針刺調(diào)控腦缺血再灌注損傷后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激機制的研究進展*

孫曉偉，王新宇，孫忠人，劉 昊，王 博,張 菶，劉 丹，劉 勇，陳英華，金 弘，李洪濤△

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040；3.浙江省中醫(yī)藥研究院 浙江省立同德醫(yī)院，浙江 杭州 310012)

腦缺血再灌注損傷(Cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI)[1]指腦組織在血供中斷的情況下，經(jīng)溶栓等治療手段及時恢復(fù)再灌注后，其組織損傷和功能障礙反而加重，甚至導(dǎo)致不可逆性的損傷。一般根據(jù)損傷區(qū)殘存的血流量將其分為中心梗死區(qū)和半暗帶區(qū)，中心區(qū)的神經(jīng)細胞死亡形式主要以細胞壞死為主，而半暗帶區(qū)的神經(jīng)細胞死亡多表現(xiàn)為細胞凋亡和自噬性死亡。因半暗帶區(qū)的神經(jīng)細胞仍存在一定的代謝活力，故拮抗該區(qū)神經(jīng)細胞的凋亡以及自噬性死亡是減輕腦缺血再灌注損傷的病理關(guān)鍵。而目前越來越多的研究表明[2-4]，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激常常誘導(dǎo)CIRI后半暗帶區(qū)的神經(jīng)細胞凋亡和自噬性死亡，是腦缺血再灌注引起神經(jīng)損傷的重要環(huán)節(jié)，因此，調(diào)控腦缺血再灌注后神經(jīng)細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，有望成為防治CIRI的新策略。

中醫(yī)學(xué)的針刺療法治療缺血性腦卒中歷史悠久，現(xiàn)以其穩(wěn)定的療效、治療的整體性、治療靶點的多樣化以及毒副作用小和成本低等優(yōu)勢，得到了國內(nèi)外醫(yī)學(xué)界的廣泛認可，其治療的作用機理也得到逐步的闡釋。有研究表明[5]，針刺對CIRI后誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)及細胞自噬均有良性的調(diào)節(jié)作用。本研究搜集國內(nèi)外近10年來關(guān)于針刺對CIRI誘導(dǎo)ERS的影響的文獻進行綜述，以期為臨床應(yīng)用針刺防治缺血性卒中提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激概述

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是負責(zé)生物合成和信號傳遞的精密細胞器，對維護內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定及決定細胞生存具有重要意義。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對內(nèi)外環(huán)境的變化如缺血缺氧、毒素、能量供應(yīng)障礙等具有非常高的敏感特性，當(dāng)受到諸如此類的壓力刺激時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)破壞，功能失衡，蛋白質(zhì)折疊受阻，大量未折疊或錯誤折疊的蛋白質(zhì)蓄積其中，誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(Endoplasmic reticulum stress，ERS)[6]，并進一步激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)或未折疊蛋白反應(yīng)(Unfold protein response, UPR)。適度的UPR可通過增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)性蛋白降解途徑(ERAD)，促進內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對堆積在網(wǎng)腔內(nèi)的錯誤折疊或未折疊蛋白質(zhì)的處理，以維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)平衡，保障細胞存活。而持久劇烈的UPR會進一步激活細胞的程序性死亡途徑，誘發(fā)細胞自噬和細胞凋亡。

2 腦缺血再灌注損傷誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

腦缺血再灌注期間組織內(nèi)無氧代謝增強，ATP釋放水平迅速降低，無法維持神經(jīng)元能量的供應(yīng)，導(dǎo)致ATP依賴的離子轉(zhuǎn)運機制失調(diào)，Ca2+不能正常的跨膜運轉(zhuǎn)，加之內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)鈣離子的進一步釋放，引發(fā)Ca2+超載，破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)通道及其功能，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)二硫鍵形成減少，蛋白質(zhì)折疊出現(xiàn)錯誤，誘發(fā)ERS[7]。而過度的ERS又進一步加重細胞內(nèi)鈣平衡的紊亂，二者在CIRI損傷的病理過程中互相促進、互為因果。同時腦組織缺血再灌注后，白細胞在缺血組織中大量浸潤，清除壞死組織細胞產(chǎn)生的大量活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)，而ROS是誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的又一條件，通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑引起細胞自噬與凋亡[8]。因此，通過抑制過強的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)負荷、促進內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能恢復(fù)，進而減弱神經(jīng)細胞自噬和凋亡是減輕CIRI的重要機制之一。

3 針刺調(diào)控CIRI后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的研究概況

目前大量的實驗研究表明[5-9]，針刺對大鼠腦缺血再灌注后誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)以及過度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后引發(fā)的神經(jīng)細胞自噬和神經(jīng)細胞凋亡均有一定的影響。

3.1 針刺對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)的促細胞生存通路具有調(diào)節(jié)作用

UPR發(fā)揮調(diào)控作用涉及到諸多酶和轉(zhuǎn)錄因子，目前研究較多的有3種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜受體[10]：蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(Protein kinase R-like ER kinase，PERK) 、抑制物阻抗性激酶1(Inositol requiring enzyme 1，IRE-1) 和活性轉(zhuǎn)錄因子6( Activating transcription factor 6，ATF6) 。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(Glucose-regulated protein78/Binding immuno-globulin protein，GRP78/Bip)是一種鈣離子結(jié)合分子伴侶，主要位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，對維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)和細胞正?；钚跃哂兄匾饔?。正常生理狀況下，GRP78與PERK、IRE-1、ATF6這三種跨膜受體緊密結(jié)合，處于無活性狀態(tài)。當(dāng)ERS發(fā)生時，GRP78分別與之解離，轉(zhuǎn)而與未折疊或錯誤折疊蛋白結(jié)合，減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力。游離的PERK及IRE1通過自身磷酸化和二聚化被激活，ATF6經(jīng)蛋白酶S1P和S2P在高爾基體內(nèi)剪切后被激活，隨后分別激活各自的下游信號通路進行調(diào)控。

目前，多數(shù)學(xué)者將GRP78蛋白的上調(diào)，作為ERS啟動的標(biāo)志因子[11]。腦缺血時，由于缺血缺氧等壓力刺激導(dǎo)致ER內(nèi)環(huán)境發(fā)生改變，蛋白質(zhì)折疊受到干擾，出現(xiàn)錯誤折疊蛋白及未折疊蛋白的蓄積，隨即誘導(dǎo)GRP78表達上調(diào)，進而與異常折疊蛋白進行有機結(jié)合，減少了錯誤折疊蛋白的數(shù)量，緩解了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的壓力負荷，發(fā)揮了促細胞存活的作用[12]。較多研究顯示[13-14]，在ERS狀態(tài)下，針刺可通過上調(diào)GRP78蛋白的表達，減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中異常折疊蛋白數(shù)量，從而發(fā)揮其神經(jīng)細胞的保護作用。陳懷龍等[15]對腦缺血再灌注損傷的大鼠采用針刺大椎、百會穴預(yù)處理后，檢測到GRP78的表達進一步上調(diào)，通過光鏡下觀察到缺血再灌注大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元異常形態(tài)數(shù)量的降低，提示上調(diào)GRP78的表達、抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能是電針預(yù)處理腦保護作用的重要機制之一。J Shen等[16]同樣發(fā)現(xiàn)電針內(nèi)關(guān)、百會穴可以通過激活ERS、上調(diào)GRP78的表達，保護腦缺血再灌注損傷大鼠的缺血半暗帶區(qū)的神經(jīng)細胞。

3.2 針刺對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與介導(dǎo)的細胞凋亡有抑制作用

在ERS中細胞凋亡程序的啟動與C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶12( Caspase-12)及c-Jun 氨基末端激酶(C-Jun N-terminal kinase，JNK) 信號通路有關(guān)[17]。CHOP是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘發(fā)凋亡的標(biāo)志性基因[18]。PERK、ATF6以及IRE-1都能誘導(dǎo)CHOP的轉(zhuǎn)錄[19]。其中PERK-eIF2α-ATF4是CHOP蛋白表達主要途徑。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激持續(xù)劇烈存在時PERK進一步被激活，促進ATF4翻譯，誘導(dǎo)CHOP表達，破壞GRP78的保護作用而誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡。Caspase-12是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中促進凋亡的第2條信號通路，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)細胞凋亡的固有蛋白，能夠單獨通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的凋亡途徑誘導(dǎo)細胞凋亡。ERS未發(fā)生時，Caspase-12與Caspase-7和GRP78結(jié)合形成復(fù)合物，凋亡途徑未被激活；ERS發(fā)生時，GRP78表達降低，Caspase-12不能與其充分結(jié)合，則Caspase-12被激活，進而促進細胞質(zhì)中的Caspase-9被激活，通過Caspase的級聯(lián)反應(yīng)，將激活信號傳遞給Caspase-3，最終引起細胞凋亡。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中活化的JNK信號通路在應(yīng)激反應(yīng)和細胞死亡過程中扮演著重要角色，被認為是除CHOP與Caspase-12之外的另一條促凋亡通路[20]?；罨腎RE1和腫瘤壞死因子受體-相關(guān)因子2(Tumor necrosis factor receptor-associated factor 2，TRAF2)結(jié)合，激活凋亡信號調(diào)節(jié)酶1(Apoptosis signal-regulating kinase-1，ASK1)，最終激活JNK通路，活化Caspase-12引起細胞凋亡[21]。張亞敏[22]采用電針百會、足三里穴對腦缺血再灌注損傷大鼠模型進行干預(yù)，證實電針可通過上調(diào)抑制凋亡基因Bcl-2的釋放，下調(diào)CHOP、Caspase12 mRNA及凋亡基因Bax的表達，改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，為臨床針灸應(yīng)用于缺血性腦血管病治療提供了實驗依據(jù)。宋洋[23]對MCAO大鼠局灶性腦缺血模型電針百會、內(nèi)關(guān)穴治療后發(fā)現(xiàn)大鼠神經(jīng)功能障礙有所改善，行為學(xué)評分呈降低趨勢。結(jié)果證明針刺可通過下調(diào)大鼠腦缺血再灌注后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路PERK、eIF2α、ATF4基因表達，抑制神經(jīng)細胞凋亡，繼而減輕腦缺血再灌注損傷，其作用與依達拉奉相當(dāng)。李文慧[24]通過手術(shù)制造腦缺血再灌注損傷大鼠模型，發(fā)現(xiàn)手術(shù)造模組大鼠CHOPmRNA表達明顯升高，說明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能出現(xiàn)異常。在百會、內(nèi)關(guān)穴進行針刺干預(yù)后，CHOPmRNA表達顯著降低，最終表現(xiàn)為神經(jīng)功能缺損評分顯著下降，腦梗死體積百分比有所減小。其他研究學(xué)者[25-27]發(fā)現(xiàn),針刺可有效抑制腦缺血神經(jīng)元細胞凋亡，其機制可能與上調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激保護性GRP78表達及抑制促凋亡Caspase-12表達有關(guān)。

3.3 針刺對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細胞自噬具有良性的調(diào)節(jié)作用

ERS誘導(dǎo)的細胞死亡除細胞凋亡之外，還包括另一種程序性細胞死亡方式，即自噬性細胞死亡(autophagic cell death, ACD)。在腦缺血損傷中，自噬具有雙面性[28]，自噬早期能有效清除細胞內(nèi)受損的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，消除UPR和降解蛋白聚集體，有助于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白的正確折疊，維持細胞內(nèi)環(huán)境平衡[29]。而過度的自噬可引起自噬性細胞死亡，加重神經(jīng)細胞損傷[30]。Beclin1和LC3在哺乳動物細胞自噬過程中起著關(guān)鍵的作用。Beclin1 主要通過與Ⅲ型磷脂酰肌醇3-激酶形成復(fù)合物參與自噬體的形成，其可介導(dǎo)其他自噬蛋白定位于自噬泡，從而調(diào)控自噬體的形成與成熟[31]，是自噬啟動的標(biāo)志[32]。ERS可通過PERK-eIF2α-ATF4通路激活自噬相關(guān)基因12(Atg12)，使微管相關(guān)蛋白輕鏈3-I(LC3-I)轉(zhuǎn)化為LC3-II，誘發(fā)細胞自噬[33]。其中LC3-Ⅱ被看作是監(jiān)測自噬活性的特異性標(biāo)志物[34]，因此細胞內(nèi)LC3-Ⅱ的表達變化可作為檢測自噬狀態(tài)的參考因子，Beclin1和 LC3-Ⅱ的大量表達可促進自噬發(fā)生[35]。有報道[36-38]認為,自噬可能是針刺減輕神經(jīng)損傷、改善神經(jīng)功能的機制之一。徐勤紅等[39]采用“調(diào)神通督針法”治療急性腦梗死療效肯定，分析其作用機制可能是通過增加自噬量LC3-Ⅱ和Beclin1發(fā)揮了神經(jīng)保護作用。舒適[5]通過實驗證實，電針?biāo)疁涎▽δX缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)具有明確療效，其機制從上調(diào)ERS促生存細胞途徑、減弱CHOP的表達以及抑制自噬表達水平共同發(fā)揮作用。馮曉東等[40]在腦缺血再灌注模型大鼠給予電針刺激后監(jiān)測到腦組織中的Beclin-1表達上調(diào)，提出電針可通過提高自噬系統(tǒng)的表達水平而促進腦缺血再灌注損傷后大鼠的認知功能的恢復(fù)。

4 小結(jié)

綜上所述，ERS在CIRI損傷的病理進程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，一方面可激活UPR，促進內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對錯誤折疊或未折疊蛋白的處理，保護神經(jīng)細胞；另一方面又與CIRI后神經(jīng)細胞的自噬、凋亡等現(xiàn)象密切相關(guān)。因此，對CIRI后神經(jīng)細胞ERS及其調(diào)節(jié)機制展開研究，具有重要的理論價值和現(xiàn)實意義。針刺對CIRI后ERS及其誘導(dǎo)的神經(jīng)細胞自噬、細胞凋亡的研究尚處于起步階段，許多研究僅是針對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的促生存蛋白分子和ERS導(dǎo)致凋亡或自噬的某單一通路展開研究，且缺乏特異性的抑制劑、慢病毒干擾以及相關(guān)基因敲除等現(xiàn)代科技手段作對照，同時大多研究也忽略了假針刺及非穴位組的設(shè)立，在實驗設(shè)計上尚缺乏嚴謹性與科學(xué)性。但相信隨著現(xiàn)代科研技術(shù)手段的不斷進步，隨著針刺調(diào)控CIRI后ERS、細胞自噬與凋亡的嚴謹規(guī)范和更加細微深入的研究，針刺對CIRI后ERS、自噬與凋亡的調(diào)控機制會更加科學(xué)化、明確化，從而為缺血性腦卒中及腦缺血再灌注損傷的防治取得突破性的進展奠定堅實的基礎(chǔ)。