TAT-Apoptin基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建及其表達(dá)鑒定

陳桂華 李翔輝 郁川

【摘? ?要】 為得到TAT-Apoptin融合蛋白，以pMD-19T-Apoptin為模板PCR擴(kuò)增出TAT-Apoptin基因，構(gòu)建重組載體pET-32a-TAT-Apoptin，并對(duì)TAT-Apoptin蛋白進(jìn)行表達(dá)。PCR和測(cè)序表明，成功構(gòu)建重組載體pET-32a-TAT-Apoptin，進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)該蛋白能與Apoptin多抗發(fā)生特異性結(jié)合。以上結(jié)果證明，TAT-Apoptin基因原核表達(dá)載體構(gòu)建成功，并能在Rosetta中進(jìn)行分泌性表達(dá)。

【關(guān)鍵詞】 TAT-Apoptin融合蛋白;重組載體pET-32a-TAT-Apoptin;分泌性表達(dá)

[Abstract]? In order to obtain TAT-Apoptin fusion protein， TAT-Apoptin gene was amplified by PCR with pMD-19T-Apoptin as template， the recombinant vector pET-32a-TAT-Apoptin， was constructed and the TAT-Apoptin protein was expressed. PCR and sequencing showed that the recombinant vector pET-32a-TAT-Apoptin， was successfully constructed to further express the protein， and it was found that the protein could specifically bind to Apoptin polyantibodies. The above results show that TAT- apoptin base The prokaryotic expression vector was successfully constructed and secreted in Rosetta.

[Keywords]? TAT-Apoptin fusion protein; secretory expression of recombinant vector pET-32a-TAT-Apoptin

凋亡素（Apoptin）是雞貧血病毒（chicken anemia virus， CAV）基因編碼的一種小分子功能蛋白，導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞后可表達(dá)凋亡素并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，對(duì)正常二倍體細(xì)胞則無影響[1，2]。但天然狀態(tài)下的Apoptin無法穿透細(xì)胞膜，人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus， HIV1）的反式激活蛋白（trans-activator transcription， TAT）可以在不損害細(xì)胞的情況下跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)與之融合表達(dá)的蛋白[3]。我們利用TAT這一特性，將TAT的編碼基因與外源蛋白基因Apoptin連接，表達(dá)TAT-Apoptin融合蛋白，該融合蛋白既有穿透性，又不影響外源蛋白的活性。鑒于此，我們構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET-32a-TAT-Apoptin，并對(duì)TAT-Apoptin蛋白進(jìn)行表達(dá)，從而為TAT-Apoptin的抗腫瘤作用研究奠定了一定的基礎(chǔ)。

1? 材料和方法

1.1? 細(xì)菌菌株和載體

pMD-19T-Apoptin質(zhì)粒由河南科技大學(xué)動(dòng)物疫病與公共安全實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存;E.coli-JM109、原核表達(dá)載體pET-32a、宿主表達(dá)菌菌株Rosetta均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2? 試劑

Taq DNA聚合酶、dNTP、DNA Marker、T4 DNA Ligase、限制性內(nèi)切酶EcoR I和Sal I、蛋白Marker均購自Takara（大連）有限公司;質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒均購自Axygen公司;LB培養(yǎng)基購自英國OXOID公司;兔抗Apoptin多抗購自武漢華美生物工程有限公司;硝酸纖維素膜、堿性磷酸酯酶標(biāo)記山羊抗兔二抗、BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;IPTG誘導(dǎo)劑購自Sigma公司;氨芐青霉素購自生工生物（上海）股份有限公司。

1.3? 方法

1.3.1 引物設(shè)計(jì)與合成? 根據(jù)GenBank中的CAV基因組序列（GenBank： AF199501）及相關(guān)文獻(xiàn)中[4]報(bào)道的TAT序列，運(yùn)用Primer Primer 5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)并合成如下特異性引物：TAT-Apoptin引物：

1.3.2 TAT-Apoptin基因的克隆與鑒定? 以構(gòu)建好的pMD-19T-Apoptin為模板，利用1.3.1設(shè)計(jì)合成的引物擴(kuò)增出TAT-Apoptin融合基因，并于pET-32a進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta中，挑取單菌落分別進(jìn)行PCR鑒定和酶切鑒定，陽性重組質(zhì)粒送上海生工測(cè)序。

1.3.3 TAT-Apoptin融合蛋白的表達(dá)鑒定? 挑取含有重組質(zhì)粒的Rosetta單菌落，接種到4ml（LB+A）液體培養(yǎng)基中，于37℃、200rpm振搖過夜培養(yǎng)。取50ul過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到5ml（2×YT+A）培養(yǎng)基中，于37℃、200rpm振搖培養(yǎng)4h左右加入1mmol濃度的IPTG，28℃、180rpm誘導(dǎo)表達(dá)7h后離心菌體，PBS洗兩遍，再用PBS重懸菌體，超聲破碎后再次離心，用200ul的PBS重懸沉淀，并分別于上清和沉淀中加入適量5×蛋白上樣液，100℃煮沸10min點(diǎn)樣進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳，而后進(jìn)行Western-blot鑒定。

2? ?結(jié)果

2.1? TAT-Apoptin基因的擴(kuò)增

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳顯示大小為411bp，與預(yù)期大小一致（見圖1）。

2.2? ?pET-32a-TAT-Apoptin鑒定

對(duì)pET-32a-TAT-Apoptin進(jìn)行PCR和酶切鑒定：PCR擴(kuò)增出411bp的目的條帶（見圖2）;經(jīng)EcoR I和Sal I雙酶切后出現(xiàn)大小分別為5900bp和411bp的兩條帶（見圖3）。結(jié)果表明，目的片段以正確方向插入原核表達(dá)載體pET-32a中。對(duì)克隆片段進(jìn)行序列測(cè)定及分析后，結(jié)果顯示重組載體pET-32a-TAT-Apoptin中包含完整的Apoptin基因及TAT序列，其中Apoptin基因序列與GenBank（AF199501）中發(fā)表的雞貧血病毒CAV基因序列相比同源性為99.7 %。但氨基酸序列同源性為100 %，說明克隆片段為TAT-Apoptin基因序列。

2.3? TAT-Apoptin蛋白的表達(dá)鑒定

含有重組質(zhì)粒的Rosetta經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，Western-blot顯示在約34 kDa處有TAT-Apoptin蛋白條帶，并且存在于過濾的上清中，表明TAT-Apoptin可在Rosetta中獲得分泌表達(dá)（見圖4）。

3? ?討論

腫瘤細(xì)胞的不受控增殖性是腫瘤難以治療的重要原因之一，如何促使腫瘤細(xì)胞凋亡成為各國學(xué)者探究的熱點(diǎn)[5]。研究發(fā)現(xiàn)，Apoptin可以選擇性促使腫瘤細(xì)胞凋亡，但是，處于天然狀態(tài)下的Apoptin透過細(xì)胞膜促使腫瘤細(xì)胞凋亡相當(dāng)困難。因此，如何使Apoptin在腫瘤組織聚集并順利進(jìn)入體內(nèi)腫瘤細(xì)胞，發(fā)揮其腫瘤特異性殺手的效用，是當(dāng)前亟待解決的問題。研究證實(shí)，HIV-1的反式激活因子TAT可攜帶小分子蛋白跨膜進(jìn)入細(xì)胞[3]，具有廣譜蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。因此，本實(shí)驗(yàn)將二者結(jié)合探究其在原核表達(dá)載體中的表達(dá)情況，為后續(xù)純化TAT-Apoptin蛋白并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡奠定了基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的TAT-Apoptin在Rosetta中具有很高的表達(dá)量，且目的蛋白大量出現(xiàn)在裂解上清中，說明其主要以分泌形式進(jìn)行了表達(dá)，這可能與Rosetta中含有的稀有密碼子有關(guān)，這些稀有密碼子為Rosetta菌提供了“萬能”翻譯，從而避免因大腸桿菌密碼子使用頻率導(dǎo)致的表達(dá)限制。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了能高效表達(dá)TAT-Apoptin蛋白的原核表達(dá)載體pET-32a-TAT-Apoptin，為進(jìn)一步探索Apoptin的抗腫瘤作用研究提供了一定材料。

參考文獻(xiàn)：

[1]? Yuasa N， Taniguchi T， Yoshida I. Isolation and some properties of an agent iducing anemia in chicks[J]. Avian Dis， 1979，23（2）： 366-385.

[2]? Noteborn MH， Todd D， Verschueren CA， et al. A singlechicken anemia virus protein induces apoptosis [J]. J Virol，1994， 68（1）： 346-351.

[3] S Debaisieux， F Rayne， H Yezid， et al. The ins and outs ofHIV-1 Tat[J]. Traffic， 2012， 13（3）： 355-363.

[4]? L Guelen， H Paterson， J Gaken， et al. TAT-apoptin is effi?ciently delivered and induces apoptosis in cancer cells[J].? ? ? ? ? ? ?Oncogene， 2004， 23（5）： 1153-1165.

[5]? LT Jia， SY Chen， AG Yang. Cancer gene therapy targeting?cellular apoptosis machinery[J]. Cancer Treat Rev， 2012， 38? （7）： 868-876