能力用對應(yīng)的Fe2+濃度表示。

1.3.3 自由基清除能力測定

參照J(rèn)iang等[20]的方法，并稍作修改，測定ABTS+·清除能力。準(zhǔn)確移取30 μL樣品溶液置于10 mL玻璃試管中，加入2.97 mL ABTS+·工作液，混勻后室溫下反應(yīng)10 min，于734 nm波長處測定吸光度。

參照劉翠[21]的方法，測定石榴皮提取物的·OH和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-d i p h e n y l-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力。

1.3.4 Fe2+螯合能力測定

參照曹云剛[22]的方法，測定石榴皮提取物的Fe2+螯合能力。

1.3.5 豬肉預(yù)處理及基本指標(biāo)測定

豬肉基本指標(biāo)測定：將新鮮豬后腿肉用裝配有不同直徑孔板的絞肉機(jī)絞碎，將絞碎的肉糜充分混勻，稱取3 g左右肉糜，使用HE 53水分測定儀測得其水分含量為（75.22±0.03）%，使用SE-A6全自動(dòng)脂肪測定儀測得其脂肪含量為（6.37±0.26）%。

豬肉餅的制作：按照表1配方，以小培養(yǎng)皿為模具制作成質(zhì)量約40 g的肉餅，用電餅鐺進(jìn)行煎烤（每面煎烤1 次，每次2 min），放置于塑料托盤中用保鮮膜密封，置于4 ℃冷藏。于冷藏第1、3、5、7天測定豬肉餅的過氧化值（peroxide value，POV）及硫代巴比妥酸反應(yīng)物（thiobarbituric acid reactive substance，TBARs）值，評價(jià)其脂肪氧化程度。

表 1 豬肉餅配方Table 1 Formulation of pork patties

1.3.6 豬肉餅脂肪氧化情況測定

POV的測定：稱取2～3 g肉糜樣品（記錄準(zhǔn)確質(zhì)量），加入30 mL氯仿-冰乙酸混合液和1 mL飽和碘化鉀溶液，混勻后置于暗處反應(yīng)5 min；加入50 mL去離子水和1 mL淀粉指示劑，用0.01 mol/L Na2S2O3標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液滴定至淺黃色。

TBARs值的測定：稱取1.0～1.5 g肉糜樣品（記錄準(zhǔn)確質(zhì)量），依次加入1.5 mL硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）溶液及8.5 mL三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）溶液，100 ℃條件下水浴30 min；冰水浴冷卻至室溫后，取5 mL上清液，加入5 mL氯仿離心（3 000 r/min、5 min）后，取3 mL上清液加入1.5 mL石油醚再次離心（3 000 r/min、5 min），吸取下層液體于532 nm波長處測定吸光度。結(jié)果以丙二醛（malondialdehyde，MDA）當(dāng)量（mg/kg）表示。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，測定結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示；采用Statistix 9.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析（P＜0.05）；采用Sigmaplot 12.5軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 石榴皮提取物的總酚和總黃酮含量

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，石榴皮提取物中的總酚含量為（8 9.4 8±6.5 9） m g/g，總黃酮含量為（57.60±4.91） mg/g。夏米斯巴奴·艾則孜等[23]研究發(fā)現(xiàn)，石榴皮中總多酚含量為67.50 mg/g；楊肖等[24]研究發(fā)現(xiàn)，石榴皮粉末中總黃酮含量為112.13 mg/g。不同研究報(bào)道中石榴皮及其提取物的總酚和總黃酮含量相差較大，這與實(shí)驗(yàn)所用石榴皮的種類等不同有關(guān)。

2.2 石榴皮提取物的總抗氧化能力

圖1 不同質(zhì)量濃度石榴皮提取物的總抗氧化能力Fig. 1 Total antioxidant capacity of pomegranate peel extract at various concentrations

由圖1可知，隨著石榴皮提取物質(zhì)量濃度的升高，其總抗氧化能力呈現(xiàn)不斷上升的趨勢。當(dāng)石榴皮提取物質(zhì)量濃度在50～400 μg/mL范圍內(nèi)時(shí)，其總抗氧化能力增幅相對較緩，石榴皮提取物的質(zhì)量濃度為50 μg/mL時(shí)，其總抗氧化能力約為0.01 mmol/L，石榴皮提取物質(zhì)量濃度增大至400 μg/mL時(shí)，其總抗氧化能力增強(qiáng)至0.11 mmol/L，約為起始質(zhì)量濃度（50 μg/mL）的10 倍。而當(dāng)石榴皮提取物質(zhì)量濃度在400～1 000 μg/mL范圍內(nèi)時(shí)，其抗氧化能力迅速增強(qiáng)，石榴皮提取物質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL時(shí)，其總抗氧化能力約為0.52 mmol/L，約為質(zhì)量濃度為400 μg/mL時(shí)的5 倍。許海燕[25]研究發(fā)現(xiàn)，石榴皮粗提物質(zhì)量濃度越高，其抗氧化能力越強(qiáng)，當(dāng)石榴皮粗提物質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL時(shí)，其抗氧化能力約為VC的1/2，而石榴皮粗提物質(zhì)量濃度達(dá)0.3 mg/mL時(shí)，其總抗氧化能力達(dá)到VC的1.25 倍左右，與本研究結(jié)果類似。

2.3 石榴皮提取物的自由基清除能力

圖2 不同質(zhì)量濃度石榴皮提取物的自由基清除能力Fig. 2 Radical scavenging activity of pomegranate peel extract at various concentrations

由圖2可知，當(dāng)石榴皮提取物質(zhì)量濃度為50 μg/mL時(shí)，其·OH清除率達(dá)77.23%，此后，隨著石榴皮提取物質(zhì)量濃度的增加，其·OH清除率緩慢增強(qiáng)，當(dāng)石榴皮提取物質(zhì)量濃度為200 μg/mL時(shí)，其·OH清除率幾乎接近峰值，約為92.22%。整體來看，石榴皮提取物的ABTS+·和DPPH自由基清除能力隨其質(zhì)量濃度增加的變化趨勢基本一致：隨質(zhì)量濃度增加而迅速增強(qiáng)，當(dāng)石榴皮提取物質(zhì)量濃度為50 μg/mL時(shí)，其ABTS+·和DPPH自由基清除率分別約為10.84%和4.69%；當(dāng)石榴皮提取物質(zhì)量濃度達(dá)1 000 μg/mL時(shí)，其ABTS+·和DPPH自由基清除率分別達(dá)99.61%和87.37%，約為初始質(zhì)量濃度（50 μg/mL）的10 倍和20 倍。

初始質(zhì)量濃度（50 μg/mL）時(shí)，石榴皮提取物的自由基清除能力為：·OH（77.23%）＞ABTS+·（10.84%）＞DPPH自由基（4.69%）；當(dāng)質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL時(shí)，其3 種自由基清除率均達(dá)到最大值：ABTS+·（99.61%）＞·OH（94.97%）＞DPPH自由基（87.37%）。唐麗麗[26]的研究表明，石榴皮提取物質(zhì)量濃度在0～500 μg/mL范圍內(nèi)時(shí)，其ABTS+·和DPPH自由基清除能力與質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，當(dāng)質(zhì)量濃度分別達(dá)到500、800 μg/mL時(shí)，其ABTS+·和DPPH自由基清除能力均達(dá)到峰值（90%以上）。不同研究中石榴皮提取物對ABTS+·、·OH和DPPH自由基的清除能力有一定差異，這可能與石榴種類和石榴皮提取物的提取方法不同有關(guān)。

2.4 石榴皮提取物的Fe2+螯合能力

圖3 不同質(zhì)量濃度石榴皮提取物的Fe2＋螯合能力Fig. 3 Fe2+ chelating activity of pomegranate peel extract at various concentrations

由圖3可知，石榴皮提取物對Fe2+的螯合能力具有明顯的質(zhì)量濃度依賴性，其Fe2+螯合能力隨質(zhì)量濃度增大而顯著增強(qiáng)。當(dāng)石榴皮提取物質(zhì)量濃度為50 μg/mL時(shí)，其Fe2+螯合能力約為9.77%；當(dāng)石榴皮提取物質(zhì)量濃度達(dá)到1 000 μg/mL時(shí)，其Fe2+螯合能力達(dá)到34.75%，約為初始質(zhì)量濃度（50 μg/mL）時(shí)的3.6 倍。陳龍[27]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)石榴皮提取物質(zhì)量濃度為0.02～1.25 mg/mL時(shí)，其Fe2+螯合能力與質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，質(zhì)量濃度為1.25 mg/mL時(shí)，其Fe2+螯合能力約為35.65%，與本研究結(jié)果類似。

2.5 石榴皮提取物的添加對豬肉餅冷藏過程中脂肪氧化穩(wěn)定性的影響

脂肪氧化是導(dǎo)致肉制品品質(zhì)劣變的重要原因。脂肪氧化的初級產(chǎn)物是過氧化物，過氧化物本身不穩(wěn)定，容易進(jìn)一步分解生成小分子的醛、酮、酸等次級氧化產(chǎn)物[28-29]。本研究通過測定POV和TBARs值分析豬肉餅貯藏過程中的脂肪初級和次級氧化程度[30]。

圖4 豬肉餅冷藏過程中的POV變化Fig. 4 Changes in POV of cooked pork patties during cold storage

由圖4可知，空白對照組豬肉餅的POV在冷藏過程中隨著時(shí)間延長而增大，表明在整個(gè)貯藏期內(nèi)豬肉餅中的脂肪氧化持續(xù)進(jìn)行。貯藏第1天時(shí)，空白對照組豬肉餅的POV約為4.39 meq/kg，BHA組和A1組的POV約為2.53、2.36 meq/kg，A2組和A3組約為1.59、1.50 meq/kg，可見，抗氧化劑的添加明顯降低了豬肉餅的POV，說明抗氧化劑添加明顯抑制了脂肪氧化。整體來看，BHA組和A1組豬肉餅的POV在整個(gè)貯藏期內(nèi)數(shù)值接近且變化趨勢一致，說明添加較低含量的石榴皮提取物（0.01%）與添加0.01%的BHA對豬肉餅中脂肪初級氧化的抑制效果相當(dāng)。隨著石榴皮提取物添加量的增大，其抑制效果顯著增強(qiáng)（P＜0.05），但A2和A3組之間并未表現(xiàn)出顯著性差異，說明當(dāng)石榴皮提取物的添加量為0.05%時(shí)，其對脂肪初級氧化的抑制效果已達(dá)到最佳。Turgut等[31]研究發(fā)現(xiàn)，石榴皮提取物能顯著抑制牛肉丸冷凍貯藏過程中的脂肪氧化（POV和TBARs值），且達(dá)到一定質(zhì)量濃度（500 μg/mL）時(shí)其抑制效果最強(qiáng)，與本研究結(jié)果類似。

圖5 豬肉餅冷藏過程中的TBARs值變化Fig. 5 Changes in TBARs value of cooked pork patties during cold storage

由圖5可知，空白對照組豬肉餅的TBARs值在冷藏過程中隨著時(shí)間的延長一直增大，且貯藏1～5 d時(shí)增長較快，此后增長速率放緩。貯藏第1天時(shí)，空白對照組豬肉餅的TBARs值約為2.57 mg/kg，BHA組和A1組均小于1.50 mg/kg，A2組和A3組均小于0.50 mg/kg，說明抗氧化劑的添加明顯抑制了豬肉餅的脂肪氧化。對于BHA組和A1組來說，貯藏1～5 d時(shí)，其TBARs值隨貯藏時(shí)間的延長而緩慢上升，第5天時(shí)TBARs值達(dá)到峰值（分別約為3.18、2.66 mg/kg），此后TBARs值隨貯藏時(shí)間的延長略有下降。這可能是由于MDA與肉餅中的蛋白質(zhì)發(fā)生共價(jià)結(jié)合，導(dǎo)致其含量降低。高含量石榴皮提取物（0.05%和0.10%）的添加幾乎完全抑制了豬肉餅TBARs值的增長，在整個(gè)貯藏期內(nèi)，2 組豬肉餅的TBARs值均低于0.55 mg/kg。與POV實(shí)驗(yàn)結(jié)果類似，A2和A3組之間的TBARs值無顯著性差異，再次說明當(dāng)石榴皮提取物的添加量為0.05%時(shí)，已足以抑制豬肉餅中的脂肪氧化。Turgut[31]、Cao[32]等在其他體系中也得到了類似的研究結(jié)果，植物多酚優(yōu)良的脂肪氧化抑制能力主要?dú)w因于其高效的自由基清除能力及一定的金屬離子螯合能力。

3 結(jié) 論

本研究所用石榴皮提取物中的總酚和總黃酮含量分別為（89.48±6.59） mg/g和（57.60±4.91） mg/g。總體來講，石榴皮提取物的總抗氧化能力表現(xiàn)出明顯的質(zhì)量濃度依賴性，在50～1 000 μg/mL范圍內(nèi)增速迅猛，總抗氧化能力由0.01 mmol/L增強(qiáng)至0.52 mmol/L，增強(qiáng)50多倍。石榴皮提取物為初始質(zhì)量濃度（50 μg/mL）時(shí)，其對3 種自由基的清除率為·OH（77.23%）＞ABTS+·（10.84%）＞DPPH自由基（4.69%）；質(zhì)量濃度增大至200 μg/mL時(shí)，其對·OH的清除率幾乎接近峰值，約為92.22%；質(zhì)量濃度增大至1 000 μg/mL時(shí)，其對ABTS+·和DPPH自由基的清除率分別增大至99.61%和87.37%。石榴皮提取物的Fe2+螯合能力隨質(zhì)量濃度增大而增強(qiáng)：質(zhì)量濃度為50 μg/mL時(shí)，其Fe2+螯合能力約為9.77%；當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到1 000 μg/mL時(shí)，其Fe2+螯合能力達(dá)到初始質(zhì)量濃度（50 μg/mL）時(shí)的3.6 倍。

石榴皮提取物可以有效抑制豬肉餅冷藏過程中的脂肪氧化（POV和TBARs值）：石榴皮提取物添加量為0.01%時(shí)，其脂肪氧化抑制效果與0.01%（以脂肪含量為基準(zhǔn)）BHA相近；隨著石榴皮提取物添加量的增加，其脂肪氧化抑制效果顯著增強(qiáng)，但添加量為0.05%和0.10%時(shí)的抑制效果無顯著性差異。