藍(lán)狐細(xì)管凍精標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)技術(shù)的研究

尚成志 李明 于新生 王冠菊 鮑亞萍

摘要：解決狐貍精子在冷凍及解凍過程中會(huì)出現(xiàn)的復(fù)蘇率低、形態(tài)結(jié)構(gòu)異常，特別是頂體畸形率高的問題，篩選出一種理想的狐貍精液冷凍稀釋液的配方，建立起一整套科學(xué)成熟規(guī)范的冷凍精液制作流程，實(shí)現(xiàn)狐貍細(xì)管型冷凍精液的工廠化、標(biāo)準(zhǔn)化、商業(yè)化生產(chǎn)，是擺在業(yè)內(nèi)研究人員面前的一道難題。本公司科研人員通過不懈努力，實(shí)現(xiàn)了芬蘭藍(lán)狐細(xì)管凍精的標(biāo)準(zhǔn)化批量生產(chǎn)。用自己生產(chǎn)的不同批次的芬蘭藍(lán)狐細(xì)管凍精對(duì)本地狐貍?cè)斯な诰?，總受胎率達(dá)到了76%～85%。現(xiàn)就研究成果和主要做法與業(yè)界同仁分享，以共同推動(dòng)狐貍冷凍精液人工授精技術(shù)的發(fā)展。

關(guān)鍵詞：芬蘭藍(lán)狐;細(xì)管凍精;人工授精;精子頂體;受胎率

中圖分類號(hào)：S829.9????? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B文章編號(hào)：2095-9737（2019）11-0013-02

動(dòng)物人工授精技術(shù)的應(yīng)用得益于雄性動(dòng)物精液在體外的成功保存。精液的保存方式有三種，即常溫保存（15～25℃）、低溫保存（0～5℃）和超低溫保存（-195.8℃）。動(dòng)物人工授精技術(shù)經(jīng)歷了實(shí)驗(yàn)階段、鮮精人工授精階段和冷凍精液人工授精階段。冷凍精液的劑型又分為顆粒型、安瓿型和細(xì)管型。目前細(xì)管型凍精是冷凍精液的最好劑型。因此細(xì)管冷凍精液制作，并用于人工配種是動(dòng)物人工授精技術(shù)的最高階段。

1 狐貍精液保存技術(shù)的概述及人工授精的優(yōu)越性

狐貍品種多、分布廣、野性強(qiáng)、膽小怕人、晝伏夜行、自然交配效果差。隨著人工授精技術(shù)在家畜、家禽業(yè)上的成功應(yīng)用，一些狐貍養(yǎng)殖企業(yè)和研究人員開始研究狐貍精液的保存技術(shù)和人工授精技術(shù)。實(shí)驗(yàn)證明：狐貍精子抵御超低溫環(huán)境的能力很差，我國(guó)狐貍精液的冷凍保存技術(shù)的研究和應(yīng)用一直在嘗試，很難有超越或突破。

實(shí)施狐貍冷凍精液人工授精技術(shù)能極大限度地提高優(yōu)良種公狐的配種效能，減少公狐的飼養(yǎng)成本;可解決因狐貍野性強(qiáng)、體格差異大、擇偶性強(qiáng)、母狐拒配、母狐弓腰難配、母狐外生殖器畸形和不規(guī)則等因素導(dǎo)致的自然繁殖困難;可有效地降低傳染病的傳播，特別是能阻斷生殖道器官接觸而傳播的疾病;方便種狐的引種和良種狐貍精液跨國(guó)、跨地區(qū)貿(mào)易;可提高種狐優(yōu)良基因的擴(kuò)散，加快新型品種擴(kuò)繁培育速度;能有效地克服由于不同種屬間、不同地域間狐貍由于發(fā)情配種時(shí)間不一致而造成的生殖隔離現(xiàn)象，實(shí)現(xiàn)赤狐、銀黑狐與北極狐屬間的種屬間雜交。

2 狐貍精液冷凍保存的現(xiàn)狀及技術(shù)壁壘

冷凍精液就是將人工采集的動(dòng)物的新鮮精液，加入稀釋液、防冷、防凍、抑菌等保護(hù)性物質(zhì)及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，經(jīng)冷凍和保存之后，再解凍融化，使用專門的器械輸送到發(fā)情雌性動(dòng)物生殖道的一定部位，使其受胎生殖后代所用的精液。

目前，在我國(guó)狐貍養(yǎng)殖尚屬于特種養(yǎng)殖，養(yǎng)殖規(guī)模小、從業(yè)人員少，政府對(duì)此行業(yè)的關(guān)注度和投入不高，相關(guān)技術(shù)的研究和應(yīng)用發(fā)展緩慢，仍未達(dá)到一定的水平。人們對(duì)狐貍?cè)斯な诰膽?yīng)用多限于“現(xiàn)采立輸”階段，對(duì)冷凍精液的研究多限于相對(duì)落后的、瀕臨淘汰的顆粒凍精制作與應(yīng)用階段。

在動(dòng)物冷凍精液的三種劑型中，顆粒型在成熟的凍精生產(chǎn)中已不再使用，安瓿型也逐漸被淘汰，細(xì)管型凍精具有使用方便、衛(wèi)生、安全、不易污染、受胎率高，便于標(biāo)記、攜帶、運(yùn)輸、儲(chǔ)存等優(yōu)點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)種狐的系譜管理和凍精的標(biāo)準(zhǔn)化批量生產(chǎn)。

狐貍精子的頭部呈扁卵圓形，頭部主要由核和頂體構(gòu)成，核內(nèi)含有遺傳物質(zhì)DNA。核的前部在質(zhì)膜下為帽狀雙層結(jié)構(gòu)的頂體，內(nèi)部有多種與受精作用有關(guān)的酶，是一個(gè)極不穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，它的畸形、缺損或脫落會(huì)使精子的受精能力降低或完全喪失。精子頂體的異常率高低是評(píng)定精液品質(zhì)好壞的重要指標(biāo)。有機(jī)體正常的形態(tài)結(jié)構(gòu)是確保其正常功能的前提和基礎(chǔ)。

大量研究發(fā)現(xiàn)：狐貍精子在超低溫下冷凍、保存及解凍會(huì)對(duì)精子的整體結(jié)構(gòu)，特別是頭部頂體造成一定的損傷。有研究人員從銀狐精子冷凍前后超微結(jié)構(gòu)變化中發(fā)現(xiàn)銀狐精子在冷凍前后頭部頂體形態(tài)發(fā)生了很大變化，冷凍前的精子頭部吸附了大量的精清物質(zhì)，精子赤道段的密度較低，而冷凍后精子損傷主要在頭部頂體，頂體層疏松，輕度膨脹，電子密度下降，表面凹凸不平，內(nèi)容物大部分流失，頂體外膜部分空泡化，原有物質(zhì)被一串大小不等的空泡所取代，頂體開始變大，出現(xiàn)褶皺、扭曲、分布不均的現(xiàn)象，并伴有部分脫落，完整率僅為35%～40%，進(jìn)而影響到母狐的受胎率。

因此篩選出一種適合狐貍精液冷凍的稀釋保護(hù)劑配方，建立一整套科學(xué)成熟的冷凍精液制作流程，仍然是擺在業(yè)內(nèi)研究人員面前的一道難題。

3 藍(lán)狐細(xì)管凍精標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)技術(shù)程序

近年來黑龍江省大興安嶺地區(qū)圖強(qiáng)林業(yè)局、黑龍江省博龍牧業(yè)有限責(zé)任公司聯(lián)合扎蘭屯職業(yè)學(xué)院畜牧獸醫(yī)系專業(yè)技術(shù)人員開展技術(shù)攻關(guān)，篩選狐貍冷凍精液稀釋保護(hù)液中的添加物質(zhì)種類、單位溶液添加量及配比，通過多重對(duì)比實(shí)驗(yàn)，確定了稀釋保護(hù)液的理想配方。深入研究精液稀釋的次數(shù)、稀釋溫度、降溫幅度、平衡溫度及時(shí)間等關(guān)鍵技術(shù)，終于取得了突破性進(jìn)展，實(shí)現(xiàn)了狐貍細(xì)管型冷凍精液的標(biāo)準(zhǔn)化、批量生產(chǎn)。其主要技術(shù)如下所述。

3.1 良種公藍(lán)狐的引進(jìn)與精液采集

引進(jìn)芬蘭10～36月齡純種健康的公藍(lán)狐150只，對(duì)成年種公狐進(jìn)行人工馴導(dǎo)，采用按摩法采精，取得藍(lán)狐的鮮精。

3.2 精液品質(zhì)檢查

使用精子檢測(cè)分析系統(tǒng)對(duì)精子的活力，密度、形態(tài)結(jié)構(gòu)、頂體完整率、總畸形率、有效精子數(shù)、精液pH值、精子活力變化情況等指標(biāo)進(jìn)行檢查。鮮精的活率在0.8以上，密度為5億～8億/ mL，總畸形率在20%以下，符合制作冷凍精液的品質(zhì)要求。

3.3 精液冷凍稀釋液的配制

研究結(jié)果顯示：以葡萄糖-果糖-三羥甲基氨基甲烷（Tris）-檸檬酸-卵黃-甘油液作為細(xì)管凍精凍稀釋液效果最佳。稀釋液分為不含卵黃、甘油的基礎(chǔ)液、基礎(chǔ)液+卵黃配制成的稀釋Ⅰ液、Ⅰ液+甘油配制而成的稀釋Ⅱ液。

3.4 精液稀釋、降溫與平衡

取20～25℃品質(zhì)合格的精液20 mL，加入同溫度的基礎(chǔ)液20 mL，攪拌混勻后，置于1500 r/min離心機(jī)中離心3 min，棄去上清液與底部雜質(zhì)，剩余的濃份精液約為20 mL。

取離心后的濃份精液，輕輕搖勻，在20～25℃溫度下，1∶1地加入稀釋Ⅰ液，進(jìn)行第二次稀釋。

取經(jīng)過第二次稀釋后的精液，緩慢降溫到4℃，1∶1地加入同溫度的含8%甘油的稀釋Ⅱ液，進(jìn)行第三次稀釋。值得說明的是，第三次稀釋液是分三次加入的，每次加入總量的1/3，間隔時(shí)間10 min。

將降溫至4℃，經(jīng)過第三次稀釋的精液放入4℃冰箱中平衡30 min，讓甘油充分地滲透到精細(xì)胞內(nèi)，發(fā)揮其膜內(nèi)保護(hù)劑的防凍功能。

3.5 精液品質(zhì)抽檢

取出少許平衡后的精液，升溫到室溫，鏡檢觀察活率的變化情況，按以上規(guī)程正確操作，活率可達(dá)到0.6，密度檢測(cè)儀檢測(cè)精子數(shù)為1億～2億/mL，有少部分精子出現(xiàn)彎曲、形態(tài)腫脹現(xiàn)象。

3.6 分裝、封口

將平衡后品質(zhì)合格的精液搖勻，放入4℃細(xì)管分裝機(jī)中進(jìn)行分裝、封口。其實(shí)在此過程中，精子仍處于平衡的狀態(tài)中。

3.7 冷凍與保存

將分裝好的細(xì)管碼盤放入程序冷凍儀中，按照預(yù)先設(shè)定好的冷凍曲線進(jìn)行冷凍。冷凍結(jié)束后取出，放入拇指罐包裝機(jī)內(nèi)進(jìn)行包裝，并做好相關(guān)記錄與標(biāo)簽，放入液氮罐中進(jìn)行保存。

3.8 抽樣解凍，檢查活力

從液氮罐中隨機(jī)取出細(xì)管凍精10支，放入40℃的溫水浴中約10 s，進(jìn)行解凍，在顯微鏡下檢查精液品質(zhì)。解凍后精子的活力不低于0.4，總畸形率不高于25%，頂體異常率不高于15%，每支細(xì)管中的有效精子數(shù)不少于1500萬。

3.9 凍精日常保管

定時(shí)向液氮罐中充入液氮，液氮量不少于總?cè)萘康?0%，確保凍精細(xì)管能全部沒入液氮中。

3.10 凍精運(yùn)輸

配送凍精細(xì)管前，要再次檢查精液品質(zhì)指標(biāo)，確保凍精品質(zhì)，并向用戶提供種公狐的系譜資料。凍精運(yùn)輸要遵循安全、平穩(wěn)、及時(shí)的原則，在液氮罐內(nèi)完成運(yùn)輸過程。

4 細(xì)管冷凍精液人工授精實(shí)驗(yàn)

4.1 狐貍發(fā)情鑒定

用外部觀察法、結(jié)合放對(duì)試情和排卵檢測(cè)儀檢查卵泡發(fā)育情況，進(jìn)行發(fā)情鑒定，確定最佳輸精時(shí)間。

4.2 凍精解凍與裝槍

將凍精細(xì)管放入42℃的溫水浴中，解凍10～12 s，取出后，用脫脂棉拭去細(xì)管上水分，用專用細(xì)管剪剪去封口端，裝入輸精槍內(nèi)。

4.3 輸精

用輸精槍專用套管打開母狐的陰道，插入適當(dāng)深度，插入輸精槍，緩慢將精液注入子宮頸深部。為確保受胎率，觀察母狐的發(fā)情表現(xiàn)，在第一次輸精后8～10 h，再輸精1次，1次發(fā)情輸精次數(shù)一般不超過3次。