一例蛋雞空腸彎曲桿菌的分離與鑒定

黨媛

摘要：雞彎曲桿菌性肝炎又稱雞弧菌性肝炎，是由空腸彎曲桿菌（又稱弧菌）侵害雞的肝臟、脾臟、腎臟等內(nèi)臟器官而引起的一種細菌性傳染病。本研究對采集疑似患彎曲桿菌性肝炎的病雞肝臟進行空腸彎曲桿菌分離鑒定，并分析了該分離菌株抗生素敏感性，為有效控制此次空腸彎曲桿菌污染提供了科學依據(jù)和技術支撐。

關鍵詞：蛋雞;空腸彎曲桿菌;分離;鑒定

中圖分類號：S858.31??? 文獻標識碼：B文章編號：2095-9737（2019）11-0021-02

不同日齡的雞群都可感染空腸彎曲桿菌，但開產(chǎn)前后更易感染發(fā)病，雛雞感染后死亡率高，成年雞死亡率較低，但耐過雞生產(chǎn)力降低。病雞多出現(xiàn)肝臟腫大充血、壞死、變性等病理變化。病雞和帶菌雞是該病的主要傳染源，健康雞主要通過消化道感染。通常雞彎曲桿菌性肝炎多呈散發(fā)性流行，飼養(yǎng)管理不當或治療不及時常繼發(fā)感染其他疾病，導致發(fā)病率、死亡率升高，造成嚴重的經(jīng)濟損失，同時空腸彎曲桿菌被認為是引起人類腹瀉的常見病原菌之一，而其主要來源是禽肉產(chǎn)品，因此作為日益嚴峻的食源性疾病也威脅著公共衛(wèi)生安全。

1 發(fā)病情況

2018年7月，青海省西寧市某蛋雞養(yǎng)殖場發(fā)生疑似雞彎曲桿菌性肝炎的疫情，最初在產(chǎn)蛋初期軟殼蛋、砂殼蛋產(chǎn)出較多，但產(chǎn)蛋率可保持正常水平，到了產(chǎn)蛋中期產(chǎn)蛋率顯著下降，發(fā)病率也有顯著增加，大部分發(fā)病雞食欲下降、精神不振、雙眼無神、腹瀉、排黃白色水樣稀便，并伴隨零星雞死亡的情況，病死雞多雞冠蒼白、腹部增大。

2 臨床剖檢

隨機取20只病死雞進行病理剖檢，發(fā)現(xiàn)腹腔內(nèi)有大量紅色腹水，肝臟腫大質(zhì)脆、邊緣鈍圓、表面有黃白色壞死灶，脾和腎蒼白腫大、有針尖大小的出血點，心肌蒼白、心冠有出血斑點，有的病雞小腸黏膜有充血、出血，盲腸淋巴充血，有的病死雞卵巢變性、卵泡破裂。無菌條件下采集病死雞的肝臟組織進行病原菌分離。

3 分離培養(yǎng)

將肝臟病料接種于改良CCDA選擇性培養(yǎng)基上，置于10%濃度CO2恒溫箱中42℃培養(yǎng) 36 h，在培養(yǎng)基表面出現(xiàn)邊緣整齊、圓形、有金屬光澤的小菌落。將分離菌和病死雞肝臟經(jīng)革蘭氏染色后，鏡檢均可見革蘭氏陰性彎桿菌，呈逗點狀、螺旋狀或S狀。

4 PCR鑒定

采用雙重PCR對分離菌株進行鑒定，引物分別參照彎曲桿菌屬16S rRNA和空腸彎曲桿菌mapA基因序列設計，P1：5'-ATCTAATGGCTTAACCATTAAAC-3'，P2：5'-GGACGGTAACTAGTTTAGTATT-3'，目的條帶為857bp;F1：5'-CTATTTTATTTTTGAGTGCTTGTG-3'，F(xiàn)2：5'-GCTTTATTTGCCATTTGTTTTATTA-3'，目的條帶為590 bp。

用挑取CCDA平板上的典型可疑菌落加入200 μL超純水中混勻，沸水煮沸10 min，取出立即置于冰上，10000 r/min離心5 min，取上清做PCR鑒定的模板。

PCR反應體系為：2×Taq PCR Master Mix 10 μL、兩對上下游引物各0.5 μL、模板1 μL，補滅菌水至20 μL，同時設立陰性對照，反應條件為95℃預變性5 min，95℃變性30s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，進行30個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。PCR反應產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠板電泳后，用凝膠成像儀進行成像分析，結(jié)果與預期相符。根據(jù)發(fā)病情況、臨床癥狀、病理變化、實驗室檢查等，最終確定該蛋雞場感染了空腸彎曲桿菌。

5 藥敏試驗

根據(jù)該蛋雞養(yǎng)殖場日常的用藥情況，選擇常用的氨芐西林、阿莫西林、頭孢噻肟、頭孢曲松、鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、紅霉素、阿奇霉素、克林霉素、林可霉素、氟苯尼考、磷霉素、多黏菌素B、多西環(huán)素共計17種抗生素進行藥物敏感性試驗，藥敏試驗按照美國臨床實驗室標準化協(xié)會（CLSI）標準進行操作及判定。將菌液稀釋到一定濃度均勻涂布到CCDA平板上，將選定的藥敏片貼到平皿上合適的位置后，42℃微需氧培養(yǎng)48 h，根據(jù)各藥敏片的抑菌圈直徑判定藥物的敏感性，結(jié)果分離菌對頭孢噻肟、頭孢曲松、環(huán)丙沙星敏感，對氟苯尼考、磷霉素中敏，對多西環(huán)素低敏，其余均耐藥。

6 毒力測定

將典型菌落純化后的菌液接種到10枚8日齡雞胚卵黃囊內(nèi)，0.2 mL/枚，置于37℃溫室內(nèi)繼續(xù)孵化。結(jié)果第三天死亡4枚，第四天死亡5枚，第五天死亡1枚，死胚均出現(xiàn)胚體出血、肝臟壞死癥狀。收集死胚的尿囊液，經(jīng)革蘭氏染色、鏡檢，發(fā)現(xiàn)有呈螺旋狀、S型的陰性菌;將采集的病雞肝臟、脾臟等組織進行研磨后和收集的尿囊液混合，用適量的滅菌生理鹽水制成懸液，通過口服的方式接種6只18周齡健康蛋雞，結(jié)果在48 h內(nèi)均發(fā)病，且臨床癥狀、病理剖檢和革蘭氏染色等結(jié)果同養(yǎng)殖場病雞相同。

7 結(jié)論

本研究從疑似感染空腸彎曲桿菌的蛋雞養(yǎng)殖場采取病料，通過剖檢、細菌分離鑒定等相關實驗研究，最終確診了該養(yǎng)雞場疫情為雞彎曲桿菌性肝炎，并結(jié)合藥敏試驗，對臨床用藥給予了科學的指導，選擇高敏抗菌藥物進行治療后，疫情得到了有效的控制。

目前空腸彎曲桿菌是最為常見的一種食源性致病菌，在家畜家禽等動物體內(nèi)普遍存在。研究發(fā)現(xiàn)雞是最易攜帶空腸彎曲桿菌的動物，開產(chǎn)前后的蛋雞最容易發(fā)病，多呈散發(fā)或地方性流行。

我國作為禽類的養(yǎng)殖大國，禽類產(chǎn)品在消費品市場占有很大的比例，人類感染空腸彎曲桿菌的主要途徑就是食用了污染的禽類產(chǎn)品，一旦感染將導致腹瀉、關節(jié)炎和格林-巴利綜合征等疾病，嚴重危害公共安全，因此應加強從養(yǎng)殖場到百姓餐桌的空腸彎曲桿菌的監(jiān)測工作。

臨床上雞彎曲桿菌性肝炎常與其他疾病如大腸桿菌病、支原體病、沙門氏菌病等發(fā)生混合感染，致使發(fā)病雞群的病死率顯著提高，嚴重損害養(yǎng)雞業(yè)的經(jīng)濟效益，綜上所述在養(yǎng)殖過程中有效防控空腸彎曲桿菌具有重要的現(xiàn)實意義。