Notch信號通路在針刺治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中作用機制研究*

王 靜，秦 悅，劉 群，唐雨佳，武煜明，蔡恩麗，褚 鑫

(云南中醫(yī)藥大學,云南 昆明 650500)

中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central nervous system,CNS)由腦和脊髓組成，血液循環(huán)障礙、代謝紊亂、感染及中毒等均可導致CNS疾病發(fā)生，且多伴有各種并發(fā)癥。如腦卒中(cerebral stroke)作為常見性難治疾病，治療極為棘手。CNS受損時，機體自身部分神經(jīng)干細胞(NSCs)可被激活、遷移，發(fā)揮修復和代償作用。同時相關(guān)信號通路被激活，Notch信號通路作為調(diào)節(jié)NSCs增殖分化的重要信號通路，因此針刺干預(yù)此通路治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病成為目前研究熱點。

1 Notch信號通路

1.1 Notch信號通路概述

Notch信號通路是一條在調(diào)節(jié)干細胞增殖分化和細胞凋亡等領(lǐng)域起重要作用的高度保守的細胞通路。Notch基因編碼一種膜蛋白受體，由Notch受體、Notch配體即DSL(Delta,Serrate,Lag-2)蛋白和細胞內(nèi)效應(yīng)器分子(CSL-DNA結(jié)合蛋白)3部分組成，在不同物種中具有高度同源性。

1.2 Notch信號通路的機制

在哺乳動物中, Notch受體可以分為4個類型, 即 Notch1-4，是一種膜蛋白，它由胞內(nèi)段、跨膜段和胞外段3部分組成[1-2]。Notch信號的產(chǎn)生是通過相鄰細胞的Notch配體與受體相互作用，由胞內(nèi)段(intracelluar domain of Notch,NICD)將細胞信號傳至細胞核,與轉(zhuǎn)錄因子CSL家族(CBFI/Suppressor of Hairless/LAG-1 famliy)結(jié)合,形成 NICD/RBP-JK/MAML轉(zhuǎn)錄激活復合體，從而發(fā)揮調(diào)節(jié)靶基因抑制物的作用。Notch信號通路的靶基因堿性-螺旋-環(huán)-螺旋(basic helix-loop- helix,bHLH)對NSCs 未分化狀態(tài)的維持起著非常重要的作用,這種信號轉(zhuǎn)導途徑有CSL家族蛋白的參與被叫做CSL依賴途徑[3]。這種經(jīng)典的Notch信號通路, 在哺乳動物體內(nèi), 也叫做CBF-1/RBP-Jκ依賴途徑, 哺乳動物的下游靶基因為Hes(Hairy and enhancer of split)，包括Hes1-7，但是hes家族成員在某單一動物體中不一定全部存在[4]。其作為通路下游靶基因?qū)ι窠?jīng)前體細胞的增殖分化進行調(diào)控，不同的Hes作用不同。如Hes1轉(zhuǎn)錄表達能夠促進神經(jīng)前體細胞進行自我更替與增殖;Hes3作為Notch通路的重要效應(yīng)基因，主要作用為促進神經(jīng)元的增殖，并且?guī)椭捶只纳窠?jīng)元維持其形態(tài)[5]。對神經(jīng)干細胞的維持和抑制分化起著決定性作用的是Notch信號，但哺乳動物腦內(nèi)多潛能干細胞分化功能需要Notch和Hes基因共同維持[6]。

2 Notch信號通路在針刺治療腦卒中的作用機制

2.1 針刺調(diào)節(jié)Notch信號通路促進缺血性腦卒中血管新生

血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)作為一種具有高度特異性的促血管內(nèi)皮細胞生長因子，有促進血管內(nèi)皮細胞的遷移、增殖和血管形成等作用。內(nèi)皮抑素(endostatin,ES)是一種血管抑制劑，主要作用為特異性抑制血管內(nèi)皮細胞生成。針刺刺激Notch通路能有效調(diào)控與VEGF相關(guān)的因素，以增強或減弱地表達于血管，從而治療缺血性腦卒中。血管生成的關(guān)鍵調(diào)控因子VEGF受體的表達增多，可有效調(diào)控血管密度升高以改善腦缺血情況，GRIDLEY[7]在其研究中發(fā)現(xiàn)Notch通路的激活能夠促使VEGF受體表達增加，而VEGF受體是調(diào)控血管密度的重要因子，Notch信號的改變可以使血管密度降低或者增加。這一結(jié)果與楊敏等[8]研究相同，頭針可能通過激活Notch通路，增加腦缺血區(qū)VEFG的含量與減少ES含量以促進腦缺血損傷后血管的新生，改善缺血區(qū)的血液供應(yīng)和恢復神經(jīng)功能。王拯等[9]研究發(fā)現(xiàn),Notch信號通路與血管內(nèi)皮生長因子及其他信號通路可相互協(xié)調(diào)于血管新生這個過程，但其他信號通路在影響血管再生方面與Notch通路關(guān)聯(lián)性強弱不等，這也為研究其他通路是否參與調(diào)控腦缺血損傷的修復提供新角度。

2.2 針刺調(diào)節(jié)Notch信號通路促進缺血性腦卒中NSCs增殖

Notch信號通路參與NSCs的更新，一方面是因為活化的Notch信號通路調(diào)節(jié)Hes家族表達并抑制bHLH轉(zhuǎn)錄因子的表達,直接參與NSCs的自我更新；另一方面, Notch信號通路本身參與調(diào)控細胞周期的長短從而間接影響NSCs的自我更新[1]。配體、受體的增加往往促使下一階段的生化反應(yīng)更活躍，Zhao等[10]電針百會穴預(yù)處理腦缺血(MCAO)大鼠后發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注后大鼠紋狀體中Notch1、Notch4受體和Jag1配體的表達顯著增加。電針預(yù)處理大鼠紋狀體中Hes1基因在缺血再灌注早期表達明顯增高，Hes5基因在缺血再灌注后中期表達明顯升高。NICD蛋白含量在再灌注后24 h達到高峰，且較對照組提前，這提示通過Notch信號通路調(diào)控機體可能提前開始腦缺血損傷的修復。Tao等[11]實驗觀察到活化的 Notch1信號轉(zhuǎn)導通路，可增加海馬區(qū)巢蛋白(Nestin)陽性細胞表達，并且能促進腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)和膠質(zhì)源神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)等的分泌，從而發(fā)揮對腦缺血的治療作用。在陶靜等[12]的實驗研究中同樣發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過電針處理后，缺血周圍區(qū)皮質(zhì)和缺血側(cè)室管膜下區(qū)( subventricular zone，SVZ)Notch1信號轉(zhuǎn)導通路有活化趨勢，使活化的NICD蛋白數(shù)量增加，并且能夠讓Hes1和Hes5的表達激活，從而加快缺血損傷后NSCs的增殖。采用γ分泌酶抑制劑(DAPT)阻斷Notch信號轉(zhuǎn)導通路時，電針促進神經(jīng)干細胞增殖現(xiàn)象被抑制，減少神經(jīng)細胞的分化。表明電針可拮抗DAPT，調(diào)控神經(jīng)細胞增殖分化，從而改善腦缺血后的功能障礙[13-14]。

神經(jīng)上皮干細胞蛋白(neuroepithelial stemcell protein,Nestin)即巢蛋白，Nestin的表達在神經(jīng)干細胞中起于胚胎時期，隨著神經(jīng)干細胞的不斷遷徙，其表達逐漸減低，當神經(jīng)細胞分化成熟后停止表達。Nestin現(xiàn)廣泛用于鑒定神經(jīng)干細胞，可通過Nestin反映大鼠海馬神經(jīng)干細胞的增殖情況[15]。波形蛋白(Vimentin)屬于中間絲蛋白的一種，能被神經(jīng)祖細胞(progenitor)/前體細胞(precusor)和神經(jīng)干細胞(neural stem cell, NSC)表達，它具有自我分化和更新的能力，因此為神經(jīng)系統(tǒng)非再生性疾病的治療提供了新方法[16]。Ki-67是一種核蛋白質(zhì)，可提示細胞的增殖活躍程度，其陽性表達呈棕色或褐棕色，定位于細胞核內(nèi)作為細胞增殖指標。電針處理曲池、足三里后[15]，腦缺血再灌注損傷大鼠腦梗死體積明顯減少，大鼠腦缺血區(qū)周圍皮質(zhì)及缺血側(cè)室管膜下區(qū)(subventricular zone,SVZ)的Ki-67、Nestin和Vimentin陽性細胞數(shù)均有顯著增加，表明神經(jīng)干細胞有增殖情況。7天后缺血周圍皮質(zhì)區(qū)及缺血側(cè)SVZ區(qū)中JAG1、NICD、Hes1、Hes5蛋白表達明顯增加。其機制可能為針刺活化Notch通路，釋放NICD上調(diào)Hes1、Hes5的表達，從而促進缺血區(qū)周圍皮質(zhì)及缺血側(cè)SVZ區(qū)NSCs的增殖。另一電針干預(yù)實驗中[15]，腦缺血大鼠的神經(jīng)功能障礙得到明顯改善，并且使Notch信號通路激活，其中的NICD和Notch1受體的表達增強，加強海馬神經(jīng)干細胞的增殖，從而起到治療腦缺血的作用。醒神開竅針刺法治療缺血性中風[17]，也證實針刺能通過調(diào)節(jié)Notch信號通路，對NSCs增殖和分化起到一定促進作用，從而促進中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的修復。Notch 信號通路對于NSCs的增殖分化和內(nèi)源性NSCs的維持都是不可或缺的，因此Notch 信號通路對機體神經(jīng)再生的調(diào)節(jié)具有重要意義。并由此推測成體哺乳動物腦梗死后如果在某種刺激下能夠產(chǎn)生足夠量的內(nèi)源性NSCs，并分化為神經(jīng)元、膠質(zhì)細胞，將能夠有效治療神經(jīng)功能缺損和改善肢體運動功能。由于參與神經(jīng)干細胞自我更新的因素繁多，和Notch信號通路之間的關(guān)聯(lián)性并不明確，王玨等在其綜述中指出的，關(guān)于Notch通路作用特定時間點的研究可能在未來對于NSCs增殖分化的干預(yù)產(chǎn)生更深遠的影響[1]。

3 Notch信號通路在針刺治療非腦卒中相關(guān)疾病中的研究

3.1 針刺調(diào)節(jié)Notch信號通路增強神經(jīng)可塑性

相關(guān)研究表明[18]神經(jīng)可塑性特別是海馬齒狀回的神經(jīng)可塑性可能是抑郁癥治療的入手點[19]。神經(jīng)細胞突起的擴展和生長也受Notch信號通路的影響，在神經(jīng)元培養(yǎng)中，Notch信號刺激軸突分支抑制軸突生長，在不同階段Notch1、其配體Jagged1及其下游靶基因Hes-1對神經(jīng)元軸突的影響顯示不同的活性。微管結(jié)合蛋白(MAP-2)作為神經(jīng)元樹突標志物，可參與突觸可塑性和神經(jīng)突起生長過程。鄧雪等基于此實驗發(fā)現(xiàn),電針組海馬組織中MAP-2蛋白及Notch蛋白的表達量大于模型組，Jagged1和Hes1蛋白表達量小于模型組?？芍浴澳I腦相濟”理論為指導的電針療法治療圍絕經(jīng)期抑郁癥可能是通過調(diào)節(jié)Notch信號通路以影響海馬神經(jīng)細胞可塑性而發(fā)揮作用的。電針百會、印堂等穴位治療抑郁癥可達到與藥物治療相同的效果，甚至在某些方面針刺治療效果優(yōu)于藥物治療。艾灸處理血管性癡呆(Vascular dementia,VD)大鼠[20]，可明顯見到Notch1、Hes3 mRNA的表達增強，Notch1受體被刺激并表達，激活Notch信號轉(zhuǎn)導通路，下游靶基因Hes3被激活，抑制神經(jīng)元分化，從而顯著改善大腦缺血缺氧的狀態(tài)，雖然不能完全抑制腦損傷和緩解腦缺血狀態(tài)，但能減少腦損傷的發(fā)生。

3.2 針刺調(diào)節(jié)Notch信號通路抑制神經(jīng)膠質(zhì)細胞不可逆分化

影響脊髓內(nèi)神經(jīng)干細胞的生成和分化的因素有很多，其中一個重要原因是大量促神經(jīng)膠質(zhì)分化的信號在脊髓損傷(SCI)后十分活躍，Notch信號的表達也顯著增強[21]。許多臨床實踐證,實電針可促進脊髓損傷后的神經(jīng)功能恢復，Notch信號作為一種促神經(jīng)膠質(zhì)分化信號在脊髓損傷后被激活，表達增強，可加速并促進NSC向膠質(zhì)細胞不可逆性的分化。時素華等[22]實驗發(fā)現(xiàn),電針處理后Notch1和ps1的表達升高且較使用藥物顯著。由此可知電針可通過明顯增加Notch1和ps1表達從而抑制神經(jīng)細胞向膠質(zhì)細胞分化減輕大鼠脊髓損傷，促進脊髓損傷的再生和修復。Geng等[23]發(fā)現(xiàn)，電針“命門”“大椎”穴位后明顯抑制了脊髓損傷大鼠局部Notch1、Notch3、Notch4及Hes1mRNA的表達，阻止脊髓內(nèi)增殖的神經(jīng)干細胞向星形膠質(zhì)細胞分化，從而避免了星形膠質(zhì)細胞阻礙SCI修復。

4 小結(jié)

近年來，隨著中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)病率和死亡率的增高，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療方法也在不斷發(fā)展，大量臨床實踐證明，針刺治療中樞系統(tǒng)疾病具有較好的療效，針刺具有調(diào)理氣血、扶正固本和疏通筋脈的作用，能促進建立腦血管側(cè)支循環(huán)和改善機體“內(nèi)結(jié)內(nèi)瘀”的病理狀態(tài)[24]，但針刺療法治療中樞系統(tǒng)疾病的作用機制尚未明確。

Notch信號通路是一條對調(diào)節(jié)干細胞增殖分化和細胞凋亡等起重要作用的細胞通路。首先，Notch信號通路在神經(jīng)干細胞的維持和抑制分化方面起著決定性的作用，能促進神經(jīng)前體細胞進行自我分化增殖[6];其次，Notch信號通路的激活能增加血清中VEGF的分泌和減少ES的表達從而促進血管的再生[8],Notch信號通路也能夠直接或間接參與NSCs的自我更新;此外，Notch信號通路可以通過影響海馬神經(jīng)細胞可塑性而發(fā)揮對抑郁癥的治療作用，Notch信號還能作為一種促神經(jīng)膠質(zhì)分化信號在脊髓損傷后被激活，從而促進脊髓損傷的恢復。

綜上，Notch信號通路在針刺治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中具有重要作用，但針刺治療中樞系統(tǒng)疾病是多通路為媒介作用的結(jié)果[1]，因此Notch信號通路和其他通路之間如何共同作用參與治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病整個過程的機制以及Notch信號通路在特定時間點的作用值得進一步探究。