鏈霉菌抗生素生物合成中的細(xì)胞色素P450酶

潘麗霞 朱婧 王青艷 楊登峰

(1 廣西科學(xué)院非糧生物質(zhì)酶解國家重點實驗室 國家非糧生物質(zhì)能源工程技術(shù)研究中心，廣西生物質(zhì)產(chǎn)業(yè)化工程院 廣西生物煉制重點實驗室，南寧 530007；2 廣西科學(xué)院廣西北部灣海洋研究中心，廣西海洋天然產(chǎn)物與組合合成生物化學(xué)重點實驗室，南寧 530007)

細(xì)胞色素P450酶(P450s或者CYPs)是一類依賴于亞鐵血紅素，催化多種復(fù)雜氧化反應(yīng)的多功能酶。它廣泛地存在于各種生物體內(nèi)，包括細(xì)菌，真菌，哺乳動物以及人體。之所以得名P450，是由于在催化過程中，其和亞鐵血紅素相互結(jié)合，形成硫醇-亞鐵-一氧化碳復(fù)合物，該復(fù)合物在450nm處具有最大特征吸收波譜[1]。P450不但在有害異物的脫毒，類固醇的生物合成以及人體的藥物代謝中起非常重要的作用[2-3]，而且在天然產(chǎn)物的生物合成中也起到非常關(guān)鍵的作用[4-5]。

放線菌，尤其是其中的鏈霉菌屬，作為抗生素的主要來源之一，已經(jīng)被人們研究了幾十年。近年來，該菌屬的P450酶取得了進(jìn)一步的研究進(jìn)展，主要表現(xiàn)在以下幾個方面：一是隨著基因組測序技術(shù)的普及化和廉價化，人們可以從基因組水平發(fā)現(xiàn)P450酶，對P450酶序列的發(fā)現(xiàn)呈爆發(fā)式增長，逐漸向大數(shù)據(jù)發(fā)展；二是合成生物學(xué)的快速發(fā)展，人們對鏈菌屬來源的抗生素或者活性分子的生物基因簇的合成機制更加關(guān)注，對在基因簇中功能未知的P450酶做了深入地酶學(xué)特性鑒定；三是在結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究方面，相較于真菌或高等生物來源的P450酶，這些細(xì)菌來源的P450酶往往不是膜蛋白，這些樣本更容易得到晶體結(jié)構(gòu)，更多鏈霉菌的P450酶的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)得到解析，這對P450酶的催化機制和結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的研究更加有利；四是鏈霉菌的P450酶不僅操作簡單而且催化多樣，適合作為研究酶催化改造的素材，化學(xué)研究人員陸續(xù)成功地開發(fā)出多種新的催化反應(yīng)[6-8]。在本文中，對這些方面的最新進(jìn)展都進(jìn)行了綜述。

另外，更多化學(xué)研究人員參與到對P450的研究中成為近年來的一個趨勢。在化學(xué)合成中，碳?xì)浠罨磻?yīng)是將氧原子插入到不活潑的碳?xì)滏I上，是反應(yīng)最困難和研究最熱門的反應(yīng)之一，這類反應(yīng)也可以由P450催化完成[9-11]。這使得P450酶成為目前在合成生物學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)、酶工程以及有機化學(xué)中，研究最為廣泛的酶之一。

1 鏈霉菌P450的特點

1.1 P450催化反應(yīng)的類型多

P450催化的反應(yīng)類型之多[12-14]，是非常少見的。目前，在鏈霉菌屬，功能已經(jīng)有試驗證實的P450酶大約有不到200個左右[15]。按大類主要分為氧化、脫氫、偶合以及各種成鍵反應(yīng)。其反應(yīng)具體涉及十幾個反應(yīng)類型，具體包括為羥化、環(huán)氧化、芳香環(huán)羥化、脫氫、硝化、芳香環(huán)的偶合、脫酰基、碳碳鍵形成、碳氮鍵形成、碳氧鍵形成以及碳硫鍵形成反應(yīng)。

在氧化反應(yīng)中，最基本的反應(yīng)是羥化反應(yīng)。在天然產(chǎn)物的合成中，大部分的P450酶是起到羥化的功能，大約占到所有功能的三分之二。P450也能催化環(huán)氧化反應(yīng)和芳香環(huán)的羥化反應(yīng)。環(huán)氧化反應(yīng)經(jīng)?？梢栽诰弁肿拥暮铣芍锌吹?，因為這樣的分子往往具有很多碳碳雙鍵，可以發(fā)生環(huán)氧化來保持構(gòu)型。例如PimD(CYP161A2)催化聚烯抗生素納他霉素(pimaricin)的碳4位和碳5位產(chǎn)生環(huán)氧化[16]。OleP(CYP010D1)是一個在竹桃霉素(oleandomycin)合成中負(fù)責(zé)環(huán)氧化的P450酶，它環(huán)氧化碳8位和8a位上的兩個碳原子[17]。阿嗪霉素B(azinomycin B)的生物合成途徑中的AziB1是催化芳香環(huán)的羥化反應(yīng)的P450酶，它負(fù)責(zé)芳香環(huán)萘甲酸上的羥化反應(yīng)[18]。這類羥化反應(yīng)的機制，被認(rèn)為是首先發(fā)生在芳香環(huán)上的環(huán)氧化反應(yīng)，環(huán)氧化開環(huán)，借助氫氫轉(zhuǎn)移完成芳香環(huán)的重構(gòu)。

脫氫反應(yīng)中，P450酶可以完成2個或更多電子的脫氫反應(yīng)，將一個sp3雜化的碳原子變?yōu)橐粋€sp2或者sp1雜化的碳原子。對于脫氫反應(yīng)的分類不是十分清楚，因為在經(jīng)過2～3次脫氫后往往伴隨著非酶反應(yīng)的脫水，最終，形成酮、醛和酸。XiaM是一個在吲哚倍半萜廈霉素A(xiamycin A)生物合成途徑中，將甲基轉(zhuǎn)化為羧酸，還產(chǎn)生醇醛等中間體的P450酶[19]。另一個例子是在新型血管生成抑制劑Borrelidin途徑中的BorJ，它可以在一個四電子氧化的過程，將一個甲基轉(zhuǎn)化為一個醛[20]。另一類脫氫反應(yīng)是由P450的去飽和酶完成的。當(dāng)?shù)孜镒優(yōu)樽杂苫问剑蜁诎稳湓雍土u化之間產(chǎn)生一個競爭，羥化的產(chǎn)物和去飽和的產(chǎn)物之間是不能互相轉(zhuǎn)化的。一般是羥化的產(chǎn)物為主產(chǎn)物，但有時也有去飽和的產(chǎn)物是主要的產(chǎn)物的情況。在lactimidomycin(LTM)的生物合成中，LtmK可以將95%以上的LTM轉(zhuǎn)化為8,9-dihydro-LTM。同時，產(chǎn)生小于5%的8S和9R的羥化產(chǎn)物[21]。GdmP(CYP105U1)是一個在格爾德霉素(geldanamycin)生物合成中的去飽和酶，允許自由基重綁定到底物上，在其發(fā)酵菌的發(fā)酵液中分離到兩種立體構(gòu)型的羥化產(chǎn)物[22-23]。這些結(jié)果表明去飽和反應(yīng)是可以由酶反應(yīng)來控制的。

偶合反應(yīng)中，芳香環(huán)的偶合反應(yīng)常常對天然產(chǎn)物起到多種不同的作用，能夠創(chuàng)造出結(jié)構(gòu)的多樣性，如黑莫他丁(himastatin)和julichromes[24-25]；能夠使柔性的骨架更加地剛性，如糖肽抗生素(glycopeptide antibiotics, GPA)和星形孢菌素(staurosporine)[26-27]；還能夠聚合單體產(chǎn)生防曬的天然產(chǎn)物，如黑色素(melanins)[28]。天藍(lán)色鏈霉菌的CYP158A1和CYP158A2分別可以聚合淡黃霉素(flaviolins)形成可以抵抗紫外線輻射的多聚體。盡管這兩個蛋白有60%的序列同源性和相同的底物結(jié)合模式，但CYP158A1只形成二聚體的flaviolins，而CYP158A2至少形成4種flaviolins的聚合體[29-30]。相似的，灰色鏈霉菌的P450酶(CYP107F1)順序地催化氧化1,3,6,8-tetrahydroxynaphthalene(THN)[31]，首先完成分子間的?；己戏磻?yīng)，再通過一個分子內(nèi)的?；己戏磻?yīng)，最后，形成黑色素。目前，對于許多雙?；己戏磻?yīng)，還不是很清楚這些酶是利用自由基機制，還是利用正離子機制。

成鍵反應(yīng)中，StaP(CYP245A1)是一個負(fù)責(zé)分子內(nèi)碳碳鍵形成的P450酶，它是在星形孢菌素的生物合成途徑中，在兩個chromopyrrolic acid的吲哚環(huán)之間形成碳碳鍵，經(jīng)過一系列的質(zhì)子化和異構(gòu)化反應(yīng)產(chǎn)生吲哚并咔唑(indolocarbazole)的六元環(huán)[32]。TxtE是一個來源于植物病原菌鏈霉菌的P450酶，參與植物毒素thaxtomins的生物合成，產(chǎn)生碳氮鍵的硝化發(fā)生在色氨酸的碳4位[33-34]。HmtT負(fù)責(zé)催化黑莫他丁中六氫吡咯環(huán)的碳氮鍵形成，氮原子進(jìn)攻碳2位，形成碳氮鍵，碳3位上的羥基離去。相似的，StaN(CYP244A1)借助糖上碳5位的羥化，形成糖苷鍵，接著質(zhì)子化脫水產(chǎn)生親電的氧鎓正離子[35-36]。SgvP是一個在灰綠霉素(griseoviridin)的生物合成中，形成一個包含硫醇烯基團的9元環(huán)。據(jù)推測，這個反應(yīng)是通過環(huán)氧化不飽和的胺基，引起硫原子親核進(jìn)攻α碳原子催化碳硫鍵的形成[37-38]。

1.2 P450催化反應(yīng)的選擇性好

由于羥基的引入，P450的催化往往具有構(gòu)型和構(gòu)象的立體選擇性。在天然產(chǎn)物合成的過程中，這些反應(yīng)可以讓產(chǎn)物構(gòu)型更穩(wěn)定，同時，在天然產(chǎn)物的多樣性中發(fā)揮非常重要的作用。在糖肽抗生素中最大的特點，是它的七肽骨架形成多個雙芳香橋(C-C)或者雙酰脂橋(C-O-C)，如著名的萬古霉素。這些結(jié)構(gòu)是由P450酶催化完成的，而且，這個結(jié)構(gòu)的存在與否與這類化合物的活性密切相關(guān)的。如果線性的或者不完整的萬古霉素中間體，就會失去了原有的良好的抗菌活性。在鏈霉菌中，GPAA47934具有4個這樣的芳香橋，而萬古霉素只有3個這樣的芳香橋。4個CYP165家族的P450酶，StaH、StaG、StaF和StaJ分別負(fù)責(zé)C-O-D環(huán)，F(xiàn)-O-G環(huán)，D-O-E環(huán)和A-B環(huán)合成[31,39]。這些酶都具有自身獨特地催化位點，并形成具有立體選擇性的結(jié)構(gòu)。

1.3 P450催化反應(yīng)的功能多

P450在催化過程中，往往一個酶具有多步催化功能。最為著名的是PikC(CYP107L1)，它可以催化完成在不同大環(huán)內(nèi)脂環(huán)上的7個不同位置的羥化反應(yīng)，它可以催化12元環(huán)內(nèi)脂產(chǎn)生抗生素酒霉素(methymycin)和新酒霉素(neomethymycin)，在不同位置完成兩次羥化反應(yīng)產(chǎn)生抗生素novamethymycin[40-41]，也可以催化13元環(huán)抗生素那波霉素(narbomycin)產(chǎn)生苦霉素(pikromycin)[42-43]。來源于鏈霉菌Streptomyces thioluteus的P450酶AurH，在金鏈菌素(aureothin)的生物合成中，催化合成具有立體選擇性的四氫呋喃環(huán)。兩個碳氧鍵按順序地形成：首先是碳7位的亞甲基產(chǎn)生一個羥化的中間體，然后，是新產(chǎn)生的羥基和碳9a位[44-45]。目前，還不知道是否這種雜環(huán)化是利用一個雙羥基中間體還是自由基中間體來完成，相似的機制也出現(xiàn)在阿維菌素的合成過程中。

1.4 P450在基因組水平大量存在

不同于一般細(xì)菌中，P450數(shù)量較少或者甚至沒有，例如大腸埃希菌和鼠傷寒沙門菌都沒有P450酶基因的存在[46-47]，在鏈霉菌中，存在相對多的P450酶基因。例如兩個工業(yè)化生產(chǎn)菌種，阿維鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)和天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)，分別產(chǎn)生阿維菌素和放線紫紅素，已經(jīng)完成了全基因組的測序[48-49]。在這兩個菌種中，都發(fā)現(xiàn)了大量的P450酶基因，分別是18個和33個，占到全部編碼基因的0.2%和0.4%[50-51]。這個數(shù)字大大高于其他細(xì)菌中的P450數(shù)量。目前，在鏈霉菌中，大概有180個功能已知P450酶，無論是通過體外試驗、基因敲除，還是異源表達(dá)和結(jié)構(gòu)學(xué)研究，但還有大量未知功能的P450酶有待于去進(jìn)一步功能解析。

2 鏈霉菌P450的最新進(jìn)展

2.1 P450在合成生物學(xué)上的進(jìn)展

2015年，中科院南海海洋所的張長生課題組完成了heronamide生物合成途徑中的后修飾的P450酶HerO的發(fā)現(xiàn)，該酶催化碳8位的羥化反應(yīng)[52]?？股豲leandomycin生物合成途徑中的負(fù)責(zé)環(huán)氧化的P450酶OleP也完成了功能和結(jié)構(gòu)的鑒定工作，該酶是目前唯一一個在未激活碳碳鍵上完成環(huán)氧化的P450酶[53]。利用比較全基因組學(xué)，挖掘thiolactomycin的生物合成基因簇時，發(fā)現(xiàn)了一個不常見的P450酶，該酶負(fù)責(zé)thiotetronate ring的形成[54]。在研究pentalenolactone的時候，在最后一步修飾時，發(fā)現(xiàn)一個催化氧化重排的P450酶[55]。在platensimycin的生物合成途徑中，發(fā)現(xiàn)了形成脂環(huán)的P450酶[56]。另外，對pimaricin基因簇中的P450酶的刪除，可以產(chǎn)生一些新的結(jié)構(gòu)類似物，這些類似物表現(xiàn)出更好的的抗真菌活性[57]。同樣的情況，也出現(xiàn)在natamycin的生物合成中[58]。

2.2 P450在結(jié)構(gòu)生物學(xué)上的進(jìn)展

最早的P450酶的晶體結(jié)構(gòu)是于1985年被解析，是一個來自于惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)的P450酶(CYP101A1)[59]。隨后，每年P(guān)450的結(jié)構(gòu)都會有較大幅度的增長。到目前為止，蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(protein data bank, PDB)中，來自于鏈霉菌的有29個，13個是來自于聚酮的，8個是來自于非核糖體肽的，3個是來自于聚酮-非核糖體肽雜合體的，4個是來自于萜的生物合成途徑。另外，還有一個是未知功能。

2017年，參與griseoviridin生物合成的P450酶SgvP，作為第一個形成碳硫鍵的P450酶，得到了2.6埃的晶體結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)顯示Pro237在碳硫鍵的合成中起到關(guān)鍵作用[60]。糖肽抗生素合成中，NRPS(nonribosomal peptide synthetase)中的X-domain和P450的復(fù)合物結(jié)構(gòu)也得到了解析，為NRPS與外源蛋白相關(guān)作用的研究提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[61]。糖肽teicoplanin中負(fù)責(zé)環(huán)化D-O-E環(huán)的OxyA的晶體結(jié)構(gòu)也得到了解析[62]。另外，一些來源于鏈霉菌中新的P450酶結(jié)構(gòu)也到的了解析，如參與消炎藥物diclofenac和阿維菌素合成的CYP105D7和CYP107L2[63-64]。

2.3 P450在分子改造上的進(jìn)展

PikC是一個對十元環(huán)和十二元環(huán)大環(huán)內(nèi)脂都能進(jìn)行兩位點羥化的P450酶。這是一個系統(tǒng)研究的酶，從野生型、共結(jié)晶以及突變型的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，到計算機模擬，產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用平臺的構(gòu)建，將非專一性改造為可以進(jìn)行精準(zhǔn)羥基化的酶。首先，是它的晶體結(jié)構(gòu)和不同底物YC-17和那波霉素的共結(jié)晶結(jié)構(gòu)(PDB ID: 2C6H,2C7X)獲得了解析[65]，結(jié)果表明紅霉脫氧糖胺以兩種不同的方式和酶結(jié)合，一種是深埋的，一種是暴露的。消除Asp50的負(fù)電荷可以明顯地增加酶的活性，在突變體Asp50Asn的晶體結(jié)構(gòu)中，底物和酶都是以深埋的方式結(jié)合的，這樣，它的兩步底物結(jié)合機制被推測。利用底物工程化的技術(shù)，可以將碳10位和碳12位的產(chǎn)物從原來1:4變?yōu)?0:1[66]。另外，通過分子動態(tài)模擬和底物工程化策略，在共結(jié)晶結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，結(jié)合計算機計算，對P450酶PikC進(jìn)行蛋白質(zhì)工程，得到了可以催化不活潑碳?xì)滏I的新活力，現(xiàn)在該酶已經(jīng)構(gòu)建成為工業(yè)應(yīng)用的一個平臺[67]。

AurH是一個存在于聚酮抗生素金鏈菌素生物合成途徑中的多功能P450酶，分子改造是使其接受新的底物，產(chǎn)生新的產(chǎn)物。AurH隨機的氧化碳7位和碳9a位導(dǎo)致四氫呋喃的形成。它的晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID:3P3L, 3P3O, 3P3X, 3P2Z)是第一個CYP151A亞家族的P450酶結(jié)構(gòu)。蛋白配體對接模式顯示底物的吡喃酮環(huán)占據(jù)了一個疏水的活性口袋，通過改變活性口袋大小，來實現(xiàn)新反應(yīng)。突變體Phe89Trp和Thr239Phe明顯地減小了酶的催化效果，并且產(chǎn)生了一種新的金鏈菌素的類似物[68]。大的氨基酸色氨酸和苯丙氨酸借助位阻效應(yīng)改變了底物吡喃酮的綁定模式。這些突變體催化立體選擇六電子的轉(zhuǎn)化，借助羥基和醛基的中間體，將沒有活性的碳9a位上的甲基變?yōu)轸人?。同時，在相關(guān)突變體菌種的發(fā)酵液中，分離到新型的結(jié)構(gòu)類似物。

在分子改造方面，美國加州大學(xué)的Arnold課題組做出了非常的突出的貢獻(xiàn)。TxtE是第一個報道的有效催化硝化底物色氨酸的酶，分子改造是改變其底物結(jié)合位點，將硝化反應(yīng)的位點從色氨酸的碳5位變?yōu)樯彼岬奶?位。它的單獨晶體結(jié)構(gòu)和含有色氨酸底物復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)得到解析，但是由于天然狀態(tài)下該酶F-G環(huán)的不穩(wěn)定，導(dǎo)致并沒有搞清楚該環(huán)是如何和底物色氨酸如何相互作用的。借助計算機分子動態(tài)模擬軟件，使用馬爾科夫狀態(tài)，對F-G環(huán)的開環(huán)、閉環(huán)和過渡態(tài)3種狀態(tài)進(jìn)行了重構(gòu)。處于F-G環(huán)上的His176對于酶的不同狀態(tài)起到關(guān)鍵的控制作用[69]。計算結(jié)果顯示增加了176位的空間位阻，導(dǎo)致底物結(jié)合位點的偏移。

3 結(jié)語

P450酶作為自然界中存在最廣泛和催化最多樣的酶，在鏈霉菌屬廣泛存在，對它們的研究還只是一小部分，有待于進(jìn)一步研究。P450酶作為一個金屬蛋白，在催化過程中，可以說借助蛋白為載體，實現(xiàn)了金屬催化。而更多化學(xué)背景的研究人員開始利用P450酶完成一些新的催化反應(yīng)，將酶催化和過渡金屬催化相結(jié)合，讓生物學(xué)和化學(xué)充分融合，相信這個方向還會有更多有意思的研究出現(xiàn)。同時，借助計算機的動態(tài)模擬和共結(jié)晶的晶體學(xué)手段，相信對于P450酶的研究可以更上一個臺階，從分子水平對P450酶的催化機制做進(jìn)一步解析，為后續(xù)的蛋白質(zhì)改造奠定理論基礎(chǔ)。結(jié)合定向改造的方法，讓這些酶發(fā)揮出更大的作用，完成更多特異性的反應(yīng)。另外，基因組研究的快速發(fā)展加速了酶的研究，人們不再單純的依賴表型或現(xiàn)象去發(fā)現(xiàn)酶，全基因組測序技術(shù)可以讓你馬上發(fā)現(xiàn)所有備選的酶，為快速研究酶提供了新的可能。目前，本課題組以圍繞部分鏈霉菌的P450展開結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究，相關(guān)工作會在后續(xù)報道。