泛素蛋白酶體途徑的應(yīng)用研究進展

董慧琳 聶紅明 梅昭荷 趙彬彬 姜煜資 陳建杰 王靈臺

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院肝病科，上海 201203；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)曙光臨床醫(yī)學(xué)院，上海 201203

機體中蛋白質(zhì)的降解主要有以下三條途徑：溶酶體途徑，非溶酶體、非能量依賴性的Ca2+依賴性蛋白酶途徑和泛素-蛋白酶體途徑（ubiquitin proteasome pathway，UPP）。UPP 是一種依賴ATP 進行的，具有高度特異性和選擇性的蛋白質(zhì)降解途徑，主要負(fù)責(zé)降解細(xì)胞內(nèi)超過80%的正?；虍惓５鞍踪|(zhì)[1]，并在細(xì)胞周期調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、核酸密碼翻譯等多種生命過程中發(fā)揮重要作用[2]。目前對該體系探索與研究有限，本文就UPP 對神經(jīng)退行性變、腫瘤、病毒感染、心腦血管疾病等方面進行闡述，以期為其后續(xù)研究與疾病治療提供思路。

1 UPP 的組成

UPP 包括泛素（ubiquitin，Ub）、泛素活化酶（ubactivating enzyme，E1）、泛素結(jié)合酶（ub-conjugating enzyme，E2）、泛素連接酶（ub-ligating enzyme，E3）、26S蛋白酶體（26S proteasomes）和去泛素化酶（deubiquitinating enzymes，DUBs）。

1.1 UPP 作用機制

在ATP 的參與下，Ub 在泛素啟動酶的一系列介導(dǎo)反應(yīng)下被激活，與靶蛋白共價結(jié)合，完成單泛素化。泛素化與磷酸化相似的是它們都屬于可逆過程，通過泛素化酶和去泛素化酶維持平衡。單泛素化不能降解靶基因，只是起到調(diào)節(jié)作用[3]。當(dāng)至少有4 個被激活的泛素連接到靶蛋白上形成多聚泛素鏈時，底物將被輸送至26S 蛋白酶體降解，而多聚泛素鏈在泛素再循環(huán)酶的作用下分解成單個泛素分子，再重新循環(huán)利用[4]，此為UPP 的經(jīng)典途徑。

Jiang、文津等[5-6]發(fā)現(xiàn)，在經(jīng)典途徑以外，泛素可以以胞內(nèi)游離狀態(tài)形成一種非固定性聚泛素鏈，與靶蛋白直接結(jié)合，該聚泛素鏈可以通過活化激活蛋白激酶1和IKK 激酶，調(diào)節(jié)核因子κB（NF-κB）信號通路。但目前對該途徑的研究有限，其作用機制與功能是否有別于經(jīng)典途徑尚待深入探索研究。

2 UPP 異常所致的疾病

泛素-蛋白酶體途徑是真核細(xì)胞依賴ATP 降解蛋白的途徑，該途徑異常會導(dǎo)致體內(nèi)蛋白質(zhì)的異常堆積，從而引發(fā)多種疾病。目前研究發(fā)現(xiàn)，UPP 異常會影響人體的神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)，影響心、肝、腎等器官，甚至與腫瘤的發(fā)生也息息相關(guān)。

2.1 UPP 與神經(jīng)退行性變

帕金森?。≒arkinson′s disease，PD）是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，最主要特征為中腦黑質(zhì)多巴胺（dopamine，DA）神經(jīng)元變性死亡以及路易小體的形成。臨床表現(xiàn)主要有靜止性震顫、肌強直、運動遲緩、姿勢步態(tài)障礙等運動癥狀，同時也可伴有非運動癥狀如情緒低落、焦慮、失眠、認(rèn)知障礙等。PD 的確切病因尚不清楚，已知相關(guān)因素有環(huán)境、年齡、氧化應(yīng)激等，遺傳也起著重要作用。目前已確定的PD 致病基因有αsynuclein、Parkin、泛素羧基端水解酶（UCH）L1、DJ-1、PINK1、LRRK2、ATPl3A2 及HTRA2 等16 種。α-synuclein 是PD 的重要致病基因，也是路易小體的重要組成部分，Rideout 等[7]與趙杰等[8]研究發(fā)現(xiàn)α-synuclein形成的包涵體對細(xì)胞具有毒性，可致細(xì)胞凋亡。UPP異常致使α-synuclein 異常積聚，可能在一定程度上通過細(xì)胞凋亡途徑導(dǎo)致DA 變性缺失。Gliekman 等[9]發(fā)現(xiàn)UCH-1 基因出現(xiàn)異常，會導(dǎo)致相應(yīng)蛋白酶活性降低，游離泛素減少，UPP 功能異常，毒性蛋白聚集而發(fā)病。Setsuie 等[10]發(fā)現(xiàn)193M 和S18Y 作為UCH-L1的2 個基因突變點位，193M 可能是PD 的致病因素，而S18Y 則可能是疾病的保護因素，因為在S18Y 型中蛋白水解酶活性增強，α-synuclein 穩(wěn)定性下降，使異常蛋白質(zhì)聚集量減少。Payami 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，Parkin蛋白作為E3 泛素蛋白連接酶的一員，其底物蛋白通過UPP 降解。故一旦Parkin 基因突變，Parkin 蛋白功能障礙，底物蛋白無法順利通過UPP 降解，會在細(xì)胞內(nèi)聚集，最終致DA 神經(jīng)元死亡。王雪晶等[12]的研究通過GST pull-down 實驗以及免疫共沉淀的方法驗證BAG5 與Parkin 在細(xì)胞內(nèi)外均有特異性的相互作用，證實BAG5 可延長Parkin 細(xì)胞內(nèi)的降解半衰期，穩(wěn)定其細(xì)胞內(nèi)水平，為PD 的治療提供新的研究思路。

阿爾茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）是臨床上最常見、最典型的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，臨床癥狀主要有失語、記憶障礙、認(rèn)知功能障礙和癡呆等，主要病理特征為神經(jīng)元外β 淀粉樣蛋白（amyloid β protein，Aβ）沉積形成老年斑（senile plaque，SP）和神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)原纖維形成纏結(jié)（neurofibrillary tangle，NFT）。Golab等[13]在SP 和NFT 中發(fā)現(xiàn)泛素和某些蛋白酶體亞基，提示AD 患者腦中UPP 一旦出現(xiàn)異常，無法及時降解Aβ 等異常蛋白，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡。陳勤等[14]經(jīng)實驗發(fā)現(xiàn)UPP 參與AD 的發(fā)生過程，中藥遠(yuǎn)志的主要活性成分遠(yuǎn)志皂苷能明顯降低AD 大鼠腦內(nèi)Aβ1-40沉積和tau 異常磷酸化水平。Bergman 等[15]發(fā)現(xiàn)一旦蛋白酶活性被抑制，PS1 與PEN2 蛋白酶體底物水平會相應(yīng)升高，Aβ 數(shù)量增多引起疾病。除AD、PD 外，多種神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生均與蛋白質(zhì)異常聚集相關(guān)[16]，但UPP 致病的作用機制尚需深入研究，蛋白酶體調(diào)節(jié)劑或抑制劑能否作為神經(jīng)保護劑可能成為新的研究方向。

2.2 UPP 與腫瘤

泛素結(jié)合酶E2C（ubiquitin-conjugatingenzymeE2C，UBE2C）屬于UPP 組成中E2 家族成員。Chen 等[17]研究驗證并進一步表明，在正常組織中UBE2C 表達(dá)非常低，但在腫瘤組織中偏高，在肝癌組織中表達(dá)率高達(dá)90%之上、在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)率高達(dá)91%。Fujita 等[18]運用免疫組化分析，也發(fā)現(xiàn)UBE2C 在結(jié)腸癌、乳腺癌組織中表達(dá)顯著增高。Rajkumar 等[19]研究發(fā)現(xiàn)UBE2C 在3 期宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變組織中表達(dá)顯著增高，可用于早期宮頸癌診斷。Skp1-Cullins-F-box蛋白復(fù)合物（SCF 復(fù)合物）E3 泛素連接酶是最大的泛素連接酶家族成員，可促進多種蛋白進行泛素化降解，對細(xì)胞周期、DNA 復(fù)制等多種生物過程具有重要調(diào)節(jié)作用，與腫瘤關(guān)系密切[20]。劉慶濱等[21]證實F-box成員之一的Skp2，負(fù)責(zé)底物的識別和泛素化降解，參與細(xì)胞周期調(diào)控，在檢測120 例胃癌和30 例正常胃黏膜組織后發(fā)現(xiàn)Skp2 在胃癌組織中陽性表達(dá)與腫瘤的分化程度呈正相關(guān)（χ2=9.875，P=0.002），影響胃癌細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展。馮愛強等[22]采用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法（RT-PCR）檢測40 例乳腺癌組織、20 例乳腺纖維腺瘤組織和20 例正常乳腺組織中的Skp2mRNA 表達(dá)，得出Skp2 參與乳腺癌發(fā)生發(fā)展的結(jié)論。E3 泛素連接酶c-Cb1 參與多種蛋白的泛素化降解，并參與受體酪氨酸蛋白激酶的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[23]。有報道稱c-Cb1 與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[24]。Ximing 等[25]經(jīng)實驗發(fā)現(xiàn)肺癌中c-Cb1 會引起P-EGFR、P-ERK 兩種蛋白表達(dá)水平下調(diào)，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖通路活化。Jiao 等[26]通過對94 例非小細(xì)胞肺癌患者的觀察發(fā)現(xiàn)c-Cb1 可以下調(diào)表皮生長因子受體活化，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖。李嵐等[27]應(yīng)用免疫組織化學(xué)法，檢測124 例胃癌組織中c-Cb1 蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其在胃癌組織中的陽性率達(dá)71.0%，建議將其作為胃癌早期診斷指標(biāo)。

腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL），又稱Apo2L，是腫瘤壞死因子超家族成員，當(dāng)它與相應(yīng)受體結(jié)合后可誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡，且對正常細(xì)胞無影響[28]。Hao 等[29]用MTT 法測定細(xì)胞生長抑制效應(yīng)，用Western Blot 檢測Caspase-4、Caspase-8，得出結(jié)論UPP 參與TRAIL 誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡過程，并指出Caspase-4、Caspase-8 是該過程中的關(guān)鍵分子。另有研究[30]發(fā)現(xiàn)泛素連接酶Cb1 家族與TRAIL 的關(guān)系，稱TRAIL可上調(diào)Cb1 蛋白表達(dá)，從而抑制Jurkat T 細(xì)胞中PI3K/Akt 信號過度活化，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。細(xì)胞內(nèi)蛋白分子有序降解是保證細(xì)胞功能的關(guān)鍵，UPP 異常影響多種凋亡調(diào)節(jié)蛋白和轉(zhuǎn)錄因子的降解，從而影響腫瘤細(xì)胞的凋亡。UPP 在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用日益得到關(guān)注，并成為腫瘤治療的靶點之一，值得深入研究。

2.3 UPP 與病毒感染

病毒是由核酸分子（RNA/DNA）和蛋白質(zhì)構(gòu)成的沒有細(xì)胞結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，必須依靠宿主細(xì)胞，借助其復(fù)制系統(tǒng)才能繁殖存活。當(dāng)其侵入人體時，須通過人體三道免疫防線：皮膚黏膜及其分泌物、以干擾素和NK細(xì)胞為主的先天性免疫和特異性免疫。宿主細(xì)胞通過NF-κB、IRF3 和IRF7 誘導(dǎo)干擾素的產(chǎn)生，清除病毒，而同時病毒也會通過編碼模仿（如編碼泛素連接酶E3 功能域）或改變宿主E3 連接酶底物蛋白的特異性等方式，從宿主的免疫攻擊下逃脫[31]。

人巨細(xì)胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）又稱涎病毒，是人類皰疹病毒組中最大的一種病毒。MHCⅠ類和Ⅱ類分子在免疫系統(tǒng)中的關(guān)鍵作用是將病毒抗原提呈至細(xì)胞表面，最終使病毒被CD8＋和CD4＋T細(xì)胞識別并殺傷。HCMV 進入人體后會合成4 種病毒蛋白，分別為US2、US3、US6 和US11，這4 種病毒蛋白分別作用可抑制MHCⅠ類和Ⅱ類分子的抗原提呈[32]。US3 使MHCⅠ類蛋白滯留于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，隨后US6變構(gòu)影響MHCⅠ類分子裝配，US2 和US11 隨之協(xié)同誘導(dǎo)MHCⅠ類分子錯位，通過UPP 進行泛素化降解，使HCMV 不被CD8＋T 細(xì)胞識別殺傷。另一項研究[33]指出人體感染HCMV 后，其病毒基因表達(dá)的pp65 蛋白也參與到US2、US3、US6 和US11 的 抑制MHCⅠ類分子向CD8＋T 細(xì)胞抗原提呈的過程。在抑制MHC Ⅱ類分子的抗原提呈方面，US2 和US3 可協(xié)同作用，通過UPP 降解Ⅱ類蛋白DR-α 和DM-α[34]，致使只有少量的DR-α 和DM-α 被CD4+T 細(xì)胞識別，從而逃脫被識別殺傷。

乙肝病毒（hepatitis Bvirus，HBV）屬于嗜肝DNA病毒科，含有S、C、P 和X 這4 個開放讀碼框架，其中X 區(qū)編碼生成的HBX 蛋白是最小的HBV 編碼蛋白。Robinson 等[35]在上世紀(jì)即發(fā)現(xiàn)禽類在感染嗜肝DNA病毒后不會產(chǎn)生HBX 蛋白，疾病不會發(fā)展成肝癌，推斷出HBX 蛋白在肝癌的發(fā)生中起重要作用。陳江等[36]經(jīng)實驗證實HBX 蛋白可上調(diào)Survivin 和p53 蛋白表達(dá)，促進肝癌的發(fā)生發(fā)展。當(dāng)HBV 侵入人體，細(xì)胞會通過UPP 選擇性降解HBX 蛋白，抑制HBV 病毒在體內(nèi)復(fù)制，而同時，HBX 蛋白與蛋白酶體的PSMA7 和PSMC1這兩種亞基相互作用[37]，降低蛋白酶體活性，抵御免疫系統(tǒng)的攻擊。另有研究[38]發(fā)現(xiàn)HBX 蛋白會挾持損傷DNA 結(jié)合蛋白（damaged DNA binding protein，DDB）成員之一的DDB1，利用其參與泛素化修飾調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、修復(fù)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等功能，復(fù)制自身免受免疫攻擊。

曹雪濤[39]等歷經(jīng)10 年研究發(fā)現(xiàn)一種新的E3 泛素連接酶Nrdp1，在Toll 樣受體（Toll like receptor，TLR）的信號傳導(dǎo)過程中起重要作用，可促進MyD88（Myeloid differentiation primary response gene 88）的泛素化降解，激活TANK binding kinase 1（TBK1），從而抑制炎性因子產(chǎn)生，促進Ⅰ型干擾素生成，在抗炎和抗病毒方面有很好的作用。

其他如單純皰疹病毒（HSV）、EB 病毒、人獲得性免疫缺陷病毒（HIV）等或利用UPP 或通過自身修飾逃逸UPP 或攻擊UPP[34]，復(fù)制自身病毒，逃脫人體免疫系統(tǒng)。UPP 與病毒、免疫系統(tǒng)之間的關(guān)系十分密切，雖然其具體機制不明確，但為病毒及相關(guān)疾病治療提供了很好的研究方向，隨著研究的深入，相信會有更好的抗病毒藥物問世。

2.4 UPP 與心血管疾病。

BRCC36 是2003 年發(fā)現(xiàn)的去泛素化酶成員，屬JAMM（Jab1/MPN/Mov34 metalloenzyme）/MPN+（Mpr1/Pad1 Nterminal）亞類，通過形成26S 蛋白酶體和COP9信號體后具有去泛素化活性，參于DNA 損傷修復(fù)、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及細(xì)胞周期控制等多種細(xì)胞活動[40]。有研究[41]發(fā)現(xiàn)在TGF-β 信號通路中，胞質(zhì)內(nèi)的BRCC36 與Smad3 結(jié)合增多，提示BRCC36 參與、共同作用于靶基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平的調(diào)控。而TGF-β 可以促進Treg成熟，協(xié)助Treg 的存活[42]，發(fā)揮其調(diào)節(jié)機體免疫功能，控制動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展[43]。另有報道[44]TGF-β1在急性腦缺血時表達(dá)增加，促進微血管增生，減輕腦缺血損傷。Miskinyte 等[45]發(fā)現(xiàn)BRCC36 基因敲除斑馬魚血管生成障礙，提示其在血管形成過程中發(fā)揮重要作用。

NF-κB 廣泛存在于細(xì)胞質(zhì)，調(diào)節(jié)多種蛋白基因轉(zhuǎn)錄，參與多種炎性反應(yīng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，其游離活化只在IκBα 被26S 蛋白酶體降解后才發(fā)生，提示UPP在激活NF-κB 的過程中發(fā)揮重要作用[46]。有研究顯示[47]NF-κB 可調(diào)節(jié)抗動脈硬化因子IL-10，并在動脈粥樣硬化繼發(fā)缺血性腦卒中引起的腦損傷過程中發(fā)揮重要作用[48]。心肌細(xì)胞遭受刺激，會導(dǎo)致IκBα 被泛素化降解，激活NF-κB 參與調(diào)控心肌細(xì)胞凋亡，從UPP 在NF-κB 激活中的作用角度考慮，結(jié)合NF-κB對于心肌細(xì)胞的調(diào)控作用，為心血管疾病的治療提供新思路和治療靶點。

抑癌因子p53 與UPP 關(guān)系密切，轉(zhuǎn)錄輔助激活因子P300 通過UPP 影響mdm2 調(diào)節(jié)的p53 轉(zhuǎn)換[49]，用特異性蛋白酶體抑制劑MG132 或lactacystin 使UPP 失活會使p53 轉(zhuǎn)錄活性降低，提示UPP 不僅影響p53 轉(zhuǎn)換，且參與轉(zhuǎn)錄過程。有實驗[50]測定高血壓患者（50 例）與正常組（50 例）外周血涂片淋巴細(xì)胞中p53蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)高血壓組陽性細(xì)胞率為（59.9±24.4）%，顯著高于正常組的（22.8±15.2）%（P ＜0.01），得出結(jié)論在高血壓患者中存在p53 基因突變，與高血壓患者的左室肥厚呈正相關(guān)。p53 還可指導(dǎo)促凋亡基因Bax的轉(zhuǎn)錄而促使心肌細(xì)胞凋亡，對包括高血壓在內(nèi)的多種心血管疾病起重要作用[51]。

從UPP 角度對心血管疾病領(lǐng)域的相關(guān)研究仍較少，更多實驗研究的開展，可為該領(lǐng)域的疾病防治拓寬新途徑。

2.5 UPP 與其他疾病

張志堅等[52]建立“失血性休克-內(nèi)毒素”二次打擊大鼠模型，將24 只SD 大鼠隨機分為對照組（C 組）和二次打擊組（HS 組），蛋白免疫印記測定大鼠膈肌組織中E2-14k 及MuRF1 蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示：HS 組分別為（1.65±0.38）、（1.88±0.32），C 組分別為（1.17±0.25）、（1.21±0.24），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.01）。Rt-PCR分析大鼠膈肌組織中泛素及蛋白酶體C2 亞基的mRNA 表達(dá)顯示，HS 組分別為（0.81±0.28）、（0.50±0.25），C 組分別為（0.89±0.20）、（0.50±0.15），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。得出結(jié)論二次打擊大鼠膈肌組織內(nèi)UPP 被激活，導(dǎo)致膈肌收縮蛋白降解增加，肌力降低，肺損傷加重，增加呼吸衰竭發(fā)生概率。

Fang 等[53]研究發(fā)現(xiàn)早期胰島素強化治療可使糖尿病腎病大鼠模型中p38MARK 活化水平減輕、MKP-1 蛋白表達(dá)水平下調(diào)。MKP-1 作為一種不穩(wěn)定蛋白，降解通過UPP 進行調(diào)節(jié)，泛素蛋白酶體可增加或減少MKP-1 蛋白水平，使MAPK 通路脫磷酸化減少，導(dǎo)致該通路出現(xiàn)持續(xù)活化狀態(tài)[54]，在糖尿病腎病的發(fā)病過程中起關(guān)鍵作用。

有研究發(fā)現(xiàn)特異性泛素蛋白酶22（USP22）mRNA和蛋白在初診急性白血病患者中有表達(dá)，且較陰性對照組表達(dá)偏高，其中高白細(xì)胞患者USP22 基因表達(dá)水平較非高白細(xì)胞患者高，推測USP22 基因表達(dá)水平可能與白細(xì)胞數(shù)目有關(guān)，可作為判斷急性白血病患者預(yù)后標(biāo)志基因之一[55]。

轉(zhuǎn)錄因子PPARγ 可通過激活其下游靶基因，決定脂肪生成和細(xì)胞分化，另外也參與調(diào)節(jié)能量平衡及脂質(zhì)生物合成[56]。實驗發(fā)現(xiàn)抑制UPP 會降低細(xì)胞可溶性組分中PPARγ 的含量，而增加非可溶性組分中PPARγ 含量[57]，提示UPP 可通過調(diào)節(jié)PPARγ 水平而影響脂肪細(xì)胞的分化。

3 小結(jié)

泛素蛋白酶體系統(tǒng)自發(fā)現(xiàn)以來，一直是研究熱點，本文就UPP 對神經(jīng)退行性變、腫瘤、病毒免疫、心腦血管疾病等方面進行闡述，但該體系結(jié)構(gòu)復(fù)雜，參與細(xì)胞內(nèi)超過80%蛋白降解，所涉疾病、信號通路、基因等較龐大，且對其研究仍遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，對其仍知之甚少。未來著重要研究UPP 各成員組成及具體功能，明晰作用機理，探索相關(guān)分子靶向藥物，為疾病治療提供新的研究方向。