選擇性剪接在慢性髓系白血病耐藥中的意義*

秦婷玉 劉靜 王小中

選擇性剪接（alternative splicing，AS）是指mRNA前體（pre-mRNA）經(jīng)剪接形成多種不同的成熟mRNA異構(gòu)體，生成結(jié)構(gòu)和功能各異的蛋白質(zhì)一系列過程。研究表明，此過程約在92%～94%的人類基因中發(fā)生，并且每個(gè)人類基因平均至少有5個(gè)轉(zhuǎn)錄物的異構(gòu)體［1］。諸多研究已證實(shí)，大部分腫瘤生物學(xué)過程（如代謝、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期控制、侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成等）均受到AS 的影響［2-6］；同樣在慢性髓系白血病（chronic myeloid leukemia，CML）中，也存在著AS事件，對(duì)CML 的發(fā)生、進(jìn)展、耐藥及免疫逃逸具有重要作用。本文綜述AS與CML耐藥的相關(guān)性，從CML的耐藥機(jī)制出發(fā)，以期發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)。

1 AS及其調(diào)控

AS 主要是由剪接體影響的轉(zhuǎn)錄過程，剪接體是由5 種小核核糖核蛋白（small nuclear ribonucleoproteins，snRNPs：U1、U2、U4、U5、U6）、19 種復(fù)合物（nineteen complex，NTC）以及NTC 相關(guān)復(fù)合物（NTCrelated complex，NTR）等其他輔助蛋白構(gòu)成［7］。研究表明，酵母中含有8 種不同狀態(tài)的剪接體，覆蓋了從組裝到被激活，從兩步交酯反應(yīng)到剪接體解聚的整個(gè)剪接通路，其中在預(yù)催化剪接體前體中首次觀察到U1 snRNP 對(duì)5'剪接位點(diǎn)的識(shí)別［8］，剪接為RNA 依賴性ATP酶/解旋酶驅(qū)動(dòng)的過程［9］。鑒于基因表達(dá)調(diào)控的復(fù)雜性，便于進(jìn)行高保真度的有效剪接，不僅通過富含絲氨酸/精氨酸的蛋白（serine/arginine-rich protein，SR protein）、核不均一核糖蛋白（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein，hnRNP）在內(nèi)的RNA結(jié)合蛋白（RNA binding protein，RBPs）的相互作用［10］，還通過剪接位點(diǎn)周圍基因序列突變的順式調(diào)控作用，以及寡聚嘧啶序列影響來調(diào)控基因的AS［11］。最近還發(fā)現(xiàn)可以通過PANDAR、SPA 和asFGFR2等lncRNA調(diào)控靶基因的AS過程［12］；甲基轉(zhuǎn)移酶METTL16、去甲基酶ALKBH5 和YTH 結(jié)構(gòu)域蛋 白YTHDC1等N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）修飾也可通過改變SF 與m6A 甲基化RNA 之間的相互作用能力來調(diào)控AS［13］。

2 AS與腫瘤耐藥

腫瘤治療的主要挑戰(zhàn)之一為最初對(duì)治療反應(yīng)良好的腫瘤最終對(duì)藥物產(chǎn)生耐藥性［14］。如組成型活性AR-V7剪接異構(gòu)體有助于前列腺癌患者對(duì)恩雜魯胺和阿比特龍的抗性［15］；PIK3CD-S 剪接異構(gòu)體在前列腺癌小鼠異種移植模型中有助于小鼠對(duì)PI3Kδ 抑制劑CAL-101的抗性［16］；攜帶BRAF剪接異構(gòu)體的黑色素瘤患者表現(xiàn)出對(duì)RAF 抑制劑威羅菲尼的抗性［17］；BRCA1-Δ11q 異構(gòu)體高表達(dá)促進(jìn)乳腺癌和卵巢癌藥物耐藥的發(fā)生［18］；雌激素受體ERα36 亞型與他莫昔芬耐藥乳腺癌中干細(xì)胞標(biāo)志物醛脫氫酶1A1（aldehyde dehydrogenase 1a1）的表達(dá)共定位并呈正相關(guān)［19］。同樣，研究表明越來越多剪接調(diào)控因子與耐藥性的誘導(dǎo)有關(guān)。如CLL患者SF3B1 基因突變顯示與氟達(dá)拉濱治療耐藥相關(guān)［20］；SRSF1癌基因介導(dǎo)肺腺癌對(duì)卡鉑和紫杉醇的耐藥性［21］；在胰腺癌細(xì)胞中通過siRNA 下調(diào)SRPK1導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和對(duì)順鉑和吉西他濱的敏感性增加［22］。針對(duì)上述腫瘤耐藥情況的發(fā)生，通過設(shè)計(jì)特定的siRNA、反義寡核苷酸（antisense oligonucleotides，ASOs）或小分子抑制劑糾正基因異常剪接，使腫瘤細(xì)胞對(duì)治療藥物重新敏感。

3 AS與CML耐藥

最近研究表明，酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase，TKI），如伊馬替尼（imatinib，IM）、吉非替尼和厄洛替尼等耐藥的發(fā)生不僅與BCR-ABL 基因激酶結(jié)構(gòu)域中出現(xiàn)點(diǎn)突變有關(guān)，也與CML 中廣泛異常的AS事件存在密切聯(lián)系。外顯子芯片研究表明［23］，與正常K562 細(xì)胞相比，伊馬替尼（imatinib，IM）處理的K562細(xì)胞共有185個(gè)差異表達(dá)基因和227個(gè)異常AS事件。如BCR-ABL35INS［24］、m-GSK3β［25］、Bcl-2 家族成員（Mcl-1、Bcl-x 和BID）［26］、BIM-γ［27］、PKM2［28］、Gfi1b-sp2［29］、CD44R1［30］等AS 異常剪接事件的發(fā)生與CML耐藥密切相關(guān)。本文選取研究較為深入的基因進(jìn)行詳細(xì)論述，從而尋求更為安全有效的臨床治療手段。

3.1 BCR-ABL

在CML 患者中，BCR-ABL1 激酶結(jié)構(gòu)域中的點(diǎn)突變?yōu)門KI 治療失敗的最常見原因。O'Hare 等［31］研究表明，BCR-ABL 剪接突變體BCR-ABL1 35INS（外顯子8、9 之間的部分內(nèi)含子保留）不能在穩(wěn)轉(zhuǎn)的Ba/F3 和K562 細(xì)胞中賦予對(duì)TKI 的抗性，但BCR-ABL1 35INS 可能在野生型BCR-ABL1 存在下賦予TKI 抗性。Abdullaev 等［32］研究表明，外顯子7 缺失的BCRABL1剪接體翻譯后未經(jīng)歷蛋白酶體降解，并與“野生型”BCR-ABL1 蛋白異二聚化，該過程可引起構(gòu)象變化，并導(dǎo)致與“野生型”BCR-ABL1酪氨酸激酶的ATP結(jié)合位點(diǎn)相結(jié)合的抑制劑被破壞，從而導(dǎo)致對(duì)第一代和第二代TKI的抗性。

3.2 Bcl-x

Bcl-x 通過AS 編碼長(zhǎng)型抗凋亡蛋白Bcl-xl 和短型促凋亡蛋白Bcl-xs，其中Bcl-xl［33］為線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，通過結(jié)合促凋亡的BAK，抑制線粒體外膜發(fā)生通透化（mitochondrial outer membrane permeab lisation，MOMP）、細(xì)胞色素C 等凋亡因子的釋放來抑制BCR-ABL1 細(xì)胞凋亡，也可促進(jìn)粒系-巨噬系祖細(xì)胞（granulocyte-macrophage progenitors，GMP）異常獲得干細(xì)胞特性惡化為G0期的白血病干細(xì)胞（leukemia stem cells，LSCs），LSCs 可以積累額外的突變，使得細(xì)胞的耐藥性進(jìn)一步增強(qiáng)［34］。采用常規(guī)TKIs 處理K562 細(xì)胞，雖然導(dǎo)致大量的BCR-ABL+細(xì)胞死亡，但并不能有效清除LSCs。ABT-199靶向G0期LSCs，增加CML細(xì)胞對(duì)TKIs等藥物的敏感性，對(duì)于CML 急變期的TKI 耐藥患者，使用低至納摩爾濃度的ABT-199 即可誘導(dǎo)CML 細(xì)胞凋亡，ABT-199和TKIs聯(lián)合使用時(shí)，Bcl-xs上調(diào)，Bcl-xl下調(diào)，CML 小鼠生存期延長(zhǎng)，抗白血病能力增強(qiáng)［35］。此外，研究已證明Bcl-2促凋亡家族BIM為IM介導(dǎo)的BCR-ABL 陽性白血病細(xì)胞凋亡的主要效應(yīng)物之一，與各種抗凋亡Bcl-2家族成員結(jié)合并使之失活，加強(qiáng)BAX 和BAK 在膜間線粒體空間中的促凋亡作用［36］。有研究提示，BIM 中外顯子3 的缺失多態(tài)性是除BCR-ABL1 激酶結(jié)構(gòu)域突變外影響TKI 敏感性的其他突變［37］。

3.3 PKM2/PKM1

PKM 通過AS 編碼包含外顯子9 的PKM1 和包含外顯子10 的PKM2，其中PKM1 和PKM2 分別與三羧酸循環(huán)和糖酵解相關(guān)。與正常細(xì)胞不同，腫瘤細(xì)胞即使在有氧環(huán)境中也傾向于糖酵解，而非三羧酸循環(huán)來代謝葡萄糖，該現(xiàn)象被稱為Warburg 效應(yīng)，此效應(yīng)通過調(diào)節(jié)丙酮酸激酶PKM1 和PKM2 亞型的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。研究表明，定位在線粒體的PKM2可通過穩(wěn)定Bcl-2 調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［38］。在CML中，BCR-ABL 通過mTOR/c-Myc/hnRNP/PKM 軸上調(diào)PKM2 的表達(dá)，導(dǎo)致自噬受損；IM 通過miR-124/PTBP1 信號(hào)級(jí)聯(lián)促進(jìn)PKM2 轉(zhuǎn)化為PKM1，擾亂了Warburg 效應(yīng)，代償性激活線粒體脂肪酸氧化（fatty acid oxidation，F(xiàn)AO）反應(yīng)［39］，F(xiàn)AO 對(duì)LSCs 存在至關(guān)重要。Klawitter 等［40］利用核磁共振波譜法對(duì)IM敏感和耐藥的CML 細(xì)胞株進(jìn)行代謝分析發(fā)現(xiàn)，糖酵解活性升高與IM耐藥有關(guān)。與IM敏感組比較，PKM2在IM耐藥CML 細(xì)胞中高表達(dá)，且PKM2/PKM1 比值顯著升高。高表達(dá)PKM2 促進(jìn)CML 糖酵解，進(jìn)而導(dǎo)致CML 耐藥現(xiàn)象。研究表明，脂肪酸衍生物AIC-47 促進(jìn)PKM2轉(zhuǎn)化為PKM1，抑制腫瘤特異性糖酵解以及IM代償激活的FAO 過程，并誘導(dǎo)CML 細(xì)胞發(fā)生自噬。與單獨(dú)使用的AIC-47或IM相比，兩者聯(lián)合治療對(duì)CML細(xì)胞殺滅作用更強(qiáng)［39］。

3.4 GSK3β

研究表明，LSCs的自更新及耐藥的發(fā)生，均與在Wnt 通路中β-連環(huán)蛋白的異常激活有關(guān)，LSCs 的自更新則支持CML 進(jìn)展為急變期［41］。正常狀態(tài)下，β-連環(huán)蛋白由絲氨酸/蘇氨酸激酶酪蛋白激酶Ⅰ（casein kinase Ⅰ，CKⅠ）和糖原合成酶-3（glycogen synthase kinase 3β，GSK3β）進(jìn)行泛素化和降解。在CML中，GSK3β 異常剪接導(dǎo)致GMP 中WNT/β-連環(huán)蛋白通路的異常激活［42］。Abramsson等［43］進(jìn)行cDNA測(cè)序分析顯示，在急變期CML 祖細(xì)胞中，外顯子8 和9 缺失導(dǎo)致的GSK3β 異常剪接異構(gòu)體（m-GSK3β）的出現(xiàn)，阻止β-連環(huán)蛋白磷酸化，促進(jìn)LSCs自更新，進(jìn)而導(dǎo)致耐藥的發(fā)生。在體外動(dòng)物模型導(dǎo)入全長(zhǎng)GSK3β，則CML 重建和侵襲能力下降［43］。與單獨(dú)使用GSK3β 抑制劑鋰或尼洛替尼相比，兩者聯(lián)合治療則BCR-ABL 癌蛋白水平降低，自噬增加，該現(xiàn)象的發(fā)生可能與m-GSK3β表達(dá)下調(diào)有關(guān)［44］。

3.5 其他與CML耐藥相關(guān)的剪接事件

上述研究均強(qiáng)調(diào)了異常pre-mRNA 剪接在CML發(fā)生和耐藥中的關(guān)鍵作用，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多CML 特異性剪接事件，包括但并不限于：BCR-ABL35INS［24］變體（外顯子8、9 之間的部分內(nèi)含子保留）導(dǎo)致編碼與TKI 結(jié)合的激酶部分的蛋白提前終止；m-GSK3β［42］剪接異構(gòu)體（缺失外顯子8 和9）導(dǎo)致WNT/β-連環(huán)蛋白通路的異常激活，促進(jìn)LSCs 的自更新；BIM-γ［27］缺失外顯子4編碼BH3結(jié)構(gòu)域，該區(qū)域?qū)τ贐IM的促細(xì)胞凋亡功能是必需的，采用BH3模擬藥物治療CML，可有效緩解BIM-γ 導(dǎo)致耐藥；Bcl-2 家族成員［26］（Mcl-1、Bcl-x和BID）是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，抑凋亡異構(gòu)體的表達(dá)促進(jìn)LSCs 存活和耐藥的發(fā)生；CML 可以在氧化應(yīng)激情況下通過定位在線粒體的PKM2［38］與Bcl-2之間的相互作用抑制細(xì)胞凋亡；IM 誘導(dǎo)的Gfi1b-sp2［29］剪接異構(gòu)體（缺失外顯子9編碼鋅指結(jié)構(gòu)域）過表達(dá)可能導(dǎo)致費(fèi)城染色體陰性CML 的出現(xiàn)；長(zhǎng)型CD44R1［30］剪接異構(gòu)體有助于LSCs黏附到基質(zhì)細(xì)胞表面，從而抵御機(jī)體免疫攻擊，促進(jìn)LSCs自更新?；谕怙@子芯片的基因組學(xué)研究揭示了耐藥CML 中廣泛的異常剪接［23］，癌癥基因組學(xué)研究的不斷深入將為開發(fā)癌癥精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的新型診斷和治療策略奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

TKI作為針對(duì)BCR-ABL的主要治療藥物現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于臨床，然而伴隨出現(xiàn)的耐藥也已成為其治療的最主要障礙，盡管針對(duì)其耐藥機(jī)制進(jìn)行了長(zhǎng)期研究，但耐藥患者的療效仍無明顯改善。綜上所述，部分關(guān)鍵基因的AS 對(duì)CML 耐藥的發(fā)生具有重要意義。隨著對(duì)CML耐藥相關(guān)基因異常剪接認(rèn)識(shí)的不斷加深，以關(guān)鍵剪接體元件或特定CML 耐藥相關(guān)基因剪接異構(gòu)體作為治療靶點(diǎn)，具有重要的臨床意義和廣闊的應(yīng)用前景。