腹瀉人群致瀉性大腸埃希菌的流行及病原特征分析

蔡 軍

（法庫(kù)縣衛(wèi)生健康服務(wù)與行政執(zhí)法中心檢驗(yàn)科，遼寧 沈陽(yáng) 110400）

腹瀉在臨床上較為常見，大多由病原菌感染所致[1]。研究發(fā)現(xiàn)，致瀉性大腸埃希菌（DEC）屬于引發(fā)腹瀉病的主要原因之一，且臨床可按照其攜帶毒力基因不同分為腸致病性大腸桿菌（EPEC）、腸產(chǎn)毒性大腸桿菌（ETEC）、腸黏附性大腸桿菌（EAEC）、腸侵襲性大腸桿菌（EIEC）、腸出血性大腸桿菌（EHEC）等類型[2]。本次研究為證實(shí)這一點(diǎn)，選取152例有腹瀉癥狀患者的糞便標(biāo)本，分析DEC流行及病原特征，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源：選取2017年7月至2018年7月本縣152例有腹瀉癥狀患者的糞便標(biāo)本，均為入院確診后服用抗生素前采集。癥狀：每日排便≥3次，糞便形狀異常，如膿血便、黏液便、稀便等。其中，男85例，女67例；18～45歲68例，46～60歲44例，＞60歲40例。

1.2 儀器與試劑：包括法國(guó)梅里埃公司比濁儀、美國(guó)Bio-Rad公司Gel Doc凝膠成像系統(tǒng)、北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司大腸桿菌顯色培養(yǎng)基、北京ABT公司DEC多重檢測(cè)試劑盒、Amresco公司蛋白酶K等。

1.3 制備細(xì)菌DNA模板：在5 mL IEC肉湯內(nèi)接種糞便標(biāo)本，37 ℃下培養(yǎng)，持續(xù)18 h，取適量細(xì)菌，10000 r/min離心，持續(xù)5 min，取上清液。經(jīng)滅菌超純水懸浮沉淀，細(xì)菌濃度3×109CFU/mL。100 ℃條件下水浴，持續(xù)10 min，冷卻。4 ℃條件下，1000 r/min離心，持續(xù)10 min，取1 μL上清，作為PCR模板。

1.4 多重PCR鑒定：PCR反應(yīng)體系、條件：10×buffer 2.0 μL、dNTP 0.125 μmol/L，上游引物0.5 μmol/L，下游引物0.5 μmol/L，Taq DNA聚合酶0.25 μU；1 μL DNA模板，補(bǔ)充超純水，直至20 μL。94 ℃條件下預(yù)變性，持續(xù)5 min；94 ℃條件下變性，持續(xù)60 s；57 ℃條件下退火，持續(xù)60 s；75 ℃條件下延伸，持續(xù)60 s，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。最后，在72 ℃條件下延伸，持續(xù)10 min。以2%瓊脂糖電泳鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.5 細(xì)菌分離、鑒定：選取多重PCR檢測(cè)毒力顯示為陽(yáng)性的培養(yǎng)液，在ECC顯色培養(yǎng)基內(nèi)接種，實(shí)施分離培養(yǎng)。選取5個(gè)可疑DEC，實(shí)施單重PCR毒力基因鑒定，分化鑒定毒力基因陽(yáng)性菌株。按照引物設(shè)計(jì)原則，合成12對(duì)毒力基因引物（aggR、escV、stx1、stx2、elt等）及通用引物uisA。按照毒力基因及生化鑒定結(jié)果明確DEC類型。

1.6 藥敏試驗(yàn)：經(jīng)瓊脂擴(kuò)散法（K-B法）行藥敏檢測(cè)，按照美國(guó)國(guó)家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)規(guī)定的抑菌環(huán)直徑法分析結(jié)果，分為敏感株、耐藥株、中介株（中等耐藥）。藥敏試驗(yàn)質(zhì)控菌株包括金黃色葡萄球菌ATCC 25922、大腸埃希菌ATCC25922等，均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：數(shù)據(jù)以SPSS20.0軟件分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示，用χ2檢驗(yàn)對(duì)比。計(jì)量資料以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 檢測(cè)結(jié)果：本組152例糞便標(biāo)本經(jīng)多重PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)毒力基因陽(yáng)性標(biāo)本占10.53%（16/152）。陽(yáng)性標(biāo)本選取可疑菌落檢測(cè)，共檢出59株DEC。其中，33株為ETEC，18株為EAEC，5株為EPEC，3株為EHEC。58株DEC中，ETEC主要攜帶estlb（24株），EAEC主要攜帶astA（10株），EPEC主要攜帶escV（5株），EHEC主要攜帶stx2（3株）。

2.2 流行情況：男性DEC檢出率41.18%（35/85），女性則為35.82%（24/67），差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.452，P=0.501）；年齡18～45歲組檢出率54.41%（37/68），高于46～60歲組的27.27%（12/44）、＞60歲組的25.00%（10/40），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.995、8.863，P=0.004、0.002）。

2.3 藥敏試驗(yàn)：DEC對(duì)氨芐西林耐藥率最高，為47.46%（28/59），對(duì)亞胺培南敏感度最高，為0%。多重耐藥菌株占42.37%（25/59）。

3 討 論

DEC屬于腹瀉病一個(gè)重要病原。研究發(fā)現(xiàn)，DEC感染在細(xì)菌性感染腹瀉發(fā)生原因中占首位[3-4]。因此，臨床盡早經(jīng)有效措施檢測(cè)DEC，可進(jìn)一步了解腹瀉人群中感染情況，指導(dǎo)臨床診療。以往，臨床多采用常規(guī)方法檢測(cè)，但也具有操作時(shí)間長(zhǎng)、檢出率等特點(diǎn)，且DEC血清分型較多，極易出現(xiàn)交叉凝結(jié)現(xiàn)象，增加檢測(cè)難度。本次研究中采用多重PCR毒力檢測(cè)，并聯(lián)合生化鑒定等，可提升檢出率。本研究調(diào)查發(fā)現(xiàn)，152例腹瀉患者糞便標(biāo)本中DEC菌株檢出率為38.82%，與相關(guān)文獻(xiàn)[5]結(jié)果相符，提示DEC仍為引發(fā)腹瀉最常見致病菌。而在DEC類型上，本次研究多見ETEC，其次為EAEC、EPEC，EHEC菌株較少，僅為3株，分析是與所選病例、地域等因素有關(guān)。此外，不同性別患者DEC檢出率差異不顯著，與相關(guān)研究[6]結(jié)果相符。而在年齡上，18～45歲組檢出率最高，為54.41%，分析是因該年齡段青壯年生活習(xí)慣、飲食習(xí)慣、生活壓力等因素有關(guān)。多數(shù)DEC所致腹瀉患者可經(jīng)臨床選擇恰當(dāng)抗生素治療后獲得較好效果，但隨著抗生素濫用、誤用現(xiàn)象增多，耐藥菌不斷增多，影響治療效果。本次研究調(diào)查發(fā)現(xiàn)，DEC對(duì)氨芐西林耐藥率最高，但對(duì)亞胺培南較為敏感，故臨床可經(jīng)由藥敏檢測(cè)結(jié)果，選擇恰當(dāng)抗生素治療，以改善預(yù)后。

綜上所述，DEC為腹瀉發(fā)生主要致病菌，且多發(fā)于青壯年，臨床需加強(qiáng)耐藥檢測(cè)，以指導(dǎo)合理應(yīng)用抗生素。