高效液相色譜法同時測定飼料香味劑中肉桂醛、丁香酚、香芹酚和百里香酚含量的研究

任玉琴，張曉麗

（浙江省獸藥飼料監(jiān)察所，浙江杭州 311199）

肉桂醛、丁香酚、香芹酚和百里香酚屬調(diào)味和誘食類。該類添加劑的適量添加具有掩蓋飼料不良氣味，增加飼料的適口性，提高采食量，并具有優(yōu)異的抗菌、抗氧化、防霉、防腐等抗菌活性（李京晶，2006）。目前，已有多家企業(yè)生產(chǎn)含4種香味劑的混合型飼料添加劑，深受飼料生產(chǎn)企業(yè)及畜禽養(yǎng)殖場的歡迎。

近年來，研究報道較多集中在飼料香味劑對畜禽采食行為和采食量的影響 （楊晶晶，2016；孫偉明，等 2015；呂繼蓉等，2011）。 董茂峰（2015）和楊希國（2010）等分別利用氣相色譜和高效液相色譜法測定了飼料香味劑中的香芹酚和百里香酚；李會榮（2017）等利用氣相色譜法測定了飼料香味劑中的麝香草酚，丁香酚和香蘭素。但對飼料香味劑中肉桂醛、丁香酚、香芹酚和百里香酚4種有效成分同時測定鮮有報道。本研究建立了采用甲醇提取、高效液相色譜法同時測定飼料香味劑中肉桂醛、丁香酚、香芹酚和百里香酚的含量，本方法簡便、準確、重現(xiàn)性好。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器和設備 安捷倫1260高效液相色譜儀（配二極管陣列檢測器）；Mettler Toledo電子天平；超聲波清洗器。

1.1.2 試劑 乙腈（色譜純），甲醇（分析純）。

1.1.3 標準物質 肉桂醛對照品：純度≥98.9%（Dr.Ehrenstorfer公司）；丁香酚對照品：純度≥99.5%（Dr.Ehrenstorfer公司）；香芹酚對照品：純度≥98.0%（Sigma公司）；百里香酚對照品：純度99.5%（Dr.Ehrenstorfer公司）。

1.1.3.1 標準儲備液配制 精密稱取50 mg肉桂醛、500 mg丁香酚、500 mg香芹酚、500 mg百里香酚，分別置于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，制成濃度為1.0mg/mL的肉桂醛標準儲備液，10.0mg/mL的丁香酚、香芹酚、百里香酚標準儲備液。臨用前用甲醇稀釋。

1.1.3.2 標準工作液配制 準確移取肉桂醛、丁香酚、香芹酚、百里香酚標準儲備液適量，用甲醇稀釋， 分別配制成肉桂醛濃度為 0.2、1、5、10、20μg/mL，丁香酚、香芹酚、百里香酚濃度為2、10、50、100、200μg/mL的系列混合標準工作液。

1.1.4 市售樣品 混合型飼料香味劑S1（Ⅰ型，批號：20170801）、S2（Ⅱ型，批號：20170801）、S3（批號：17102701）、S4 （批號：20171031）、S5 （Ⅰ型，批號：251170320）、S6（Ⅱ型，批號：20170501）、S7（批號：20180301）。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱（粒度為 5μm，柱長 250mm，內(nèi)徑 4.6mm）；流速為1.0 mL/min；進樣體積20μL；柱溫30℃。

1.2.2 檢測波長的選擇 取肉桂醛、丁香酚、香芹酚、百里香酚的混合標準工作液，按上述色譜條件上機測定，進行全波長掃描，結果顯示肉桂醛、丁香酚、香芹酚、百里香酚分別在290、280、275、275 nm處有最大吸收波長。在三種波長條件下，肉桂醛的響應約是其他三種物質的10倍，丁香酚的響應略大于香芹酚和百里香酚，考慮到香芹酚和百里香酚響應小，出峰時間晚，選擇275 nm作為檢測波長，見圖1。

圖1 標準溶液色譜圖

1.2.3 流動相的篩選 本實驗采用甲醇∶水∶冰醋酸（60∶40∶2）和不同比例的乙腈和水作為流動相進行研究，結果顯示，采用甲醇∶水∶冰醋酸（60∶40∶2）作為流動相時，肉桂醛的測定有雜質干擾，無法分離，采用乙腈和水可以將雜質峰與肉桂醛分離，隨著乙腈含量提高，檢測時間縮短，香芹酚和百里香酚的分離度也逐漸縮小，最后選擇了乙腈∶水（45∶55）作為流動相，使 4個有效成分得到較好的分離，分離度R≥2.3。

1.2.4 樣品提取方法的篩選 肉桂醛、丁香酚、香芹酚、百里香酚均易溶于甲醇，因此采用甲醇進行提取。取五個不同廠家的市售樣品，分別采用10、20、30min進行超聲提取，結果表明在超聲20min后，有效成分的提取效果不再變化，故選擇甲醇超聲提取20min為樣品提取方法。

2 結果

2.1 標準曲線線性關系 取肉桂醛標準儲備液適量， 用甲醇配制成濃度為 0.2、1、5、10、20 μg/mL；取丁香酚、香芹酚、百里香酚標準儲備液適量，用甲醇配制濃度為 2、10、50、100、200 μg/mL 的混合標準溶液，按擬定的色譜條件下進行測定。結果4個有效成分在兩個數(shù)量級濃度范圍內(nèi)線性關系良好（r≥0.9997），線性最低濃度的信噪比均大于 45（表 1）。

表1 肉桂醛、丁香酚、香芹酚、百里香酚的線性關系

2.2 準確度和精密度

2.2.1 空白載體加標回收率實驗和精密度 飼料香味劑常用的載體為二氧化硅，故本實驗采用在二氧化硅中添加3個不同濃度水平的4種香味劑混合標準溶液，按照1.2.4中方法進行處理和擬定的色譜條件測定，結果4種香味劑的加標回收率為 96.8% ～ 102.7%，RSD≤2.0%（表 2）。

表2 空白載體加標回收率實驗和精密度

2.2.2 樣品加標回收率實驗和精密度 選取市售樣品S1，平行稱取5份，向樣品中加入3個質量濃度的4種香味劑混合標準溶液，考察實際樣品中的加標回收率和精密度，結果實際樣品的加標回收率為95.0%～102.6%，RSD為0.5% ～1.4%，回收率和精密度均符合要求（表3）。

表3 實際樣品的回收率和精密度實驗

2.3 樣品測定 精密稱取S1～S7樣品0.2～2 g（精確至0.0001 g），置于50mL容量瓶中，加甲醇超聲提取20 min，定容，搖勻，精密量取適量，用甲醇稀釋至濃度在標準曲線范圍內(nèi)，過0.45μm濾膜，按擬定色譜條件測定，以保留時間定性，標準曲線外標法定量。結果顯示，市售產(chǎn)品均含有2種或2種以上香味劑，有效成分分離良好，無雜質干擾，含量為2% ～40%（表4）。

3 結論

本研究建立了同時測定飼料香味劑中肉桂醛、丁香酚、香芹酚和百里香酚的高效液相色譜法，并對色譜條件、樣品前處理方法進行了優(yōu)化。實驗結果顯示，4種香味劑在25 min內(nèi)實現(xiàn)基線分離，所建立的方法操作簡便，方法專屬性強，線性范圍寬，準確度和精密度符合相關要求。

表4 市售樣品的檢測結果%

參考文獻

[1]董茂峰，韓薇，白冰，等.氣相色譜法測定飼料香味劑中香芹酚和百里香酚的含量[J].上海農(nóng)業(yè)學報，2015，31（3）：79 ～ 81.

[2]李會榮，宮玲玲.利用氣相色譜法同步測定飼料香味劑中麝香草酚，丁香酚和香蘭素的研究[J].中國飼料，2017，14：36～38.

[3]李京晶.香辛料植物揮發(fā)油有效成分測定及其抗菌活性研究：[碩士學位論文][D].北京：中國農(nóng)業(yè)大學，2006.

[4]呂繼蓉，曾凡坤，張克英，等.豬乳香味劑對斷奶仔豬采食行為和采食量的影響[J].動物營養(yǎng)學報，2011，23（5）：848 ～ 853.

[5]楊晶晶.不同復合成分香味劑對斷奶仔豬偏食性及應用效果研究：[碩士學位論文][D].沈陽：沈陽農(nóng)業(yè)大學，2016.

[6]楊希國，李永才.高效液相色譜法測定飼料香味劑中香芹酚和百里香酚含量的研究[J].中國飼料，2010，1：37～38.