轉(zhuǎn)基因抗草甘膦大豆的荒地生存競(jìng)爭(zhēng)能力

李昊陽， 劉 義， 李 娜， 陳 偉， 曹越平

(上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海 200240)

轉(zhuǎn)基因大豆是目前全世界種植面積最大的轉(zhuǎn)基因作物。自美國(guó)孟山都公司研發(fā)的首例抗草甘膦大豆GTS 40-3-2被獲批允許大規(guī)模種植以來，截至2016年年底，轉(zhuǎn)基因大豆的種植面積已經(jīng)達(dá)到9 140萬hm2，占全世界所有轉(zhuǎn)基因作物種植面積的 1/2、全世界大豆種植面積的78%[1]。

我國(guó)是世界上大豆消費(fèi)數(shù)量最多的國(guó)家，且大量依靠進(jìn)口。2016年我國(guó)大豆進(jìn)口量達(dá) 8 391萬t，價(jià)值339.8億美元，占全世界大豆進(jìn)口總值的67%[2]。相比之下，2014年國(guó)內(nèi)大豆產(chǎn)量?jī)H為 1 215萬t，占當(dāng)年大豆進(jìn)口量(7 140萬t)的比例不到1/5，且近年來國(guó)內(nèi)大豆產(chǎn)量呈緩慢下降的趨勢(shì)[3]。進(jìn)口大豆依存度高并未影響我國(guó)對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆嚴(yán)格的安全性要求，截至2017年年底，尚未有一種轉(zhuǎn)基因大豆通過農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)被商業(yè)化種植。

抗除草劑轉(zhuǎn)基因大豆是指將外源抗性基因?qū)氪蠖?，使其具有抗除草劑的特性。以GTS40-3-2為代表的具備抗除草劑特性的轉(zhuǎn)基因大豆自誕生以來取得了空前的成功，據(jù)統(tǒng)計(jì)1996—2015年的20年間其產(chǎn)生的經(jīng)濟(jì)價(jià)值高達(dá)500.4億美元[1]，并從根本上改變了國(guó)際上大豆的生產(chǎn)方式和貿(mào)易格局，使我國(guó)從世界最大的大豆出口國(guó)變成最大的大豆進(jìn)口國(guó)，國(guó)內(nèi)大豆供應(yīng)幾乎完全依賴進(jìn)口。在這樣嚴(yán)峻的形勢(shì)下，發(fā)展我國(guó)的轉(zhuǎn)基因大豆勢(shì)在必行。

對(duì)于抗除草劑轉(zhuǎn)基因大豆，最令人擔(dān)心的環(huán)境安全問題是抗除草劑轉(zhuǎn)基因大豆是否會(huì)變成雜草，在未來的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和環(huán)境安全中成為不可控的因素。劉娜等在研究中將轉(zhuǎn)基因作物的雜草化風(fēng)險(xiǎn)作為評(píng)價(jià)其安全性的重要一環(huán)[4-5]。轉(zhuǎn)基因作物的荒地生存競(jìng)爭(zhēng)能力是評(píng)價(jià)其雜草化風(fēng)險(xiǎn)的重要組成部分。國(guó)外商業(yè)化的轉(zhuǎn)基因作物在獲得商業(yè)化種植批準(zhǔn)之前都做了大量的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估工作。國(guó)內(nèi)許多學(xué)者也做過許多相關(guān)研究。周軍英等的研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因抗草甘膦大豆ARG與受體材料和當(dāng)?shù)刂髟云贩N相比抗逆性沒有差異，甚至更弱，雜草化風(fēng)險(xiǎn)很小[6]。宋小玲等研究表明，轉(zhuǎn)基因抗草甘膦大豆GTS40-3-2在南京地區(qū)生存競(jìng)爭(zhēng)能力在適宜季節(jié)顯著低于當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)品種，雜草化可能性很小[7]。馬小艷等研究表明，轉(zhuǎn)基因抗草甘膦抗蟲棉在荒地中無競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，無雜草化風(fēng)險(xiǎn)[8]。黃鷂等研究表明，轉(zhuǎn)EPSPS基因大豆NZL06-698整體生存競(jìng)爭(zhēng)能力比親本大豆弱，雜草化風(fēng)險(xiǎn)低[9]。目前尚未見關(guān)于我國(guó)自主研發(fā)的抗除草劑轉(zhuǎn)基因大豆荒地生存能力的研究報(bào)道。

隨著對(duì)轉(zhuǎn)基因作物研究的不斷深入，我國(guó)的轉(zhuǎn)基因安全評(píng)價(jià)研究也不斷細(xì)致和完善，2013年12月中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部發(fā)布了2031號(hào)公告，明確了抗除草劑作物環(huán)境安全檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)，包括除草劑耐受性、生存競(jìng)爭(zhēng)能力、外源基因漂移和生物多樣性影響等4部分[10]。本試驗(yàn)設(shè)計(jì)部分參照了該標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)筆者所在實(shí)驗(yàn)室研發(fā)的轉(zhuǎn)G10-EPSPS基因抗草甘膦大豆SHZD32-01進(jìn)行荒地生存競(jìng)爭(zhēng)能力試驗(yàn)，以檢驗(yàn)其是否具有雜草化風(fēng)險(xiǎn)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料分別為轉(zhuǎn)G10-EPSPS基因抗草甘膦大豆SHZD32-01以及該轉(zhuǎn)化體的受體材料中豆32、黃淮海地區(qū)主栽品種皖豆28。其中中豆32和皖豆28為生產(chǎn)上大面積使用的非轉(zhuǎn)基因大豆，SHZD32-01是上海交通大學(xué)曹越平教授課題組以浙江大學(xué)沈志成教授課題組提供的G10-EPSPS基因?yàn)榘谢?，以中?2為受體轉(zhuǎn)化得到的草甘膦抗性較強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因株系。

1.2 試驗(yàn)方法

選擇“1.1”節(jié)中的3個(gè)大豆材料，以地表撒播和常規(guī)方式分別于2017年4月27日、5月18日、6月10日和7月10日進(jìn)行播種，共播種4次，每個(gè)處理重復(fù)4次。每個(gè)小區(qū)的長(zhǎng)、寬均為2 m，面積為4 m2，播種數(shù)量為300粒，小區(qū)間設(shè)置0.5 m的隔離帶。播種后不進(jìn)行任何管理。

試驗(yàn)地位于上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院的轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)基地。與外界有大于100 m的非大豆隔離帶，對(duì)試驗(yàn)地實(shí)行封閉式管理，外側(cè)有圍墻、柵欄，進(jìn)出試驗(yàn)地須通過大門，大門有專人負(fù)責(zé)管理。轉(zhuǎn)基因抗草甘膦大豆材料的收獲、貯藏、運(yùn)輸和保管均有專人負(fù)責(zé)。試驗(yàn)結(jié)束后，除需要保管的材料以外，其余材料均全部銷毀。試驗(yàn)結(jié)束后至第2年年末，該試驗(yàn)地不再種植大豆，并由專人負(fù)責(zé)管理，以及時(shí)處理可能產(chǎn)生的大豆自生苗。

1.3 調(diào)查方法

1.3.1 大豆生長(zhǎng)情況及其與雜草的競(jìng)爭(zhēng)性 大豆播種前和播種后30 d至成熟期間，對(duì)每個(gè)小區(qū)進(jìn)行對(duì)角線5點(diǎn)取樣，每個(gè)樣點(diǎn)的面積均為 0.25 m2，記錄每個(gè)樣點(diǎn)的雜草種類、每種雜草的數(shù)量以及優(yōu)勢(shì)雜草群落的株高與相對(duì)覆蓋度，每月調(diào)查1次。與此同時(shí)，記錄全小區(qū)內(nèi)大豆數(shù)量和最高10株大豆的株高，并目測(cè)全小區(qū)的大豆相對(duì)覆蓋度。

大豆存活率=存活數(shù)量/播種數(shù)量×100%。

1.3.2 繁育系數(shù) 在大豆完熟期，對(duì)每個(gè)小區(qū)進(jìn)行對(duì)角線取樣，測(cè)量10株大豆的粒數(shù)，并按照以下公式計(jì)算繁育系數(shù)(中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部，2013年)。

X=n/10。

式中：X表示繁育系數(shù)；n表示10株大豆的總粒數(shù)。

1.4 分析方法

運(yùn)用SPSS 22.0軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行Duncan’s方差分析，檢驗(yàn)同一時(shí)期內(nèi)小區(qū)間的雜草差異性，以及大豆生長(zhǎng)發(fā)育指標(biāo)在轉(zhuǎn)基因抗草甘膦大豆與常規(guī)大豆品種之間的差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆存活率

由表1可知，在4、5月通過地表撒播方式播種的轉(zhuǎn)基因大豆SHZD32-01的存活率平均值在3次調(diào)查中均低于受體材料中豆32，與主栽品種皖豆28相當(dāng)；在6月通過地表撒播方式播種的轉(zhuǎn)基因大豆SHZD32-01的存活率僅在第3次調(diào)查中高于其他兩者，但也僅為1.08%，第1、2次調(diào)查中三者無顯著差異。SHZD32-01的存活率最高僅在10%左右。在常規(guī)方式播種下，4月播種的轉(zhuǎn)基因大豆SHZD32-01的存活率顯著低于中豆32和皖豆28，而中豆32和豌豆28之間差異不顯著；5月播種的轉(zhuǎn)基因大豆SHZD32-01的存活率顯著低于中豆32，且在8月的調(diào)查中顯著低于皖豆28；6月播種的轉(zhuǎn)基因大豆SHZD32-01的平均存活率在3次調(diào)查中均小于中豆32，但僅在第1次調(diào)查中差異顯著。7月通過2種播種方法播種的3種大豆均沒有出苗，存活率為零。

2.2 大豆株高

由表2可知，在4、5、6月通過地表撒播方式播種的轉(zhuǎn)基因大豆SHZD32-01、受體材料中豆32、主栽品種皖豆28的株高，除在5月27日的調(diào)查中SHZD32-01顯著低于皖豆28外，在其他調(diào)查中三者均無顯著差異。在常規(guī)方式播種下，4月播種的轉(zhuǎn)基因大豆SHZD32-01在前2次調(diào)查中平均株高顯著低于中豆32和皖豆28；5月播種的轉(zhuǎn)基因大豆SHZD32-01在生長(zhǎng)1個(gè)月、2個(gè)月時(shí)調(diào)查，平均株高低于中豆32和皖豆28，且在部分情況下差異顯著，在生長(zhǎng)3個(gè)月時(shí)調(diào)查， 平均株高與中豆32和皖豆28無顯著差異；6月播種的轉(zhuǎn)基因大豆SHZD32-01平均株高在生長(zhǎng)1個(gè)月時(shí)高于中豆32，低于皖豆28，但差異不顯著，在生長(zhǎng)2個(gè)月、3個(gè)月時(shí)顯著高于中豆32和皖豆28。7月播種的大豆未出苗。

表1 不同播種方式下各大豆品種的存活率Table 1 Emergence rate and survival rate of different soybean cultivars under different sowing methods in wasteland

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，下表同。同行數(shù)據(jù)后的不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，表2、表3、表5同。

表2 不同播種方式下各大豆品種的株高Table 2 Plant height of different soybean cultivars under different sowing methods

注：*表示6月地表撒播的大豆在9月調(diào)查時(shí)由于皖豆28僅有1株存活，未作方差分析。

2.3 大豆覆蓋度

由表3可知，在4、5、6月通過地表撒播方式播種的轉(zhuǎn)基因大豆SHZD32-01、受體材料中豆32、主栽品種皖豆28的覆蓋度在3次調(diào)查中均無顯著差異。在常規(guī)方式播種下，4月播種的轉(zhuǎn)基因大豆SHZD32-01的覆蓋度在5月的調(diào)查中顯著低于中豆32、皖豆28，但在后2次的調(diào)查中三者間差異不顯著；5月播種的轉(zhuǎn)基因大豆SHZD32-01和皖豆28的覆蓋度在3次調(diào)查中均顯著低于中豆32；6月播種的3種大豆在3次調(diào)查中的覆蓋度均極低，大多低于5%，僅在7月第1次調(diào)查中轉(zhuǎn)基因大豆 SHZD32-01 和皖豆28的覆蓋度顯著低于中豆32，但在后2次調(diào)查中三者間差異不顯著。7月播種的大豆未出苗，覆蓋度為0。

2.4 繁育系數(shù)

由表4可知，4月播種的轉(zhuǎn)基因大豆 SHZD32-01 的繁育系數(shù)明顯高于受體材料中豆32和主栽品種皖豆28。由于繁育系數(shù)在計(jì)算過程中并未考慮到出苗率等因素，考慮到SHZD32-01在地表撒播時(shí)存活率低于4%，在常規(guī)播種時(shí)其存活率僅為其他2種的1/2左右，因此該結(jié)果不能說明轉(zhuǎn)基因大豆荒地生存競(jìng)爭(zhēng)能力強(qiáng)于其他2種。5、6月播種的3種大豆繁育系數(shù)無顯著差異。

2.5 種植區(qū)域內(nèi)雜草發(fā)生情況

表3 不同播種方式下各大豆品種的覆蓋度Table 3 Coverage of different soybean cultivars under different sowing methods

表4 不同播種方式下各大豆品種在荒地的繁育系數(shù)Table 4 Breeding coefficient of different soybean cultivars under different sowing methods in wasteland

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

在轉(zhuǎn)基因大豆SHZD32-01的種植區(qū)域內(nèi)，主要雜草品種為蓮子草[Alternantherasessilis(L.) DC.]、狗尾草[Setariaviridis(L.) P. Beauv]、葎草(HumulusjaponicusSiebold & Zucc)、稗草[Echinochloaesculenta(A.Braun) H. Scholz]、節(jié)節(jié)草(EquisetumramosissimumDesf.)、小飛蓬[Conyzacanadensis(L.) Cronq.]和白羊草[Bothriochloaischaemum(L.) Keng]等，受體中豆32和主栽品種皖豆28種植區(qū)域內(nèi)的主要雜草種類與轉(zhuǎn)基因大豆SHZD32-01一致。

地表撒播與按常規(guī)方式播種，在同一播種期內(nèi)的轉(zhuǎn)基因大豆SHZD32-01、受體材料中豆32、主栽品種皖豆28小區(qū)內(nèi)的雜草覆蓋度無顯著差異(表5)，且雜草覆蓋度在整個(gè)調(diào)查期內(nèi)整體呈逐漸增加的趨勢(shì)。所有試驗(yàn)小區(qū)，至7月底雜草覆蓋度均達(dá)90%左右，8月及以后在繼續(xù)調(diào)查監(jiān)測(cè)時(shí)小區(qū)中的雜草覆蓋度達(dá)到100.0%，最終形成以蓮子草、葎草、狗尾草、稗草、節(jié)節(jié)草、小飛蓬、白羊草為優(yōu)勢(shì)種的雜草群落，優(yōu)勢(shì)群落的雜草高度達(dá)100 cm，雜草的競(jìng)爭(zhēng)使大豆生長(zhǎng)處于劣勢(shì)。

3 結(jié)論與討論

在相同的生長(zhǎng)條件和播種方式下，大豆的農(nóng)藝性狀表現(xiàn)反映了其生存競(jìng)爭(zhēng)能力的強(qiáng)弱。在地表撒播情況下，與受體材料和主栽品種相比，轉(zhuǎn)G10-EPSPS基因并未給大豆SHZD32-01帶來任何生存競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，由于地表撒播造成的低成活率，使得轉(zhuǎn)基因大豆SHZD32-01在與雜草的競(jìng)爭(zhēng)中處于明顯劣勢(shì)。在常規(guī)方式播種情況下，大豆的成活率得到一定程度的保證，但其生長(zhǎng)隨著雜草在4—9月的逐漸茂盛而逐漸受到抑制，7月播種的大豆甚至完全沒有出苗，8月起雜草覆蓋度在全部種植小區(qū)內(nèi)達(dá)到100%，其間轉(zhuǎn)基因大豆SHZD32-01與受體材料和主栽品種相比并未表現(xiàn)出生存競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，亦無法與雜草競(jìng)爭(zhēng)。因此， 轉(zhuǎn)基因大豆SHZD32-01的荒地生存競(jìng)爭(zhēng)能力明顯弱于雜草，與受體材料和主栽品種在多數(shù)情況下無顯著差異，不具備轉(zhuǎn)化為威脅生態(tài)環(huán)境安全的雜草的能力。該結(jié)論與周軍英等的相關(guān)研究結(jié)論[6-7，9]一致。

表5 不同播種方式下各大豆品種小區(qū)的雜草覆蓋度Table 5 Weed coverage in different plots under different sowing methods

就本試驗(yàn)結(jié)果而言，轉(zhuǎn)基因大豆SHZD32-01在存活率、株高和覆蓋度等多個(gè)方面略弱于其他2種大豆或相當(dāng)，但根據(jù)中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部2031號(hào)公告中的公式計(jì)算得到的其繁育系數(shù)反而整體上高于其他2種大豆，主要是因?yàn)樵摴轿纯紤]到結(jié)實(shí)的株數(shù)，建議在評(píng)測(cè)大豆的繁育能力時(shí)綜合考慮其存活率，以使結(jié)果更有參考價(jià)值。